技术领域
本申请属于农业生物技术领域，尤其涉及一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法。
背景技术：
水稻籽粒中淀粉含量约占90%，水稻籽粒充实的过程就是淀粉积累的过程。因此，淀粉在籽粒积累的速度和持续时间，决定了籽粒充实的优劣和籽粒的重量。水稻碳代谢是最基础的代谢,直接关系到水稻的产量与品质。
在淀粉生物合成、优质水稻品种选育和品质遗传改良研究中，通常要测定水稻碳代谢关键酶的活性。近年来的研究表明，无论是高等植物的光合器官还是非光合器官，ADPG焦磷酸化酶(ADPglucose pyrophosphorylase,EC 2 . 7 . 7 . 21, AGPP)和淀粉合成酶( Starch syn-thane , EC 2 . 4 .1. 21, SSS)及淀粉分支酶( tarchbranching enzyme, EC 2.4.1.18,SBE)是籽粒淀粉合成代谢的几个关键酶，对水稻籽粒中淀粉合成和积累起着重要的调节作用。
常规采用以下方法取样测定碳代谢酶活性：在抽穗期，各小区选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，自抽穗第10天起，测试抽穗后每5天的碳代谢酶活性，该取样时间能够确定水稻籽粒充实过程的分子酶活性变化规律。每次于上午9:00一9:30取标记穗，迅速装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃冰柜中。待测定样品时，每穗上只选取灌浆基本一致的穗中部充实粒用于酶活性测定，以消除开花时间的差异所带来的误差，粗酶液的提取取样品籽粒30粒，去壳去胚，称重。在预冻的研钵中研磨，提取介质为：10mL缓冲液0.1 Mol / L1mL研磨、3次3mL冲洗(体系为： Hepes-NaOH(pH 7.6)，5 mmol / L MgC12，5mmol/ L DTT（二硫苏糖醇），2 % (W / V)PVP（聚乙烯比咯烷酮）)，研磨液在10 000r/min下冷冻离心10 min，取上清液用于酶活性测定。测定时取1mL粗酶液，加1mL 0.2mol/L柠檬酸缓冲液（pH7.0），加0.5mL 0.1mol/L EDTA后振荡，再加0.5mL0.75%可溶性淀粉，摇匀，在37℃水浴中保温40min后，加4mL 10%三氯乙酸(TCA)终止反应。5000×g离心8min，取上清液，加0.3mL碘液显色，10 min后测波长660nm处光密度值，以零时为对照，按△OD660(%)=[OD660(零时-OD660(t时)]/OD660(零时)x100%计算酶活性。
这种方法比较适合近距离的采样，当试验采样地点与酶活测试地点相距较远时，如果将液氮冷冻过后的籽粒样品解冻，剥除再剥除籽粒外壳，不仅需要大量时间，而且由于酶在常温下会失活，温度的变化也会对酶活性的测定产生很大影响，使得实验结果的精度大大降低。然而目前部分试验需要从较远的试验现场采样，再带回实验室测试酶活性，有时也存在采样时没有足够的时间剥除籽粒外壳的情况。这时，怎样才能不考虑籽粒剥壳环节，同时将实验结果影响尽量减少，是困扰众多实验者的一个实用问题。
目前国内尚无相关申请专利，设计一种准确性和精度高、应用前景较广的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法是非常必要的。
技术实现要素：
解决的技术问题：
本申请针对上述技术问题，提供一种在远距离采样不具备去壳可能时，带壳进行远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，解决现有测定方法操作复杂、准确性和精度低等技术问题。
技术方案：
一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，包括如下步骤：
第一步：在抽穗期，选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，采样时间为抽穗后10天、17天和25天；
第二步：现场采样后将籽粒装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃~-80℃冰柜中；
第三步：取样品籽粒15粒，带壳带胚，称量0.2-0.4g，在预冻的研钵中先加入冷冻的籽粒研磨，研磨完全后在研钵中分两次每次3mL加入缓冲液，第二次将研钵冲洗干净得研磨液；
第四步：研磨液在冷冻离心机离心后取上清液用于酶活性测定，所述上清液为粗酶液；
第五步：通过碳代谢关键酶活力计算公式对粗酶液进行ADPG焦磷酸化酶活性测定和可溶性淀粉合成酶活性测定。
作为本发明的一种优选技术方案：所述碳代谢关键酶活力计算公式为（U/g）＝ΔA×VT/(0.01×Vs×t×WF)，公式中ΔA—反应时间内吸光值的变化；VT—粗酶提取液总体积（6mL）；Vs—测定用粗酶液体积（0.5mL）；WF—样品鲜重（g）；0.01—A每下降0.01为1个酶活单位（U）；t—反应时间（30min）。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中的缓冲液由100mmol/L Hepes-NaOH、5mmol/L MgCl2、5mmol/L DTT和2%（W/V）PVP配制而成，所述Hepes-NaOH的pH=7.6
作为本发明的一种优选技术方案：所述第四步中冷冻离心机转速为10000-16000 r/ min，离心时间为10-15min。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第五步中ADPG焦磷酸化酶活性测定方法为：在550μL 混合液中加入粗酶液100μL，反应20-30min后，在沸水浴中加热30-50s终止反应，再在10000-16000r/min下离心10-20min后取上清液500μL，上清液中加入100μL反应液，30-40℃下反应10-30min，加入pH=7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，再测定340 nm处OD值；所述混合液由100mmol/L Hepes-NaOH、1.2 mmol/LADPG、3mmol/L PPi、5mmol/LMgCl2和4mmol/L DTT配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH=7.4；所述反应液由6mmol/L NADP、1.5IU葡萄糖磷酸变位酶和1.5IU磷酸葡萄糖脱氢酶配制而成。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第五步中可溶性淀粉合成酶活性测定方法为：在180μL 的混和液中加入100μL粗酶液，在30℃下反应10min，沸水浴中加热10-30s终止反应，再在冰浴中冷却；冷却后再加入100μL的反应液，在沸水浴中加热30-40s终止反应，再在10000-16000r/min下离心5-10min；所述混合液由50mmol/L Hepes-NaOH、1.6 mmol/L ADPG、0.7g支链淀粉和15 mmol/L DTT配制而成，所述反应液由50 mmol/L Hepes-NaOH、4 mmol/L PEP、200mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2和1.2 U的丙酮酸激酶配制而成，混合液和反应液中Hepes-NaOH 的pH =7.4。
作为本发明的一种优选技术方案：所述离心后取上清液350μL，加入反应液300μL，30-40℃下反应10-30min后，加入pH =7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，测定340nm OD值；所述反应液由50mmol/L Hepes-NaOH、10mmol/L葡萄糖、20mmol/L MgCl2、2mmol/L NADP、1.4U己糖激酶和0.35U G-6P脱氢酶配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH =7.4。
有益效果：
本发明所述一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：1、其测试操作简便、应用成本低、使用方法简单、测定结果合理；2、采样时间减少为3次，能够明确碳代谢酶活性的变化规律；3、远程采样法能够解决不便于进行籽粒剥壳情况下的采样问题，能够通过液氮先将籽粒冷冻保存后，再带回实验室-80℃冰箱储存待检测，保存样品的酶活性；4、所需要的保温瓶简单，操作方便，且便于运输携带和管理，不必使用液氮罐进行运移，相比于近距离酶活性检测所要求的剥壳对时间和人力、温度等苛刻条件，远程采样法只需保证籽粒保存在保温瓶液氮中运输，再转移至-80冰箱储存，就可以对酶活性达到较好的检测效果；5、检测方法简便易行，数据还原区分度高，碳代谢酶活性检测本身就是半定量的，主要针对同批次待测样本进行数据分析比较，因此使用远程采样还原的方法不会对数据结果分析造成误差影响，远程采样方法的方法简单，通过数据还原即可进行数理统计分析，分析结果具有统计意义，可以广泛生产并不断代替现有材料。
具体实施方式
实施例1:
在抽穗期，选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，采样时间为抽穗后10天、17天和25天；现场采样后将籽粒迅速装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃~-80℃冰柜中。
取样品籽粒15粒，带壳带胚，称量0.2-0.4g，在预冻的研钵中先加入冷冻的籽粒研磨，研磨完全后在研钵中分两次每次3mL加入缓冲液，第二次将研钵冲洗干净得研磨液，缓冲液由100mmol/L Hepes-NaOH、5mmol/L MgCl2、5mmol/L DTT和2%（W/V）PVP配制而成，所述Hepes-NaOH的pH=7.6；研磨液在冷冻离心机离心后取上清液用于酶活性测定，冷冻离心机转速为10000-16000 r/ min，离心时间为10-15min，所述上清液为粗酶液。
在在550μL 混合液中加入粗酶液100μL，反应20-30min后，在沸水浴中加热30-50s终止反应，再在10000-16000r/min下离心10-20min后取上清液500μL，上清液中加入100μL反应液，30-40℃下反应10-30min，加入pH=7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，再测定340 nm处OD值；所述混合液由100mmol/L Hepes-NaOH、1.2 mmol/LADPG、3mmol/L PPi、5mmol/LMgCl2和4mmol/L DTT配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH=7.4；所述反应液由6mmol/L NADP、1.5IU葡萄糖磷酸变位酶和1.5IU磷酸葡萄糖脱氢酶配制而成。
碳代谢关键酶活力（U/g）＝ΔA×VT/(0.01×Vs×t×WF)，ΔA—反应时间内吸光值的变化；VT—粗酶提取液总体积（6mL）；Vs—测定用粗酶液体积（0.5mL）；WF—样品鲜重（g）；0.01—A每下降0.01为1个酶活单位（U）；t—反应时间（30min）。结果如表1所示。
本申请对远程采样的水稻籽粒碳代谢酶活性具有显著的增强效果。使用本申请的籽粒存放1个月后，在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学农学院对储存的籽粒进行碳代谢酶活性检测试验，将储存后的籽粒样品经带壳磨碎到研钵内后，采用本申请所述的方法检测籽粒中的碳代谢酶活性，对比2013年去壳试验的结果，本方法的酶活性通过数理统计检验。黑龙江省哈尔滨市东北农业大学试验远程采样水稻籽粒碳代谢酶活性测得的数据如下表。
表1 远程采样水稻籽粒ADPG焦磷酸化酶活性测定记录表（单位U）
注：W1代表常规灌溉,W2代表控制灌溉；F1代表常规施肥,F2代表前氮后移施肥。
其测试操作简便、应用成本低、使用方法简单、测定结果合理；采样时间减少为3次，能够明确碳代谢酶活性的变化规律；远程采样法能够解决不便于进行籽粒剥壳情况下的采样问题，能够通过液氮先将籽粒冷冻保存后，再带回实验室-80℃冰箱储存待检测，保存样品的酶活性；所需要的保温瓶简单，操作方便，且便于运输携带和管理，不必使用液氮罐进行运移，相比于近距离酶活性检测所要求的剥壳对时间和人力、温度等苛刻条件，远程采样法只需保证籽粒保存在保温瓶液氮中运输，再转移至-80冰箱储存，就可以对酶活性达到较好的检测效果；检测方法简便易行，数据还原区分度高，碳代谢酶活性检测本身就是半定量的，主要针对同批次待测样本进行数据分析比较，因此使用远程采样还原的方法不会对数据结果分析造成误差影响，远程采样方法的方法简单，通过数据还原即可进行数理统计分析，分析结果具有统计意义，可以广泛生产并不断代替现有材料。
实施例2:
在抽穗期，选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，采样时间为抽穗后10天、17天和25天；现场采样后将籽粒迅速装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃~-80℃冰柜中。
取样品籽粒15粒，带壳带胚，称量0.2-0.4g，在预冻的研钵中先加入冷冻的籽粒研磨，研磨完全后在研钵中分两次每次3mL加入缓冲液，第二次将研钵冲洗干净得研磨液，缓冲液由100mmol/L Hepes-NaOH、5mmol/L MgCl2、5mmol/L DTT和2%（W/V）PVP配制而成，所述Hepes-NaOH的pH=7.6；研磨液在冷冻离心机离心后取上清液用于酶活性测定，冷冻离心机转速为10000-16000 r/ min，离心时间为10-15min，所述上清液为粗酶液。
在180μL 的混和液中加入100μL粗酶液，在30℃下反应10min，沸水浴中加热10-30s终止反应，再在冰浴中冷却；冷却后再加入100μL的反应液，在沸水浴中加热30-40s终止反应，再在10000-16000r/min下离心5-10min；所述混合液由50mmol/L Hepes-NaOH、1.6 mmol/L ADPG、0.7g支链淀粉和15 mmol/L DTT配制而成，所述反应液由50 mmol/L Hepes-NaOH、4 mmol/L PEP、200mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2和1.2 U的丙酮酸激酶配制而成，混合液和反应液中Hepes-NaOH 的pH =7.4。
离心后取上清液350μL，加入反应液300μL，30-40℃下反应10-30min后，加入pH =7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，测定340nm OD值；所述反应液由50mmol/L Hepes-NaOH、10mmol/L葡萄糖、20mmol/L MgCl2、2mmol/L NADP、1.4U己糖激酶和0.35U G-6P脱氢酶配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH =7.4。
碳代谢关键酶活力（U/g）＝ΔA×VT/(0.01×Vs×t×WF)，ΔA—反应时间内吸光值的变化；VT—粗酶提取液总体积（6mL）；Vs—测定用粗酶液体积（0.5mL）；WF—样品鲜重（g）；0.01—A每下降0.01为1个酶活单位（U）；t—反应时间（30min）。结果如表2所示。
本申请对远程采样的水稻籽粒碳代谢酶活性具有显著的增强效果。使用本申请的籽粒存放1个月后，在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学农学院对储存的籽粒进行碳代谢酶活性检测试验，将储存后的籽粒样品经带壳磨碎到研钵内后，采用本申请所述的方法检测籽粒中的碳代谢酶活性，对比2013年去壳试验的结果，本方法的酶活性通过数理统计检验。黑龙江省哈尔滨市东北农业大学试验远程采样水稻籽粒碳代谢酶活性测得的数据如下表。
表2 远程采样水稻籽粒淀粉合成酶活性测定记录表（单位U）
注：W1代表常规灌溉,W2代表控制灌溉；F1代表常规施肥,F2代表前氮后移施肥。
在实验比色过程中发现当淀粉分支酶活性较高时，可定容至25mL比色，比较籽粒冷冻后剥壳测定酶活其活性更高，且操作简便、易行，使用成本也较低。
本申请将籽粒采样与酶活检测联合开展，筛选出既能保证淀粉分支酶活性，又能提高采样效率和效果的远程水稻籽粒酶活性检测方法，实验检测结果表明，远程采样和酶活检测的联合操作能有效解决远距离采样不方便剥壳测定酶活性的不足，在远程采样的酶活检测效果较之传统的剥壳后酶活检测效果更为理想。
上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制，因此在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在权利要求书的范围内。