本发明涉及人参中人参皂苷的检测领域，尤其是一种测定人参中多种人参皂苷的方法。
背景技术：
：人参是我国地道药材中应用最广泛的代表，人参皂苷是人参的主要药效成分，人参皂苷具有增强记忆力，提高免疫力，改善心血管，调节内分泌，延缓衰老和抗肿瘤等功能，人参皂苷的含量测定已经成为国内外研究的热点。随着社会的发展，对于药品质量控制的要求也越来越高，但由于人参化学成分复杂，人参皂苷种类多样，现已确定并分离的人参皂苷化合物单体有50余种，根据苷元的不同，人参皂苷被分为原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷及齐墩果酸类皂苷。因此建立同时、多种、快捷、方便、可靠的人参皂苷检测方法对人参及其制剂的质量控制具有重要意义。技术实现要素：针对上述不足，本发明旨在提供一种可同时测定多种人参皂苷单体、线性范围广、方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠的ASE-HPLC法测定人参中人参皂苷的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种测定人参中多种人参皂苷的方法，依次包括下述步骤：步骤1：采用ASE萃取方法萃取粉碎过的人参样品；其中，ASE萃取方法包括先在索氏提取器中采用三氯甲烷萃取，然后在快速溶剂萃取仪中用乙醇萃取，收集乙醇萃取液；步骤2：采用HPLC法检测乙醇萃取液中的人参皂苷的含量。进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：步骤S1：将样品粉碎，过四号筛，取过筛后的粉末1g；步骤S2：装于索氏提取器中，加入三氯甲烷，加热回流4小时，三氯甲烷萃取液舍弃；步骤S3：将1g硅藻土和药渣混合，移入放有纤维滤膜的ASE10ml萃取池中，加硅藻土至与池口平行；步骤S4：放入快速萃取仪中进行萃取，萃取溶剂为乙醇；步骤S5：将萃取液蒸干，残渣加乙醇溶解，并加乙醇定容至10ml，取1ml加至装有100mgPSA的2ml离心管中，离心，滤过，即得乙醇萃取液。进一步的，所述的步骤S4中，萃取参数为：萃取温度为110℃，萃取时间为10min，萃取次数为1次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。进一步的，所述的ASE萃取方法采用美国DIONEX公司的ASE350快速溶剂萃取仪。进一步的，所述的步骤2中，HPLC法的检测参数为：色谱柱：ThermoSyncronisDim.AQ；柱温：50℃；流速：0.3mL/min；流动相：乙腈-水；检测波长：203nm。进一步的，所述的流动相：乙腈-水的体积比为18～32：68～82；第0分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82；第10分钟，流动相中乙腈-水的体积比为20：80；第18分钟，流动相中乙腈-水的体积比为30：70；第24分钟，流动相中乙腈-水的体积比为32：68；第25-28分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82。进一步的，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm；所述的HPLC检测方法所采用ThermoU3000UHPLC液相色谱仪。本发明与传统方法相比，具有以下优点：1.本发明提供一种同时测定3种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的3种人参皂苷单体为Rg1、Re、Rb1，提高了效率；2.本发明只用乙腈和水作流动相，解决了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题，流动相配制方便，简便了操作；3.本发明所测定的结果表明，3种人参皂苷单体在0.5～3.0μl范围内均呈良好的线性关系、线性范围广，方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠。4.本发明能更好地分析人参皂苷单体的含量，为人参及其制剂的质量控制提供理论依据。附图说明图1为人参皂苷Rg1以浓度(mg)-峰面积进行的线性回归图；图2为人参皂苷Re以浓度(mg)-峰面积进行的线性回归图；图3为人参皂苷Rb1以浓度(mg)-峰面积进行的线性回归图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。1.仪器设备及试剂1.1仪器：电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、ThermoU3000UHPLC液相色谱。2.2试剂：试剂与溶液(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)水：符合GB/T6682规定的一级水。乙腈(C2H3N)：色谱纯(液相色谱用)。2.方法2.1对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。2.2供试品溶液的制备2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50KHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加乙醇溶解并转移至5ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.2快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法：步骤S1：将样品粉碎，过四号筛，取过筛后的粉末1g。步骤S2：装于索氏提取器中，加入三氯甲烷，加热回流4小时，三氯甲烷萃取液舍弃。步骤S3：将1g硅藻土和药渣混合，移入放有纤维滤膜的ASE10ml萃取池中，加硅藻土至与池口平行。步骤S4：放入快速萃取仪中进行萃取，萃取溶剂为乙醇；萃取参数为：萃取温度为110℃，萃取时间为10min，萃取次数为1次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s；采用美国DIONEX公司的ASE350快速溶剂萃取仪。步骤S5：将萃取液蒸干，残渣加乙醇溶解，并加乙醇定容至10ml，取1ml加至装有100mgPSA的2ml离心管中，离心，滤过，即得乙醇萃取液；步骤S6：采用HPLC法检测乙醇萃取液中的人参皂苷的含量；检测参数为：色谱柱：ThermoSyncronisDim.AQ，1.7μm，50×2.1mm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：50℃；流速：0.3mL/min；检测波长：203nm；流动相：体积比为18～32：68～82的乙腈-水，采取如下所示的梯度洗脱：第0分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82；第10分钟，流动相中乙腈-水的体积比为20：80；第18分钟，流动相中乙腈-水的体积比为30：70；第24分钟，流动相中乙腈-水的体积比为32：68；第25-28分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82。HPLC检测方法所采用ThermoU3000UHPLC液相色谱仪。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。2.3测定法照高效液相色谱法(通则0512)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。2.4标准限值要求本品按干燥品计算，含人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.03％，人参皂苷Rb1(C54H92O23)不得少于0.20％。2.5计算(外标法)式中CR—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/L)；AX—供试品的峰面积；AR—对照品峰面积。注意：1.使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；2.萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；3.萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；4.开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa；5.使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。3结果3.1线性关系取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，精密称定，加乙醇制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得，然后分别精密吸取该溶液0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、3.0μl进入LC测定，并依照上述方法测定。人参皂苷Rg1的线性试验结果见表1，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图1；人参皂苷Re的线性试验结果见表1，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图1；人参皂苷Rb1的线性试验结果见表1，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图1；均呈良好的线性关系。表1表2浓度(mg)第一针峰面积第二针峰面积平均峰面积0.101389.863691.199190.53140.2026185.5257181.4935183.50960.3039282.7353281.9074282.32140.4052369.5435378.2917373.91760.6078574.6941568.6457571.6699表3浓度(mg)第一针峰面积第二针峰面积平均峰面积0.086849.030348.671448.85090.173596.817396.518196.66770.2603148.6210146.6620147.64150.3470200.9043204.7011202.80270.5205320.7283317.2293318.97883.2精密度试验取人参皂苷Rg1(浓度：0.1822mg/ml)、人参皂苷Re(浓度：0.2026mg/ml)及人参皂苷Rb1(浓度：0.1735mg/ml)对照品混合溶液，连续进样6次，记录峰面积，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为0.5％，1.1％，0.5％表明仪器精密度良好。3.3重复性试验取相同批号的样品1g，共3份，精密称定，按4.2.2ASE提取方法提取供试品溶液，进样量为1μL，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中人参皂苷的含量见表4，Rg1、Re、和Rb1的RSD分别为1.3％、0.9％和2.7％，试验表明ASE提取方法重复性良好。表4Rg1含量(％)Re含量(％)Rb1含量(％)重复性10.2940.2380.482重复性20.2950.2390.485重复性30.2880.2350.506平均含量(％)0.2920.2370.491RSD(％)1.30.92.73.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(1批)样品使用不同仪器提取的结果见表5，使用ASE法提取的样品含量与使用药典方法提取的样品含量的结果比较见表6。表5表64讨论：4.1ASE提取溶剂的选择：试验中曾对乙醇、正己烷饱和的乙醇、50％乙醇等提取溶剂进行考察，结果显示采用正己烷饱和的乙醇提取样品杂质最少，但人参皂苷含量偏低，而采用50％乙醇和乙醇提取人参皂苷含量与使用药典方法提取的含量较一致，但50％乙醇提取后杂质峰比使用乙醇高很多，故采用操作简单的、成本低的乙醇作为提取溶剂。4.2ASE净化步骤的选择：实验中曾对净化条件进行考察，包括在萃取池底部加入适量的中性氧化铝和硅胶作为净化剂，结果发现在萃取池中添加净化剂提取出的杂质与未添加无明显差别，实验中还考察了在提取完样品后，使用提取液添加适量的C18、PSA、GCB进行净化再上机，结果发现PSA和C18净化对样品的含量基本无影响而GCB会对皂苷有吸附，而PSA净化效果最好，故采用PSA进行净化。4.3ASE提取条件的优化我们采用3因素3水平正交实验方案L9(33)安排实验，考察了萃取温度、静态萃取时间、循环次数，3个因素对加速溶剂萃取人参中人参皂苷的影响(见表7)。确定从人参中提取人参皂苷的最佳快速溶剂萃取工艺，结果见表8。表7表8由极差分析可以看出，提取温度对人参皂苷的含量影响最大，其次是静态萃取时间和提取次数。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度120℃，提取时间8min，提取次数3次。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3