本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种有色米的染色体组鉴定 方法。
背景技术：
一般说来，米的营养米分为普通白米(糙米和精米)和特种米(包括 有色米和香米)。普通白米的营养成分基本上一样，其主要成份是淀粉和 蛋白质、维生素等。
特种米比较适合产妇、老人、儿童食用，可以有效地补充营养。其中， 有色米以黑米、紫米多见一些，也有少量的红米出产。它们比一般的白米 营养价值要高一些，蛋白质含量要高30％，脂肪酸和维生素的含量也要高 一些，更重要的是富含铁、锌、锰、铜等微量元素。这些米类产量比较小， 因而“身价”不菲，往往一斤可以卖到10多元甚至几十元。
我国劳动人民在长期生产实践中培育出许多特异的有色米品种，如紫 米、黑米、红米等。紫米、黑米：紫米、黑米因色素在果皮层的浓厚深积 为紫、黑色而得名，是一种特殊的变异类型。米质多为黑糯或紫糯，米粒 表皮黑色、紫色或褐色，胚乳为白色。紫米和黑米的营养成份优于籼、粳 米和普通糯米。由于在米皮层的营养成份高于胚乳，故黑米、紫米一般以 糙米进食。黑米和紫米质地细密，熬出的粥晶莹透亮黝黑，民间常作为产 妇，老人，儿童和体虚者的天然营养滋补品。黑米和紫米含硒元素还具有 药用价值。
有色米(黑米、紫米、红米等)的营养价值比普通大米高。有色米富 含蛋白质、赖氨酸、植物脂肪、纤维素和人体必需的矿物质铁、锌、铜、 锰、钼、硒、镁、钙、磷等，以及丰富的维生素B1、B2、B6、B12、D、 E和烟酸，花青素、叶绿素及黄酮类和强心苷等药用成分，尤其是含有一 般大米缺乏的维生素C、胡萝卜素等。有色米的蛋白质含量高于普通米。
有色米中含有强心苷、生物碱、植物甾醇等多种生理活性物质，具有 促进机体代谢、抗衰老等医疗保健功能。有色米可治疗营养不良水肿、贫 血、肝炎、缺乏维生素B1引起的脚气病等。有色米及有色米酒可以防治 慢性肾炎、风湿及胃病等，对老年人缩尿有明显疗效。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种提升有色米营养价值的 方法及其产品，在有色米富含基本营养的前提下，通过本发明方法进一步 提升其营养价值，提高其蛋白质、微量元素含量等，使之比之前的营养价 值更高。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种有色米的染色体组鉴定方法， 包括以下步骤：
A.取材；
B.预处理；
C.前低渗；
D.固定；
E.酶解；
F.后低渗；
G.二次固定；
H.制片；
G.染色体观察。
所述步骤进一步包括：A.取材：上午9点到10点，在水稻田中剪取 生长旺盛的根尖0.5-1cm，用清水洗净。
所述步骤进一步包括：B.预处理：把洗净的根尖放入冰水混合物中， 然后在4℃冰箱放置24小时。
所述步骤进一步包括：B.预处理：用0.05％-0.2％的秋水仙素处理根尖 2.5～3.5小时。
所述步骤进一步包括：B.预处理：用0.002-0.004的8-羟基喹啉处理根 尖低温4℃处理3.5～4.5小时.
所述步骤进一步包括：B.预处理：用饱和α-溴萘预处理根尖2.5～3.5 小时。
所述步骤进一步包括：C.前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗 1次或多次。
所述步骤进一步包括：D.固定：把预处理好的根尖放入新鲜的固定液 (甲醇：冰乙酸＝3∶1)中，然后放4℃冰箱保存。
所述步骤进一步包括：F.后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干 净。
所述步骤进一步包括：G.二次固定：把根尖放进固定液中再固定10～20 分钟。
本发明有益效果包括：通过本发明提升有色米营养价值的方法及其产 品，在有色米富含基本营养的前提下，通过本发明方法进一步提升其营养 价值，提高其蛋白质、微量元素含量等，使之比之前的营养价值更高。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更 加清楚、明确，以下举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局 限于这些实施例。
如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购 买。
在本发明的一实施例中，提供了一种提升有色米营养价值的方法，通 过染色体加倍的方法提高其营养价值。
具体实施步骤：
1、选取株型好、产量高，综合性状表现良好的红米、黑米作为实验 材料，每个颜色的品种分别选取5个；
2、有色米染色体加倍过程：
(1)将红米和黑米水稻材料种子去壳，挑选胚完整、大小均一的用 于接种；
(2)将种子按照如下程序进行消毒：无菌水清洗3-5次，75％的乙醇 消毒1.5min，之后用17％-20％次氯酸钠消毒45min(时间可以适当调整)， 再用无菌水清洗5次，每次3min。然后将水稻种子转移至无菌纸上，吸 干种子表面的水份并在超净工作台中彻底吹干，接种到愈伤诱导培养基上， 每个培养皿接种20-30粒种子；
(3)将接种有水稻种子的培养皿置于恒温箱中光照培养，温度设置 为28℃，光周期为16h光照，8h黑暗，定期观察统计愈伤组织诱导情况； 10-15d左右时，将诱导出的结构疏松、颜色浅而透明的橙黄愈伤组织切下 来，转移到新的培养基上进行继代培养，一个培养皿中放置15-20块，培 养条件同诱导培养；
(4)15d后，将继代出的愈伤组织进行第二次继代培养，继代时间 为7-10d。之后用灭菌的NB液体培养基+秋水仙素浸泡，500mg/L秋水仙 素，在70转/分摇床上浸泡48h。
(5)诱导后的材料从摇床上取出，在无菌环境下无菌钢网滤过，无 菌水冲洗三次，每次大于等于3min，置于无菌纸上吹干1h左右，再次接 种到继代培养基上恢复愈伤活性并淘汰褐化愈伤，7-10天时接到含有分化 培养基的培养瓶中，一个培养瓶中放置3-4块，将接有愈伤组织的分化培 养基置于光照箱中培养，光照时间16h，黑暗8h，温度设置为28℃；。
(6)将分化培养基中已长4-5cm的苗接到生根培养基上；一个培养 瓶中放置2-3颗苗；
(7)将接有苗的生根培养基置于光照箱中培养，光照时间16h，黑 暗8h，温度设置为28℃，定期观察统计苗的生长状况，待苗长根并且有 3叶一心时，进行炼苗、移栽到大田。
(8)多倍体有色米田间鉴定：根据同源四倍体主要农艺性状-籽粒变 大为指标进行3个世代或5个世代的单株筛选，由此选出同源多倍体水稻 群体。
(9)同源多倍体有色米新种质鉴定：以染色体组鉴定技术确定有色 米多倍体新种质的染色体组型(2n＝4x＝48)。
在本发明的另一实施例中，提供了一种提升有色米营养价值的方法， 通过染色体加倍的手段提高其营养价值。
所述提升有色米营养价值的方法，可以包括以下步骤：
(1)种子消毒；
(2)光照培养；
(3)继代培养；
(4)分化培养；
(5)生根培养；
(6)炼苗移栽；
(7)多倍体有色米田间鉴定。
所述步骤(1)种子消毒，优选进一步包括：无菌水清洗3-5次，75％ 的乙醇消毒1～3min，之后用17％-20％次氯酸钠消毒40～50min，再用无菌 水清洗4～8次，每次1～5min；然后将水稻种子转移至无菌纸上，吸干种 子表面的水份并在超净工作台中彻底吹干，接种到愈伤诱导培养基上。
述步骤(2)光照培养，优选进一步包括：将接种有水稻种子的培养 皿置于恒温箱中光照培养，温度设置为28℃，光周期为16h光照，8h黑 暗，定期观察统计愈伤组织诱导情况；10-15d时，将诱导出的愈伤组织切 下来，转移到新的培养基上进行继代培养，培养条件同诱导培养。
所述步骤(3)继代培养，优选进一步包括：15d后，将继代出的愈 伤组织进行第二次继代培养；之后用灭菌的NB液体培养基+秋水仙素浸 泡，在摇床上浸泡36～54h。
所述继代时间可以为7-10d；所述秋水仙素可以为300～600mg/L；所 述摇床可以为70转/分。
所述步骤(4)分化培养，优选进一步包括：诱导后的材料从摇床上 取出，在无菌环境下无菌钢网滤过，无菌水冲洗，置于无菌纸上吹干，再 次接种到继代培养基上恢复愈伤活性并淘汰褐化愈伤，7-10天时接到含有 分化培养基的培养瓶中，将接有愈伤组织的分化培养基置于光照箱中培养， 光照时间14～18h，黑暗6～10h，温度设置为24～32℃。
所述步骤(5)生根培养，优选进一步包括：将分化培养基的苗接到 生根培养基上；一个培养瓶中放置2-3颗苗。
所述步骤(6)炼苗移栽，优选进一步包括：将接有苗的生根培养基 置于光照箱中培养，光照时间14～18h，黑暗6～10h，温度设置为24～32℃； 待苗长根并且有3叶一心时，进行炼苗、移栽到大田。
在本发明的再一实施例中，提供了一种如前述任一项提升有色米营养 价值的方法生产的有色米。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种有色米的染色体组鉴定方法， 包括以下步骤：
A.取材；
B.预处理；
C.前低渗；
D.固定；
E.酶解；
F.后低渗；
G.二次固定；
H.制片；
G.染色体观察。
所述步骤进一步包括：A.取材：上午9点到10点，在水稻田中剪取 生长旺盛的根尖0.5-1cm，用清水洗净。
所述步骤进一步包括：B.预处理：把洗净的根尖放入冰水混合物中， 然后在4℃冰箱放置24小时。
所述步骤进一步包括：B.预处理：用0.05％-0.2％的秋水仙素处理根尖 2.5～3.5小时。
所述步骤进一步包括：B.预处理：用0.002-0.004的8-羟基喹啉处理根 尖低温4℃处理3.5～4.5小时.
所述步骤进一步包括：B.预处理：用饱和α-溴萘预处理根尖2.5～3.5 小时。
所述步骤进一步包括：C.前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗 1次或多次。
所述步骤进一步包括：D.固定：把预处理好的根尖放入新鲜的固定液 (甲醇：冰乙酸＝3∶1)中，然后放4℃冰箱保存。
所述步骤进一步包括：F.后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干 净。
所述步骤进一步包括：G.二次固定：把根尖放进固定液中再固定10～20 分钟。
在本发明的又一实施例中，提供了一种有色米的染色体组鉴定方法：
取材：上午9点到10点(此时细胞分裂旺盛，中期分裂相多)，水稻 田中剪取所需材料生长旺盛的根尖(大约0.5-1cm，用清水洗净)。
预处理：根尖经过预处理可以抑制纺锤体形成，使细胞分裂停止在中 期阶段，从而获得较多的中期分裂相，有4种预处理办法：一是把洗净的 根尖放入冰水混合物中，然后在4℃冰箱放置24小时；二是用0.05％-0.2％ 的秋水仙素处理根尖，大约3小时；三是用0.002-0.004的8-羟基喹啉处 理根尖，(0.002低温4℃处理4h)(大约3小时)；四是用饱和α-溴萘预处 理(把饱和α-溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清作为最后的 预处理液体)，大约3小时。
前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
固定：把预处理好的根尖放入新鲜的固定液(甲醇：冰乙酸＝3∶1) 中，然后放4℃冰箱，可以保存半年。
酶解：从固定液中取一定数量的根尖放入无菌水中，把根尖上的固定 液冲洗干净，然后用刀片切取根尖前部大约0.5mm(根尖留取太长，不利 于根尖吸收酶解液，以致影响解离效果，同时也会使后面的涂片杂质较多， 背景不清晰)，用滤纸吸干上面的蒸馏水后放入酶解液中，每个装有酶解 液的管中放1-2个根尖即可，随后放进28℃的恒温箱。针对不同的材料， 酶解液的浓度和酶解时间也不同。2％纤维素酶+2％果胶酶，时间大约 4.5-5h；4％纤维素酶+3％或4％果胶酶，时间大约5h。
后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
二次固定：把根尖放进固定液中再固定10多分钟。
制片：取2-3个根尖置于预先清洗好的干净载玻片上，滴半滴固定液 用镊子夹住根尖迅速敲打，若根尖酶解完全，则一敲即碎，且没有残余的 表皮。分散敲打，使染色体散开，玻片的两个边缘再分别滴一滴固定液， 迅速在酒精灯火焰上烤两下，然后甩掉玻片上的残余液体。
染色体观察
用相差显微镜观察玻片，20倍目镜即可观察到染色体。若用普通显微 镜观察，可以提前用扣染法进行染色，染液可选用卡宝品红。少量玻片扣 染法：将做好的玻片倒扣(有染色体的一面朝下)于一个干净的培养皿中， 从玻片的两边滴卡宝品红染液，大约15min后取出玻片，然后用细微的水 流稍加冲洗，在火焰上烤一下即成，此时应注意接触火焰的一面为无染色 体的一面。
将处理好的材料置于载玻片的中央，用滤纸吸去多余的溶液，加1滴 卡宝品红染色液，用解剖针将材料压碎并染色4-5min，盖上盖玻片，并在 盖玻片上盖一层滤纸，左手固定载玻片，右手用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片， 然后用拇指在滤纸上方对材料进行施压，使材料尽量分散；以两指夹持载 玻片的2个长边，在酒精灯外焰上烤，但不能沸腾。镜检时先在低倍体镜 下观察，可见有丝分裂各时期的染色体，然后转换高倍镜观察。
3、多倍体有色米蛋白质、微量元素含量测定
(1)测定二倍体红米和黑米的蛋白质、微量元素(铁、镁、钙、钾、 锌)含量并以此作对照，同时测定多倍体红米和黑米的蛋白质、微量元素 含量，选取比二倍体红米和黑米蛋白质、微量元素含量均高的对应多倍体 有色米；
本发明蛋白质含量测定采用如下方法：
1.标准曲线的制作：
取6只10ml刻度试管，编号，按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶 液。准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于另外6支10ml刻度试管中， 加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，盖塞，将试管中溶液给向倒转混合，放 置2分钟后，用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为 纵坐标，以蛋白质浓度值为横坐标，制作出标准曲线。
2.样品中蛋白质提取：
(1)准确称取稻米粉0.5克，放入研钵中，加2ml 0.1mol/L NaOH， 研磨成匀浆，转入到10ml离心管中，再用6ml 0.1mol/L NaOH分三次洗 涤研钵，洗液一并转入10ml离心管中，
用玻棒搅拌，放置30分钟，放置过程间断搅动数次。3500rpm离心 15分钟，上清液转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀，得碱 溶性蛋白。
(2)将上述沉淀用70％乙醇重复提取，操作步骤同上，得醇溶性蛋 白。
3.测定：
吸取提取液0.1ml，放入10ml具塞刻度试管中，加5ml考马斯亮兰 G-250试剂，混匀，放置2分钟，用10mm光径的比色杯在595nm波长下 比色(比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂 混合)，记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的 蛋白质浓度(C)。
4.结果计算：
蛋白质含量(％)＝查表所得蛋白质浓度(ug/ml)×提取液总体积(ml) /样品重(g)×106
微量元素含量测定以第三方微量元素检测结果为依据。
根据蛋白质和微量元素测定结果显示，每个品种加倍后的四倍体红米 比二倍体红米蛋白质含量提高平均约30％，微量元素平均水平提高约8％， 每个品种加倍后的四倍体黑米比二倍体黑米蛋白质含量提高约26％，微量 元素提高约12％。
通过染色体加倍途径使二倍体红米或黑米诱导成对应的同源四倍体 水稻，后者的糙米比前者的糙米表现出种皮更薄，食味型更好，蛋白质、 微量元素含量更高等特性，因为本发明方法改良了水稻品质：当将千粒重 为25g在左右的二倍体水稻品种诱导加倍成的对应的四倍体后，其千粒重 增加到50g左右，糙米容积增加了100％，但是种皮面积只增加了57％， 同时最重要的特征是染色体数量增加一倍，这就意味着染色体表达的结果 是各蛋白含量成倍的增大，即蛋白质含量、微量元素、淀粉含量等都比对 应的二倍体水稻有所提高。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限 制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何 熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭 示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发 明技术方案保护范围内。