本发明涉及精神类药物的血药浓度监测
技术领域：
，尤其涉及一种检测血液中奥氮平药物浓度的方法。
背景技术：
：奥氮平(Olanzapine，OLZ)，分子式C17H20N4S，具体结构如下图1所示。奥氮平为黄色结晶性粉末，熔点为191-196℃。精神分裂症是常见的精神障碍性疾病，我国成人终身发病率约为1％-2％。奥氮平是常用的传统非典型抗精神病药，在体内吸收迅速，具有强大的镇静催眠作用，用于治疗精神分裂症、精神病性障碍和情感障碍。奥氮平的日推荐剂量为5-20mg，文献报道治疗精神分裂症的有效血清或血浆阈浓度仅为9μg/L，其血药浓度与药理作用具有相关性，且和靶组织浓度具有显著相关，但药动学个体差异大，可能发生严重的不良反应，影响疗效，故有必要检测奥氮平血药浓度。奥氮平血药浓度的常用检测方法有高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-电化学法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱联用法等。LC-MS/MS法灵敏度高，但稳定性较差，且成本很高，对人员与场地要求较高。2D-LC/UV分离效果好，灵敏度高，具有较高的稳健性及自动化能力，但目前检测方法所需血液的量很大，且前处理过程中消耗的试剂量也较大。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中奥氮平药物浓度的方法，使奥氮平血药浓度的测定快速准确，并缩短样品分析时间，通过优化前处理方案，提高回收率和检测灵敏度。本发明采用以下技术方案：本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL和190μL空白血清或血浆分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为800-1200rpm下涡旋混匀1-2min后，加入含有5-20％体积乙酸乙酯的甲基叔丁基醚萃取剂的1000μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀4-6min后，再加入10mol/L的NaOH溶液200μL，并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到清液，分别取上述清液720ul置于另一个1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；向上述吹干的离心管中加入由6∶4的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液，分别取上述上清液90uL，用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的奥氮平色谱图，以上述至少三个标准溶液的奥氮平峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有奥氮平的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为含有奥氮平的溶液；(a)标准工作液的配制：精确称取奥氮平标准品5mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为20％-50％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有10-5000μg/mL奥氮平的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；(二)检测血液的离心取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(b)用移液枪移取200μL步骤(二)中所述血清或血浆于1.5ml离心管中，然后用移液枪移取含有5-20％体积乙酸乙酯的甲基叔丁基醚萃取剂1ml加入到上述离心管中，并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，然后在上述离心管中加入10mol/L的NaOH溶液200μL，并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-10min，得到清液；(c)取步骤(b)清液720μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；(d)向步骤(c)的上述吹干的离心管中加入由6∶4的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(d)待测的样品进行检测，得出上述待测样品的奥氮平色谱图，将上述色谱图中的奥氮平峰面积y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物浓度x，即为待检测血液中的奥氮平药物浓度；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有80、160、320、640、1280、1920、2880μg/mL浓度的奥氮平溶液；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述萃取剂是由9∶1的甲基叔丁基醚和乙酸乙酯组成萃取剂；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：在步骤(a)中用由4∶6的水和甲醇组成的稀释液进行稀释；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSICOLPRE-FILTERWATER1/160.5M；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Waters公司的XBridgeCl8；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用流动相为含0.3％甲酸和20nmol/L乙酸铵的水-甲醇，并且采用梯度洗脱，流速为0.35mL/min，进样量为15uL；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为275nm，采集频率为5.0Hz；本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述含水量为体积比的含水量。本发明有益效果：本发明所述的检测血液中奥氮平药物浓度的方法，将外标法与高效液相色谱法相结合，更适于高通量样本检测；采用小粒径色谱柱和低流速，减少有机溶剂的耗费，使实验成本降低且环保，更利于在临床治疗中对患者体内的奥氮平血药浓度进行监测，为抗精神病药物奥氮平的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。附图说明图1为奥氮平化学结构式；图2为实施例中标准溶液中奥氮平色谱图，图2中标号1为标准溶液的奥氮平峰；图3为实施例中加标血清或血浆样本中奥氮平色谱图，在图3中标号1为待检测血液的奥氮平峰。下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。具体实施方式本发明的检测血液中奥氮平药物含量的液相色谱分析方法，它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定首先将七种不同浓度的标准工作液10μL和190μL空白血清或血浆分别置于1.5ml的七个离心管中混合制成七种标准溶液，空白血清或血浆是指不含有奥氮平的血清或血浆，上述标准溶液分别在转速为1000rpm下涡旋混匀1min后，加入由9∶1的甲基叔丁基醚和乙酸乙酯组成的萃取剂1000μL，并在转速为1000rpm下涡旋混匀5min后，再加入10mol/L的NaOH溶液200μL，并在2000rpm的转速下涡旋混合2min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到清液，分别取上述清液720ul置于另一个1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；向上述吹干的离心管中加入由6∶4的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在2000rpm转速下涡旋混匀1min后，再在10000rpm的转速下高速离心5min，得到清液，分别取上述清液90uL，用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测，得出上述七种标准溶液的奥氮平色谱图，如图2是其中的一个，以上述七个标准溶液的奥氮平峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有奥氮平的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为含有奥氮平的溶液；(a)标准工作液的配制：精确称取奥氮平标准品5mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为20％-50％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，例如：由4∶6的水和甲醇组成的稀释液进行稀释，分别在含有10-5000μg/mL奥氮平的范围内配置出各标准工作液，例如：七种不同浓度的标准工作液分别为含有80、160、320、640、1280、1920、2880μg/mL浓度的奥氮平溶液，并在-80℃条件下保存；(二)检测血液的离心取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(b)用移液枪移取200μL步骤(二)中所述血清或血浆于1.5ml离心管中，然后用移液枪移取由9∶1的甲基叔丁基醚和乙酸乙酯组成的萃取剂1ml，并加入到上述离心管中，并在2000rpm的转速下涡旋混合5min，然后在上述离心管中加入10mol/L的NaOH溶液200μL，并在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到清液；(c)取步骤(b)清液720μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；(d)向步骤(c)的上述吹干的离心管中加入由6∶4的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在2000rpm转速下涡旋混匀1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(d)待测的样品进行检测，得出上述待测样品的奥氮平色谱图(如图3所示)，将上述色谱图中的奥氮平峰面积y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物浓度x，即为待检测血液中的奥氮平药物浓度。高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSICOLPRE-FILTERWATER1/160.5M；色谱柱为Waters公司的XBridgeC18；柱温为35℃；流动相为含0.3％甲酸和20nmol/L乙酸铵的水-甲醇，并且采用梯度洗脱，流速为0.35mL/min，进样量为15uL。紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为275nm，采集频率为5.0Hz。本申请文件中所述含水量为体积比的含水量。表1液相色谱洗脱程序时间/minH2O(0.3％FA，20nmol/LNH4Ac)％MeOH％0.0045556.8045556.8110908.9010908.91455513.804555本实施例中技术方法论证如下：一、该方法的线性关系和定量限将上述配制的10μL的各个浓度的奥氮平标准工作液，加入190μL空白血清或血浆混匀，经前处理操作后，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明奥氮平的线性范围和定量限如下：(1)检测限(LOD)：0.69μg/L。(2)定量限(LOQ)：2.31μg/L。(3)线性范围：奥氮平在4μg/L到144μg/L范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。二、该方法的回收率和精密度取奥氮平标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表2。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为97.9％～100.3％，相对标准偏差为0.56％～3.80％，结果见表2。表2奥氮平加标回收率和精密度加标量8μg/L32μg/L96μg/L平均回收率97.9％99.4％100.3％精密度RSD3.80％0.56％0.98％综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中奥氮平药物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。血清或血浆样本中奥氮平色谱图见图3，标准溶液中奥氮平色谱图见图3，奥氮平保留时间为7.0min，由图2和图3可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页1 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