本发明涉及一种适用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测方法，尤其是适用于聚乙二醇化药用蛋白酶的纯度检测，更具体的是一种聚乙二醇化门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶的纯度检测方法。
背景技术：
：药用蛋白和多肽普遍存在生物稳定性差、体内半衰期短和具有免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行改造修饰以克服上述缺点。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。采用常规的SDS-PAGE方法来分析聚乙二醇化蛋白质的纯度(中国药典2005年版二部附录VF第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)存在诸多问题：1.操作繁琐，耗时较长。总体说来，SDS-PAGE需要经历制板->制分离胶->制浓缩胶->电泳槽安装->制样->加样->电泳->剥胶->染色->脱色->结果观察等十一个步骤；尽管可以购买商品化的电泳胶节省制胶的步骤和时间，但是依旧耗时较长，第一，样品的制备需要放入100℃加热5-10min；第二，电泳需要45min～1hr；第三，考马斯亮蓝染色、脱色同样需要1～2hr，并且需要多次更换脱色液。2.方法精密度较差，且具有一定的危险性。首先，若使用的是商品胶，方法的精密度取决于商品胶的生产质量；若为自制胶，则凝胶聚合受各种因素的影响，丙烯酰胺有毒性，能致癌致突变；TEMED易燃易挥发，有强神经毒性。3.方法灵敏度低，主成分与杂质分离度无法达到要求。聚乙二醇化蛋白质一般是蛋白质与一个以上的聚乙二醇通过共价结合而制得的。每一个蛋白质分子上都结合有一定数量的聚乙二醇。被聚乙二醇修饰后蛋白质受长链PEG水力学臂的影响，在电泳胶上呈弥散状态分别，根本无法准确考察聚乙二醇化蛋白质所产生的微量降解或聚集杂质。4.方法难以定量，目前除了灰度扫描外，并没有有效的手段通过SDS-PAGE电泳胶对目的蛋白进行定量分析；而灰度扫描也是通过色阶的差异进行分析，缺乏准确性及稳定性。另一方面，疏水层析(HIC)是利用蛋白质在高盐浓度时与固相载体上的疏水配基结合，在洗脱时将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个洗脱、分离。发明人在开发聚乙二醇修饰蛋白纯度检测方法时即参考了原蛋白的纯度检测方法——HIC方法，但并不能有效检测。HIC方法经常用于蛋白的分离与纯化，分析型HIC不常用，故可以参考的文献资料有限。本发明旨在开发适用于聚乙二醇修饰蛋白纯度检测的疏水作用色谱(HIC)方法。技术实现要素：本发明解决的技术问题是：现有聚乙二醇化蛋白质纯度分析方法操作繁琐、精密度差、灵敏度低并具有一定的安全隐患；以及常规疏水层析法无法检测或出峰拖尾严重等的问题。本发明旨在开发适用于聚乙二醇修饰蛋白纯度检测的HIC方法，选用PEG作为流动相添加剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。优选地，流动相添加剂还含有异丙醇。更优选地，所述流动相中含有0.02％～2％(V/V)的PEG修饰剂。更优选地，所述流动相是含0.02％～2％(V/V)的PEG修饰剂、10％(V/V)异丙醇的0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲体系,pH值：5.7～6.3。更优选地，所述流动相流速为0.5mL/min。更优选地，所述色谱法中色谱柱柱温23～27℃。更优选地，所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶。更优选地，所述样品上样量在20～100μL。本发明还提供了PEG在HIC方法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度中作为流动相添加剂的用途，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。优选地，PEG和异丙醇同时作为流动相添加剂在HIC方法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度中的用途，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。本发明通过在流动相添加适量的PEG作为添加剂，开发出了可有效检测聚乙二醇修饰蛋白纯度的HIC方法。其作用机理是PEG可以通过竞争结合至疏水配基上，使结合在柱上的蛋白更容易洗脱，使峰型和对称性更好；通过对pH值，缓冲体系，高盐种类和浓度，不同添加剂、流动相梯度的变化等进行大量的筛选，最终开发出可以用于检测聚乙二醇修饰蛋白纯度的HIC方法。附图说明图1比较例1色谱图图2实施例1不同pH值条件下色谱图,图2a为pH值依次为8.0、7.0、6.5、6.0时的色谱图；图2b为pH值5.5时的色谱图图3实施例1不同缓冲体系条件下色谱图图4实施例1不同高盐种类条件下色谱图图5实施例1不同高盐浓度条件下色谱图图6实施例1不同流动相添加剂条件下色谱图,图6a中从上到下添加剂分别为10％甲醇、10％乙醇、10％丙三醇、10％正丙醇、10％异丙醇、5％正丁醇；图6b中从上到下添加剂分别为2％异戊醇、2％PEG4000、10％ACN、0.1％PEG8000、0.1％Y-PALD-40K、10％异丙醇+0.1％Y-PALD-40K图7实施例1不同流动相梯度条件下色谱图，图7a中从上到下依次是：梯度1、梯度2、梯度3、梯度4、梯度5、梯度6(M-PEG-40K)、梯度6(Y-PEG-40K)；图7b中从上到下依次是：梯度7、梯度8、梯度9、梯度10、梯度11、梯度12图8实施例1流动相添加异丙醇和不添加异丙醇色谱图图9实施例1流动相添加不同PEG的色谱图，图9a中从上到下依次是：Y-PALD-40K、2-arm-pALD-40K、Y-NH2-40K、M-ALD-40K；图9b中从上到下依次是：Y-PALD-30K、M-ALD-30K、M-ALD-20K、Y-PALD-20K图10实施例1初步确定的PEG定点修饰门冬酰胺酶的HIC-HPLC纯度检测方法色谱图图11本发明方法检测PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶(Y-PALD-40KPEG作为修饰剂)纯度色谱图图12本发明方法检测PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶(2-arm-40KPEG作为修饰剂)纯度色谱图图13本发明方法检测PEG修饰的KLK1纯度色谱图具体实施方式本发明使用的术语解释如下：PEG定点修饰的门冬酰胺酶：由L-门冬酰胺酶(ASP)与一定数量的活化态Y-型聚乙二醇40000通过共价结合而制得的酶，制备方法参见专利申请号201410837456.3实施例1制备例1。每个门冬酰胺酶分子上可结合一个、两个或三个聚乙二醇，分别命名为PEG-ASP单修、PEG-ASP双修、PEG-ASP三修。PEG定点修饰的门冬酰胺酶收集的主要是PEG-ASP双修。采用的PEG修饰剂为Y-PALD-40K(购自北京键凯科技有限公司)，分子量为40KD，是由两个直链的甲氧基聚乙二醇衍生物连接在中心核构成，其化学结构式为：PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶(ADI)，选用Y-PALD-40KPEG(购自北京键凯)或2-arm-40KPEG(分子量为40KD，购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司)，制备方法参照PEG定点修饰的门冬酰胺酶的制备方法，收集PEG-ADI双修样品。PEG修饰的激肽释放酶(KLK1)，按照KLK1:PEG修饰剂(M-SPA-10K，购自北京键凯科技有限公司)为1:100的摩尔比进行反应反应12h。修饰反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrapQHP5mL)，平衡缓冲液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脱缓冲液：含0.1MNaCl的20mM的磷酸缓冲液(pH8.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。比较例1样品的制备：取PEG定点修饰的门冬酰胺酶适量，用流动相A溶解并制成每1ml中约含有200单位的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法测定。色谱柱：TSKgelphenyl–5PW7.5mmI.D.×7.5cmparticlesizeμm10流动相：A:1.7M硫酸铵+磷酸钠缓冲盐(pH7.0)；B:磷酸钠缓冲盐(pH7.0)检测波长：280nm；柱温：25℃；上样量：10μL。分别进样PEG定点修饰的门冬酰胺酶和空白溶剂；结果见图1，从上到下依次是PEG定点修饰的门冬酰胺酶、空白溶剂。由图1可以看出：PEG定点修饰的门冬酰胺酶样品溶液在出峰位置并没有出峰(42min位置为空白溶剂峰)，说明该HIC纯度检测方法不能用于检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶样品溶液的纯度检测。实施例1HIC方法检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶纯度一、方法开发本方法的开发过程总的概括为六个方面：pH值、缓冲体系、高盐种类、高盐浓度、不同添加剂、流动相梯度的调整等，其最终确定的各项参数与参考文献均不相同，下面展示其具体的方法开发过程：1、pH值的筛选：在对比例1的基础上，在上述流动相B中加入10％异丙醇，其余条件不变；调整AB两相中的pH值，见图2，从上到下pH值依次为8.0、7.0、6.5、6.0、5.5。主峰保留时间在26～28min；其中pH6.0对主峰分离较为有利。2、缓冲体系的筛选：在确定pH6.0的基础上，更换不同缓冲盐体系，见图3，从上到下依次是磷酸钠缓冲体系、磷酸钾缓冲体系(0.02mol/L)、Tris缓冲体系；另外缩短了流动相梯度后续平衡的时间以节约调整方法的时间。主峰保留时间在26～28min，0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲体系明显有利于其他缓冲体系。3、高盐种类的筛选：在确定使用0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲盐体系(pH6.0)的基础上，更换不同高盐的种类，见图4，从上到下依次是硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾、磷酸钾。硫酸铵很明显比其它更优于主峰的分离。4、高盐浓度的筛选：根据上述试验，分别考察不同高盐浓度对主峰分离的影响，见图5，从上到下依次是0.5M、0.75M、1M、1.7M、3M硫酸铵。1M的硫酸铵优于其它浓度。5、添加剂的筛选：根据以上筛选后的条件实验，发现主峰仍存在较严重的拖尾现象，通过使用不同添加剂进而能改善峰的分离度和峰型，见图6，从上到下依次：10％甲醇、10％乙醇、10％丙三醇、10％正丙醇、10％异丙醇、5％正丁醇、2％异戊醇、2％PEG4000、10％ACN、0.1％PEG8000、0.1％Y-PALD-40K、10％异丙醇+0.1％Y-PALD-40K。以上百分比均为体积百分比。发现使用异丙醇和Y-PALD-40K混合添加剂后的效果较好，但需要从流动相梯度等调整使其主峰完全分离。6、流动相梯度的调整见图7，从上到下依次是：梯度1、梯度2、梯度3、梯度4、梯度5、梯度6(M-PEG-40K)、梯度6(Y-PEG-40K)、梯度7、梯度8、梯度9、梯度10、梯度11、梯度12。流速均为0.5ml/min。梯度1：梯度2：梯度3：梯度4：梯度5：梯度6：梯度7：梯度8：梯度9：梯度10：梯度11：梯度12：(备注：上述梯度调整过程中为了节约时间，并没添加平衡色谱柱的那段时间；再确定流动相梯度后，添加了平衡色谱柱的时间，故最终洗脱时间为60min)其中梯度6比较了M-PEG-40K(分子量为40KD，购自北京键凯科技有限公司)与Y-PEG-40K对峰型和分离度的影响，两者的分离效果相近；综合分离度、峰形对称性、准确度等因素，选择“梯度12”进行洗脱。7.其他条件的选择：7.1还比较了添加异丙醇和不添加异丙醇的样品检测情况，见图8，依次是仅添加异丙醇、仅添加PEG、添加异丙醇+PEG。流动相如果不添加PEG，主峰拖尾严重，且无法与杂质分离；综合分析选择异丙醇和添加剂PEG合用的流动相更好。7.2PEG的使用量：分别考察了PEG含量为0.02％、0.01％、0.005％的流动相。PEG的使用量为0.02％时，对峰型还无明显的干扰，当降至更低时峰拖尾严重甚至不出峰，所以流动相中添加剂PEG的使用量为0.02％比较合适，既节约了PEG使用量，又能达到较好的分离效果。7.3添加剂中PEG的选择：流动相中采用不同种类的PEG，图9，从上到下依次是：Y-PALD-40K、2-arm-pALD-40K、Y-NH2-40K、M-ALD-40K、Y-PALD-30K、M-ALD-30K、M-ALD-20K、Y-PALD-20K。PEG分子量的大小，明显对峰的峰形和分离度有影响，添加40KDPEG明显优于30KD、20KD。选用分子量不小于修饰蛋白用PEG分子量的PEG作为流动相添加剂可较好地用于蛋白的纯度分析。二、初步确定PEG定点修饰的门冬酰胺酶的HIC-HPLC纯度方法为：色谱柱：TSKgelphenyl–5PW7.5mmI.D.×7.5cmparticlesizeμm10流动相：A:1.0M硫酸铵+0.02M磷酸二氢钾(pH6.0)；B:0.02M磷酸二氢钾+10％异丙醇+0.02％Y-PALD-40K(pH6.0)梯度如下表：检测波长：280nm；柱温：25℃；上样量：50μLPEG定点修饰的门冬酰胺酶样本溶液的制备：取样本用流动相A稀释至150IU/mL，混匀，12000rpm离心5min，取上清，即得。上述PEG定点修饰的门冬酰胺酶HIC-HPLC色谱图见图10。名称保留时间面积％面积高度USP分离度USP拖尾USP理论塔板数峰135.651587592.9634171.6162985峰240.186192387397.04278694.141.387579三、考察柱温、pH、上样量微调对分析性能的影响1、柱温的变化：考察了柱温在25℃±2℃条件下，对分析结果的影响。由以上结果可以看出：不同柱温下纯度的均值为96.4％，RSD值为0.31％；所以柱温的在23～27℃范围内，对分析性能没有太大的影响。2、流动相pH值的变化：考察了流动相pH值在6.0±0.3条件下，对分析结果的影响由以上结果可以看出：不同pH下纯度的均值为96.53％，RSD值为0.16％；所以流动相pH值在5.7～6.3范围内，对分析性能没有太大的影响。3、上样量的改变：考察不同进样量(20μL、80μL、100μL)对分析性能影响，结果如下：由以上结果可以看出：不同进样体积下纯度的均值为96.52％，RSD值为0.18％；所以样品在20～100μL上样量范围内，对分析性能没有太大的影响。实施例2实施例1方法的验证采用聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶双修样品(效价约为300IU/mL)对HIC-HPLC纯度方法进行正式验证，其内容如下：1.试液及样品溶液的配制：1.1制剂缓冲液：称取磷酸二氢钠5.26g，磷酸氢二钠0.87g，山梨醇30g，加水定容1000mL(pH约为6.5)，充分溶解，混匀即得。1.2缓冲溶液的配制：称取磷酸二氢钾2.72g，加纯化水充分溶解定容至1000mL，即为0.02M缓冲溶液，备用。流动相A：称取硫酸铵132g，加上述缓冲溶液充分溶解，用氢氧化钾调pH至6.0，定容至1000mL，过0.22μm滤膜后，超声脱气10min以上备用；流动相B：称取Y-PALD-40K粉末200mg，加上述缓冲溶液充分溶解，加入异丙醇100mL，用氢氧化钾调pH至6.0，定容至1000mL；过0.22μm滤膜后，超声脱气10min以上备用。1.3供试品溶液：聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶双修样品用流动相A溶液准确稀释至150IU/mL浓度，至微量离心机(型号：湘仪H165-W，仪器编号：JQ-060(2-2))12000rpm离心5min，取上清即得。1.4Y-PALD-40KPEG溶液(1mg/mL)：精密称取1.0mgY-PALD-40KPEG粉末，用纯化水充分溶解后，即为1.0mg/mL溶液。2.色谱条件：同实施例1中“二、初步确定PEG定点修饰的门冬酰胺酶的HIC-HPLC纯度方法”3.验证的过程及结果如下：3.1专属性空白溶液、ASP溶液、添加剂Y-PALD-40KPEG溶液均无干扰；PEG定点修饰的门冬酰胺酶主峰与杂质峰分离度不小于1.5。空白溶剂：取制剂缓冲液与流动相A等体积混合，12000rpm离心5min，取上清即得。同一样本溶液Y-PALD-40KPEG(1mg/mL)，分别进样50μL、20μL、5μL，考察在5min保留时间左右的峰面积大小与Y-PALD-40K样本浓度的关系，结果表明随着进样体积的减小，5min位置的峰面积也逐渐减小，验证了在方法开发中的推测，此处峰面积的变化是由于Y-PALD-40KPEG浓度不同造成的差异。3.2系统残留进样高浓度样品(200IU/mL)后进一针空白溶剂，至少三次，要求：空白溶剂在待测物质保留时间处无干扰峰或干扰峰对定量下限无影响(高浓度之后的空白溶剂中的残留应不超过定量下限的20％)。空白样本保留时间面积定量下限的1/5是否干扰140.8362516364.4无干扰240.77459436364.4无干扰340.86960696364.4无干扰由上表可知空白样品对定量下限无影响，故对样品检测不存在影响。3.3定量限LOQ将300IU/mL的样品用流动相A稀释至LOQ浓度(4IU/mL)水平，平行配制6份样本溶液，分别进样检测，要求：s/n值为10，作为定量限，检测结果如下：结论：根据s/n值计算LOQ约为10，作为定量限；平行6针LOQ，RSD％为1.74％，符合验证方案的要求。3.4线性及范围要求：应使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品和零浓度样品，在指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线，线性回归系数R2≥0.990，校正标样回算的浓度一般应在标示值得±15％，定量下限处应该在±20％内。将300IU/mL的样品用流动相A分别稀释至：5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL，按照上述色谱条件分别进样50μL进行测定。主峰(峰2)的线性方程为：y＝13,076.6977x–57,646.7212，R2＝0.9998，说明方法在检测限至进样浓度120％浓度水平范围内，线性关系良好。主峰的准确度结果如下：结论：峰1(杂质峰)、峰2(主峰)线性R2均≥0.999，5IU/mL样品回收率在±20％，其他浓度水平在±10％，符合验证要求。3.5批内精密度及批间精密度要求：批内精密度：每批每浓度5个质控样本实测浓度的RSD不大于5％；批间精密度：3批每浓度5个质控样本实测浓度的RSD不大于5％；以一条标准曲线、3个浓度(200IU/mL、100IU/mL、10IU/mL)的质控样本，每个浓度质控样本各5份样本，组成1个分析批，至少考察3个分析批。三批样品的不同浓度的峰2(主峰)批内精密度RSD％在0.19％～1.32％，批间精密度在RSD％在0.67％～2.43％，均小于5％，符合验证方案要求。峰1(杂质)的精密度RSD％值在0.35％～2.61％，可见精密度良好。3.6准确度以一条标准曲线、3个浓度(200IU/mL、100IU/mL、10IU/mL)的质控样本，每个浓度质控样本各5份样本，组成1个分析批，至少考察3个分析批。要求：以质控样本浓度的回收率表示，回收率在100±10％之间。三批样品的不同浓度的批间准确度RSD％在0.67％-2.43％，三批样品的不同浓度的回收率在97.47％-109.74％，符合验证要求。3.7溶液稳定性将高浓度样本溶液(200IU/mL)分别在0、8、18、18、24、40h进样，考察样本溶液的主峰峰面积和保留时间的RSD值，要求RSD值均小于5％。样本溶液在0～40h内稳定，其主峰的保留时间RSD值为0.13％，峰面积RSD值为0.83％，符合验证方案的要求。实施例3实施例1的方法检测PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶1、当流动相中无PEG作为添加剂时，主峰无法与杂质峰分离，且拖尾严重。2、检测PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶(采用北京键凯的Y-PALD-40KPEG作为修饰剂)纯度，使用Y-PALD-40KPEG作为添加剂，见图11。3、检测PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶(采用厦门赛诺的2-arm-40KPEG作为修饰剂)纯度，使用2-arm-40KPEG作为添加剂，见图12。由上述结果可以证明本发明的HIC-HPLC纯度方法可以用于空间结构类似的其他PEG修饰蛋白样品的纯度检测。实施例4实施例1的方法检测PEG修饰的KLK1采用实施例1的方法，在流动相中不添加PEG和添加PEG(Y-PALD-40KPEG)分别进样，图13显示流动相中添加PEG明显有利于PEG修饰的KLK1的峰形改善；此方法适用于PEG修饰的KLK1的检测。此外，本实施例中PEG修饰的KLK1所用PEG修饰剂分子量为10KD，纯度分析时选用的PEG添加剂分子量为40KD，由此可知选用分子量大于修饰蛋白用PEG分子量的PEG作为流动相添加剂可较好地用于蛋白的纯度分析。当前第1页1 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