本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种检测牛奶中抗生素含量的方法。
背景技术：
抗生素不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。但是在临床使用中已经显现了许多副作用。抗生素的毒副反应最严重的是过敏反应。研究表明，每种抗生素对人体均有不同程度的伤害。比如链霉素、卡那霉素可引起眩晕、耳鸣、耳聋;庆大霉素、卡那霉素、万古霉素可损害肾脏等等。而耳朵对抗生素的副作用最为敏感，比如链霉素、庆大霉素、卡那霉素最易影响耳朵毛细胞，而使听力下降。抗生素用得太多，也会让杀灭的细菌产生耐药性。而且，细菌的这种耐药性也是可以相互传播的，细菌对某种抗生素耐药，同时亦可对其他抗生素耐药，而且耐药性还可以在不同的细菌、人体正常菌群的细菌与致病菌之间，通过耐药基因相互传播，使细菌耐药性复杂化。抗生素用得过多过滥，会大量杀灭体内正常细菌，让致病菌乘虚而入，可以造成人的死亡。比如说人体肠道细菌，按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，长期应用广谱抗生素，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌乘机繁殖，从而引起菌群失调，可以引起一些维生素的缺乏，使身体抵抗力下降。人体内的细菌主要存在肠道里。有的细菌是帮助消化的，有的则是寄生菌，它们存在于皮肤里、口咽部里、耳朵眼，这些与外界通着的地方，它们不是致病菌，但在一定的条件下，这些寄生菌会变为致病菌。当体内菌群失调，一旦有身体某部位感染，就极易恶化，甚至是可以死人的。
在奶牛的饲养中抗生素药物的使用非常普遍，在奶牛饲养中不合理的使用药物，会导致牛奶中的药物残留。因此研究牛奶中抗生素的残留的快速、简便的检测方法是十分必要的。目前，牛奶中抗生素的检测方法时间较长，检测成本较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种检测牛奶中抗生素含量的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测牛奶中抗生素含量的方法，包括以下步骤：
1）称取3±0.02ml待测牛奶于50ml离心管中，用1％磷酸盐缓冲液20ml稀释，漩涡混匀，于75-85℃水浴加热3-8min，冷却后离心10-20min，移取上清液于10ml离心管中；残渣用4ml1％磷酸盐缓冲液重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；
2）氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用乙腈溶液定容至5ml，混匀，过滤，制得待测样品；
3）液相色谱-串联质谱检测
色谱条件：高效液相色谱柱：hypersilgoldenc18色谱柱，150mm×2.1mm，5μm；流速：0.2ml/min；
质谱条件：采用电喷雾离子源测定，在多反应监测模式下，用正、负离子模式同时进行扫描，喷雾电压为4000-6000v；鞘气压力30-40arb；a辅助气压力3-6arb；毛细管温度340-360℃；
建立空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库；将待测样品通过检测后与空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库进行比对，得到待测牛奶中抗生素含量。
作为本发明进一步的方案：步骤1）中，离心转速为5000r/min。
作为本发明进一步的方案：步骤2）中，50％乙腈溶液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为1:1。
作为本发明进一步的方案：步骤2）中，过滤采用0.22μm微孔尼龙滤膜。
作为本发明进一步的方案：步骤3）中，采用的流动相为：a：乙腈，b：0.1％浓度的甲酸水-5mmol/l的甲酸胺溶液，采用梯度洗脱。
作为本发明进一步的方案：步骤3）中，喷雾电压为5000v；鞘气压力35arb；a辅助气压力5arb；毛细管温度350℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的牛奶样品中抗生素残留检测方法，样品处理极为简单方便、对操作人员无技术要求，灵敏度高、准确度好，检测速度快，成本低，适用于日常牛奶样品中多种抗生素药物残留监控。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种检测牛奶中抗生素含量的方法，包括以下步骤：
1）称取3±0.02ml待测牛奶于50ml离心管中，用1％磷酸盐缓冲液20ml稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后离心15min，离心转速为5000r/min。移取上清液于10ml离心管中；残渣用4ml1％磷酸盐缓冲液重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；离心转速为5000r/min。
2）氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用乙腈溶液定容至5ml，混匀，采用0.22μm微孔尼龙滤膜过滤，制得待测样品；50％乙腈溶液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为1:1。
3）液相色谱-串联质谱检测
色谱条件：高效液相色谱柱：hypersilgoldenc18色谱柱，150mm×2.1mm，5μm；流速：0.2ml/min；采用的流动相为：a：乙腈，b：0.1％浓度的甲酸水-5mmol/l的甲酸胺溶液，采用梯度洗脱。
质谱条件：采用电喷雾离子源测定，在多反应监测模式下，用正、负离子模式同时进行扫描，喷雾电压为5000v；鞘气压力35arb；a辅助气压力5arb；毛细管温度350℃；
建立空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库；将待测样品通过检测后与空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库进行比对，得到待测牛奶中抗生素含量。准确量取适量抗生素标准工作液，用空白样品基质溶液作为标准溶液的稀释液，配制成混合标准工作液，依次进行测定，以得到的峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制空白牛奶标准曲线。基质标准曲线线性范围为1.0μg/l～500μg/l，线性相关系数大于0.99。
实施例2
本发明实施例中，一种检测牛奶中抗生素含量的方法，包括以下步骤：
1）称取3±0.02ml待测牛奶于50ml离心管中，用1％磷酸盐缓冲液20ml稀释，漩涡混匀，于75℃水浴加热3min，冷却后离心10min，离心转速为5000r/min。移取上清液于10ml离心管中；残渣用4ml1％磷酸盐缓冲液重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；离心转速为5000r/min。
2）氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用乙腈溶液定容至5ml，混匀，采用0.22μm微孔尼龙滤膜过滤，制得待测样品；50％乙腈溶液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为1:1。
3）液相色谱-串联质谱检测
色谱条件：高效液相色谱柱：hypersilgoldenc18色谱柱，150mm×2.1mm，5μm；流速：0.2ml/min；采用的流动相为：a：乙腈，b：0.1％浓度的甲酸水-5mmol/l的甲酸胺溶液，采用梯度洗脱。
质谱条件：采用电喷雾离子源测定，在多反应监测模式下，用正、负离子模式同时进行扫描，喷雾电压为4000v；鞘气压力30arb；a辅助气压力3arb；毛细管温度340℃。
建立空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库；将待测样品通过检测后与空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库进行比对，得到待测牛奶中抗生素含量。准确量取适量抗生素标准工作液，用空白样品基质溶液作为标准溶液的稀释液，配制成混合标准工作液，依次进行测定，以得到的峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制空白牛奶标准曲线。基质标准曲线线性范围为1.0μg/l～500μg/l，线性相关系数大于0.96。
实施例3
本发明实施例中，一种检测牛奶中抗生素含量的方法，包括以下步骤：
1）称取3±0.02ml待测牛奶于50ml离心管中，用1％磷酸盐缓冲液20ml稀释，漩涡混匀，于85℃水浴加热8min，冷却后离心10-20min，离心转速为5000r/min。移取上清液于10ml离心管中；残渣用4ml1％磷酸盐缓冲液重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；离心转速为5000r/min。
2）氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用乙腈溶液定容至5ml，混匀，采用0.22μm微孔尼龙滤膜过滤，制得待测样品；50％乙腈溶液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为1:1。
3）液相色谱-串联质谱检测
色谱条件：高效液相色谱柱：hypersilgoldenc18色谱柱，150mm×2.1mm，5μm；流速：0.2ml/min；采用的流动相为：a：乙腈，b：0.1％浓度的甲酸水-5mmol/l的甲酸胺溶液，采用梯度洗脱。
质谱条件：采用电喷雾离子源测定，在多反应监测模式下，用正、负离子模式同时进行扫描，喷雾电压为6000v；鞘气压力40arb；a辅助气压力6arb；毛细管温度360℃。
建立空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库；将待测样品通过检测后与空白牛奶标准谱图库与含有抗生素的牛奶标准谱图库进行比对，得到待测牛奶中抗生素含量。准确量取适量抗生素标准工作液，用空白样品基质溶液作为标准溶液的稀释液，配制成混合标准工作液，依次进行测定，以得到的峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制空白牛奶标准曲线。基质标准曲线线性范围为1.0μg/l～500μg/l，线性相关系数大于0.97。本发明对5份不同厂家的牛奶进行了分析，分析结果表明，该方法能有效地对其中的抗生素进行全检测，具有很好的重现性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。