本发明涉及一种快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的方法，具体涉及一种利用DART-MS法(实时直接分析-质谱法)快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的方法。
(二)
背景技术：
3-羟基-3-甲基戊二酸尿症于1976年由Faul等首次报道，该病的临床表现为低血糖、代谢性酸中毒，以及尿液中可检出3-羟基-3-甲基戊二酸，由于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A lyase，HMGCL)基因突变引起HMGCL活性缺陷，导致3-羟基-3-甲基戊二酸在体内蓄积。该病严重影响亮氨酸在体内的正常代谢，以及酮体的生成过程。酮体包括乙酰乙酸、3-羟基丁酸等，是机体发生低血糖时脑、心脏、肝脏等重要脏器的能量来源。3-羟基-3-甲基戊二酸尿症是因酮体代谢障碍导致不同程度的脑、心脏、肝脏等脏器损害。患者通常在新生儿期至婴幼儿期发病，国外报道死亡率达20％。但3-羟基-3-甲基戊二酸尿症同时也属于少数可以治疗的遗传病之一，如果确诊及时，患儿可以通过补充左旋肉碱来促进毒性有机酸代谢产物排出，以达到治疗的效果。文献报道的健康人3-羟基-3-甲基戊二酸水平约为0-9mg/L，即可以认为尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸浓度低于9mg/L为阴性。
目前针对3-羟基-3-甲基戊二酸的检测最通用的方法是离线衍生化-气相色谱-质谱/质谱法，但这个方法存在前处理复杂，检测耗时长等缺点，该方法是医院现行的通用方法，国内外文献报道多为探究病理病因以及相关临床表现诊断，在方法学的开发上较少。而本发明中用的DART-MS法无需冗长的色谱分离，其分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间。
实时直接分析技术(Direct Analysis in Real Time，DART)是一种新型的敞开式非表面接触型解析/离子化分析技术，于2002年被美国军方首次应用于化学战剂的测试，并于2005年首次进行文献报道，同年申请专利且商品化的DART面世。该方法将样品放置于DART离子源气体出口和质谱的采样锥口间，在大气压下，气体(如氮气、氦气或氩气)经放电产生的激发态原子瞬间解析并离子化样品表面的化合物分子，直接进入质谱分析。样品可以是气态、液态、固态，或任何几何形状，无需耗时的前处理和冗长的色谱分离，并实现定性定量，在样品的高通量筛选和检测方面正发挥越来越大的优势。
(三)
技术实现要素：
本发明提供了一种利用DART-MS法快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸含量的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用DART-MS法快速测定尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸含量的方法，所述方法为：
(1)绘制标准曲线
称取3-羟基-3-甲基戊二酸标准品，用超纯水配制成浓度范围在0.05～5mg/L梯度浓度的标准溶液，将所得标准溶液进行前处理，之后进样进行DART-MS法测定，得到标准溶液质谱图，以3-羟基-3甲基戊二酸m/z 161的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，进而计算得到标准曲线方程；
所述标准溶液的前处理方法为：将所述标准溶液与乙腈等体积混匀，离心(3000rpm，10min)，弃去沉淀，用浓盐酸(36～38wt％)调节pH至1.0，加入乙酸乙酯(乙酸乙酯用量为标准溶液体积的3倍)混匀，离心(3000rpm，5min)，取上清液，残余物质重复进行加入乙酸乙酯混匀、离心、取上清液的操作步骤，重复两次，合并每次所得上清液，氮吹吹干，用甲醇/水(体积比1：1，甲醇/水用量为标准溶液体积的5％)复溶，即完成前处理；
所述DART-MS法的测定条件为：
DART条件：负离子模式采集数据，气体温度为400℃，采用Dip-it进样方式进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，待机气体为高纯氮气；
MS条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-200，sim模式下m/z 161，锥孔电压为15V；
进样采用25μL进样针，进样量2μL；
进一步，所述梯度浓度的标准溶液的配制方法为：称取3-羟基-3-甲基戊二酸标准品，用超纯水配制成100mg/L的溶液，再逐级稀释成5、2.5、1、0.5、0.05mg/L的标准溶液；
(2)试样检测
取尿液试样，进行前处理，之后在步骤(1)DART-MS法的测定条件下，测得试样质谱图，将试样质谱图中3-羟基-3甲基戊二酸m/z 161的特征峰面积代入步骤(1)得到的标准曲线方程中，计算得出尿液试样中3-羟基-3-甲基戊二酸的含量；
所述尿液试样的前处理方法为：将尿液试样用超纯水稀释至原体积的20倍，得到稀释液，将所得稀释液与与乙腈等体积混匀，离心(3000rpm，10min)，弃去沉淀，用浓盐酸(36～38wt％)调节pH至1.0，加入乙酸乙酯(乙酸乙酯用量为稀释液体积的3倍)混匀，离心(3000rpm，5min)，取上清液，残余物质重复进行加入乙酸乙酯混匀、离心、取上清液的操作步骤，重复两次，合并每次所得上清液，氮吹吹干，用甲醇/水(体积比1：1，甲醇/水用量为稀释液体积的5％)复溶，即完成前处理；
与现有技术相比，本发明的优点主要体现在：无需冗长的色谱分离，分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间。本发明的测定方法具有简单、快速、高效的特点。该检测技术可以推广到尿液中小分子有机酸的测定领域，实际应用价值高，意义深远。
(四)附图说明
图1：正离子模式扫描质谱图；
图2：负离子模式扫描质谱图；
图3：尿液直接稀释进样全扫模式质谱图；
图4：阴性样品全扫模式质谱图；
图5：阳性样品全扫模式质谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中用到的仪器为：实时直接分析离子源DART SVP(美国Ion Sense公司)；ACQUITY QDa质谱检测器(美国Waters公司)。
实施例1正负离子模式的选择
精密称定0.001g 3-羟基-3-甲基戊二酸于10mL容量瓶中，用超纯水定容配制成100mg/L的标准溶液。用2mL离心管取1mL的100mg/L的标准液，分别在正离子，负离子模式下进样。由图1-2可以看到在正离子模式下背景干扰较大。因此，选择负离子模式对尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸进行定性定量分析。
实施例2离子化气体温度的选择
气体温度对3-羟基-3-甲基戊二酸离子化效率的影响很重要，温度过低，离子化不完全，过高，可导致3-羟基-3-甲基戊二酸部分受热分解。考察了负离子模式下，温度分别为350℃、400℃、450℃时的离子化效率，发现在400℃时的响应最大。因此，选择400℃作为离子化气体温度。
实施例3方法学的考察
(1)仪器与试剂
DART SVP离子源、Waters QDa质谱仪。
阴性尿液样品为志愿者提供，阳性样品由某医院提供(而且该患者已经确诊为患有3-羟基-3-甲基戊二酸尿症)，均保存于-60℃冰箱备用。
(2)实验方法
标准溶液的测定：取3-羟基-3-甲基戊二酸标准品，精密称定0.001g于10mL容量瓶中，用超纯水定容配制成100mg/L的标准溶液。再逐级稀释配成5、2.5、1、0.5、0.05mg/L的标准储备液。取配好的五个浓度的标准溶液2mL至15mL离心管，加2mL乙腈混匀，3000rpm离心10min，弃去沉淀，加浓盐酸调节pH至1.0。加入6mL乙酸乙酯混匀，3000rpm离心5min，分层，取上清液6mL，残余物质重复进行加入乙酸乙酯混匀、离心、取上清液的操作步骤，重复两次。合并上层萃取液，氮吹吹干，用100μL甲醇/水(1:1)复溶。用石英玻璃管进样，由于复溶后的样品量太少无法蘸取进样，用25μL进样针取2μL样品到进样管上，这样也保证了每次进样量都一致，提高了方法的重现性。测定各峰的面积，以3-羟基-3甲基戊二酸m/z 161的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。计算回归方程为：Y＝22649X-96.87，r＝0.9988。表明3-羟基-3-甲基戊二酸在0.05-5mg/L范围内与峰面积线性关系良好。
样品的测定：分别取3个阴性样品100μL至15mL离心管，分别用超纯水稀释到2mL，加2mL乙腈混匀，3000rpm离心10min，弃去沉淀，加浓盐酸调节pH至1.0。加入6mL乙酸乙酯混匀，3000rpm离心5min，分层，取上清液6mL，残余物质重复进行加入乙酸乙酯混匀、离心、取上清液的操作步骤，重复两次。合并上层萃取液，氮吹吹干，用100μL甲醇/水(1:1)复溶。用石英玻璃管进样，由于复溶后的样品量太少无法蘸取进样，用25μL进样针取2μL样品到进样管上，这样也保证了每次进样量都一致，提高了方法的重现性。待溶液挥干，待气体温度达到合适的温度，让DART开始运行，待信号稳定后开始移动载样器。
DART条件：负离子模式采集数据，气体温度为400℃，采用Dip-it进样管进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，流速为3L/min，待机气体为高纯氮气。栅极电压为-200V，离子源出口距质谱进口约2.4cm。
Waters QDa质谱条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-200，sim模式下m/z 161，锥孔电压为15V。
(3)结果与讨论
考察该方法的线性、检出限和定量限等参数，结果见表1。从表1中可以看到，3-羟基-3-甲基戊二酸在0.05-5mg/L范围内线性良好，r为0.9988，RSD小于11.17％，因此认为该方法准确性良好，可以用来测定3-羟基-3-甲基戊二酸。
表1：3-羟基-3-甲基戊二酸的线性、检出限和定量限结果
分别对3个阴性样品中的3-羟基-3-甲基戊二酸含量、精密度以及回收率进行测定。图3是未经前处理直接稀释进样的质谱图，图4是经过前处理浓缩之后进样的质谱图。采用外标法定量，RSD均小于12.27％，结果见表2。
表2：实际样品中3-羟基-3-甲基戊二酸的定量结果
实施例4阳性样品的测定
由于阳性样品只有一个，用阴性样品加标模拟阳性样品。分别取4份1号样品1907，1807，1607，1007uL，加入1000mg/L的标准3-羟基-3-甲基戊二酸溶液，使溶液体积为2mL，4份样品中的3-羟基-3-甲基戊二酸浓度分别为50、100、200、500mg/L。分别取阳性样品和4个模拟的阳性样品各20μL至15mL离心管，分别用超纯水稀释到2mL，加2mL乙腈混匀，3000rpm离心10min，弃去沉淀，加浓盐酸调节pH至1.0。加入6mL乙酸乙酯混匀，3000rpm离心5min，分层，取上清液6mL，重复两次。合并上层萃取液，氮吹吹干，用100μL甲醇/水(1:1)复溶。用石英玻璃管进样，由于复溶后的样品量太少无法蘸取进样，用25μL进样针取2μL样品到进样管上，这样也保证了每次进样量都一致，提高了方法的重现性。待溶液挥干，待气体温度达到合适的温度，让DART开始运行，待信号稳定后开始移动载样器。
DART条件：负离子模式采集数据，气体温度为400℃，采用Dip-it进样管进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，流速为3L/min，待机气体为高纯氮气。栅极电压为-200V，离子源出口距质谱进口约2.4cm。
Waters QDa质谱条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-200，sim模式下m/z 161，锥孔电压为15V。
测出每个样品的3-羟基-3甲基戊二酸m/z 161的特征峰面积，用外标法进行定量，结果见表3，测的模拟的阳性样品浓度与理论值相近，说明了该方法可以用于尿液中3-羟基-3-甲基戊二酸的定量。图5是阳性样品质谱图。
表3：阳性样品定量结果