变态反应的分子起源的制作方法

背景技术：
：变态反应的临床表现高度多样化，几乎影响所有能够与外界环境接触的器官，即呼吸、皮肤、消化和泌尿生殖器官，并且能够导致全身性过敏性休克，或多或少伴有严重的血液动力学后果。ige抗体是导致诸如哮喘、枯草热、湿疹、荨麻疹、食物变态反应和过敏反应的疾病的i型超敏反应的基石。ige循环且锚定于在肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和郎格罕氏细胞(langerhanscells)表面表达的fcεri。变应原诱导的锚定于组织肥大细胞上的fcεri的ige的交联引起释放组胺和多种细胞因子的级联事件，该级联事件通过募集也带有锚定于fcεri的ige的循环嗜碱性粒细胞而造成这两种反应的放大。虽然这些事件已被非常详细地表征，但关于为什么对大多数个体无害的任何给定蛋白质对其他个体则变成可能致命的变应原这个简单问题仍然没有答案。在此介绍的工作解释了ige产生的最初触发不是源于已知的变应原，而是源于从带有因转录错误而引起的移码的mrna所翻译的微量变体。技术实现要素：本发明源于发明人发现哺乳动物变态反应的分子起源。本发明由此提供了用于检测、控制或调控哺乳动物的免疫应答或变态反应的新型组合物和方法。本发明特别源于发明人发现变态反应在哺乳动物中是由转录失真(“ti”)产生的蛋白质(或其表位)引发的。特别地，如发明人先前所证明的，ti产生具有修饰的c末端的异常蛋白质。继续他们的研究，发明人现在意外地发现ti缺口生成的蛋白质获得在哺乳动物中的免疫原性并引发体内变态反应。发明人还发现，由ti缺口产生的这样的蛋白质本质上是阳离子性的，并且从食物或其他组合物中去除这样的蛋白质产生低变应原性的组合物。本发明由此提供了用于检测、监测和调控哺乳动物的免疫原性和变态反应的新型组合物和方法。本发明的目的更具体地在于一种降低组合物的变应原性或免疫原性的方法，所述方法包括处理所述组合物以去除阳离子蛋白质。本发明的目的在于一种降低组合物的变应原性或免疫原性的方法，所述方法包括处理所述组合物以去除由转录失真产生的蛋白质，更特别是具有由转录失真缺口(transcriptioninfidelitygap)产生的序列的蛋白质。所述组合物可以是任何组合物，例如食物、饲料、药品、兽医产品、美容品等。在一个具体实施方式中，本发明提供了一种制备食品的方法，所述方法包括(i)提供食品制备物，(ii)处理所述食品制备物以从中去除阳离子蛋白质，和(iii)任选地用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的食品。本发明的另一个具体实施方式涉及一种制备药品的方法，所述方法包括(i)提供药品制备物，(ii)处理所述药品制备物以从中去除阳离子蛋白质，和(iii)任选地用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的药品。本发明还提供了包含食品和合适赋形剂的食物组合物，其中所述食品含有少于1重量％的阳离子蛋白质，更优选少于0.5％、少于0.3％、少于0.2％或少于0.1％。本发明还提供了包含药品/兽医产品和合适的赋形剂的药物组合物，其中所述药品/兽医产品已经过处理以含有少于1重量％的阳离子蛋白质，更优选少于0.5％、少于0.3％少于0.2％或少于0.1％。本发明还涉及一种治疗对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的如上定义的药品或兽医产品。本发明还提供了一种用于检测有变态反应倾向的对象的方法，所述方法包括测量来自所述对象的样品中针对具有由转录失真产生的序列的蛋白质的ige水平，其中所述水平与对照值相比的差异指示有变态反应倾向的对象。本发明的另一个目的是一种具有由转录失真产生的序列的阳离子蛋白质或肽，其用作佐剂(例如，以刺激哺乳动物中的抗体产生)。本发明还提供了一种诱导或刺激哺乳动物中抗体产生的方法，所述方法包括向哺乳动物施用具有由转录失真产生的序列的阳离子蛋白质或肽。本发明还提供了一种产生ige的方法，所述方法包括(i)在允许诱导ige产生的条件下向非人哺乳动物施用由转录失真产生的阳离子蛋白质或肽，和(ii)收集所产生的ige。本发明还提供了一种产生ige的方法，所述方法包括：(i)在允许诱导ige产生的条件下向非人哺乳动物施用由转录失真产生的阳离子蛋白质或肽，(ii)收集产生ige的细胞，和(iii)从所述收集的细胞获取单克隆和/或人源化ige。步骤(iii)通常包括产生杂交瘤、杂交瘤的克隆选择和单克隆抗体的产生。本发明还涉及一种制备抗ige抗体的方法，所述方法包括：(i)在允许诱导抗体的条件下向非人哺乳动物施用由转录失真产生的阳离子蛋白质或肽，(ii)收集所产生的抗体，和(iii)选择结合fc受体的抗体。本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含结合fc受体的抗体。本发明还提供了一种疫苗组合物，其包含免疫原和具有由转录失真产生的序列的蛋白质或肽。附图说明图1.在胃内施用ti和非ti肽后的ige产生。上图部分指出了施用所述肽和从小鼠收集血液的天数。通过elisa技术进行血液中ige的测定，结果表示为光密度。两种肽之间的差异是显著的(p<10–6)。图2.在腹膜内施用ti和非ti肽后的ige产生。上图部分指出了施用所述肽和从小鼠收集血液的天数。通过elisa技术进行血液中ige的测定，结果表示为光密度。两种肽之间的差异是显著的(p<10–3)。图3.rna上的ti缺口(红色)导致蛋白质阅读框的移位。由所述缺口引起的蛋白质序列与正常蛋白质非常不同。图4.向小鼠施用富含阳离子蛋白质和贫阳离子蛋白质的级分(6只小鼠/组)。从血液样品中，通过elisa技术进行ige的测定，结果表示为光密度。误差棒指示整个组的测量值的可变性。图5：缺失主要位于变应原的orf内。已确定了变应原(黑色)和非变应原(白色)的缺失数量。然后将缺失的位置限定为orfin(位于编码序列内)或orfout(位于非翻译区内)。图6：对于影响a、t、c和g重复的缺失而言，变应原(黑色)和非变应原(白色)位于orf内和utr内的缺失数之间的比率。nd：未确定(没有影响变应原中g重复的缺失)。图7：在第33天(a)和第49天(b)对花生的ige抗体应答。小鼠(n＝10只/处理组，每个实验)在第0、7、14和36天通过腹膜内注射接受有或没有lewisx佐剂的花生提取物(400μg蛋白质)或重组arah2(400μg)。通过elisa分析血清样品(第33天和第49天)的特异性ige抗体。数据显示为平均值(±sem)。进行非参数wilcoxon检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001).图8：影响arah2的缺失位置以及ti蛋白质和肽的预测。显示了两种同种型。来自每个同种型的表位以灰色表示，优势免疫表位以黑色表示。竖条指示暗含相同终止密码子的缺失组的位置。对于某些组，显示了序列。转录失真(ti)序列是粗体；表位带有下划线。图表11、12和13还含有这些ti变体的生化和生物信息学特征。参考序列的终止密码子用星号标记。图9：在第33天(a)、第49天(b)对arah2-v36的ige抗体应答；在第33天(c)、第49天(d)对arah2-v38的ige抗体应答；在第33天(c)、第49天(d)对arah2-v40的ige抗体应答。小鼠(n＝10只/处理组，每个实验)在第0、7、14和36天通过腹膜内注射接受有或没有lewisx佐剂的花生提取物(400μg蛋白质)或重组arah2(400μg)。通过elisa分析血清样品(第33天和第49天)的特异性ige抗体。数据显示为平均值(±sem)。进行非参数wilcoxon检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。图10：花生arah1-3和arah5-11转录物中缺口事件的数量(所述缺口事件影响每1000个碱基中orf内a的重复)与花生变应原的发病率之间的相关性。图11：在花生(深灰色)和青豆(白色)的所有转录物位置上计数的影响编码区orf内a、c、g和t碱基重复的缺失的整体rdd率比较。具体实施方式本发明提供了统一的模型，其解释了通过翻译携带特定转录失真(ti)事件的mrna产生的任何给定蛋白质变体如何引起天然免疫球蛋白特异性特性的反常并成为变态反应的起源。更具体地，本发明限定了通过规范碱基配对而转录的rna所翻译的已知变应原不能引发天然免疫球蛋白性质的变更。相反，它们的转录失真(ti)变体显然能够引起这些变更并触发变态反应。本发明还提供了降低各种食物或药物组合物或产品(例如乳汁或乳制品、花生制品、花生、药物制备物等)的变应原性的方法。更具体地，本发明提供了去除和/或化学修饰变态反应触发物的方法，以降低它们引发天然免疫球蛋白性质变化的能力。本发明针对各种形式的变态反应(例如，乳汁、花生、螨变态反应)和在包括人类的各种哺乳动物物种中进行了举例说明。使用鼠变态反应模型，我们意外观察到，当不能诱导ige产生的蛋白质经历了由转录失真导致的缺口修饰时，它就获得了这种能力。这提示了变态反应的分子起源不是产生于经典变应原，而是产生于由转录失真产生的它们的蛋白质变体。为了证实这一假设，我们对牛奶的rna进行了测序，并观察到乳蛋白例如αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白的主要b表位附近存在缺口。我们还证明了由转录失真产生的缺口修饰蛋白质具有阳离子性质。我们因此进行了乳清的分级，以便将它富集在ti产生的阳离子蛋白质中，然后比较富集和贫化的级分诱导ige的能力。引人注目地，并且出乎意料地，以57μg剂量施用的所述富集级分诱导的ige产生与用1.9mg乳清蛋白观察到的相当。相反，57μg的贫化级分没有诱导显著的ige产生。因此，这些结果显示，低丰度的蛋白质变体可以触发ige的产生，该ige通过朝向n末端部分伸展，也结合正常蛋白质。本发明因此公开了变态反应起源的分子机制，并为早期诊断、治疗和预防变态反应以及为调控免疫应答提供了新途径。本发明的目的更具体地在于一种降低组合物的变应原性或免疫原性的方法，所述方法包括处理所述组合物以去除由转录失真产生的蛋白质。本发明的另一个目的在于一种降低组合物的变应原性或免疫原性的方法，所述方法包括处理所述组合物以去除阳离子蛋白质。本发明还涉及可通过上述方法获得的组合物，以及其用途。在本发明的环境中，术语“免疫原性”表示例如组合物或蛋白质或分子在哺乳动物中诱导免疫应答的能力。这包括例如触发抗体产生或t细胞应答、或者刺激或放大现有免疫应答的能力。术语免疫原性包括，例如，变应原性。在本发明的环境中，术语“变应原性”表示组合物或蛋白质或分子在哺乳动物中诱导变态反应的能力。这包括例如触发变态反应、或者刺激或放大变态反应的能力。在特定情况下，变应原性表示在体内诱导或刺激ige产生的能力。“降低”变应原性或免疫原性表明变应原性或免疫原性减小，优选至少20％、30％、40％、50％或更多。在优选实施方式中，“降低”变应原性或免疫原性表示组合物的变应原性或免疫原性降低至少70％、80％、90％或更多。术语“降低”还包括抑制变应原性或免疫原性。“去除”组分意指至少减少所述组分的量，优选与参考物质相比减少至少20％。在本发明的一个具体实施方式中，“去除”组分表示去除所述组分的至少50％、60％、70％或更多，更加优选去除至少80％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一个具体实施方式中，去除包括完全去除组分，其中所生成的物质基本上不含所述组分。“蛋白质”表示包含氨基酸的分子。因此，该术语表示多肽、蛋白质或肽，其可以是天然来源的、纯化的、修饰的、重组的、合成的等等。根据本发明的肽通常含有3至70个之间的氨基酸长度，特别是5至50、5至40或5至30。在本发明的环境中，“阳离子”蛋白质意指等电点为7.4或更高、优选7.6或更高、7.8或更高、8或更高、8.5或更高、更优选9或更高的蛋白质。组合物的“阳离子级分”表示该组合物的含有阳离子蛋白质的级分。术语“变应原”表示能够在哺乳动物中引起变态反应的任何分子。蛋白质变应原表示在其结构中包含氨基酸的变应原。本发明的变应原可选自食物、呼吸、接触或环境变应原，例如花生、蛋、乳汁或螨变应原。花生变应原的例子选自arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11花生蛋白质。术语“转录失真”(ti)是指一种受控机制，通过该机制，dna转录生成具有错误序列的rna分子，其随后导致异常蛋白质。转录失真已被申请人发现并在例如wo2008/009751中描述。ti可以生成具有一个或多个差异的rna。这样的差异可以是例如核苷酸取代、插入和/或缺口(缺失)，其最终生成具有异常序列的ti蛋白。在本发明的环境中特别令人感兴趣的ti蛋白质是ti缺口蛋白质，其包含由在转录期间抑制核苷酸而产生的序列，导致蛋白质具有修饰的c-末端。如本申请的实施例1中所述，申请人意外观察到，当正常不能诱导免疫应答(ige产生)的蛋白质经历了由转录失真引起的缺口修饰时，它就获得了这种诱导免疫的能力。因此，由所述缺口产生的c-末端序列的存在将一种基序引入该蛋白质中，所述基序给予它正常蛋白质不存在的免疫原性(变应原性)性质。为了证实这种机制的重要性，申请人对主要乳蛋白上的所有转录失真事件进行了生物信息学注释。为了精确定义ti事件的出现，我们于是进行了编码乳蛋白的rna的下一代测序(rna-seq)。显然，获得的序列使得有可能准确鉴定乳蛋白中ti的位置，并精确了解ti缺口蛋白的序列(参见实施例2)。特别地，我们鉴定了以下由ti缺口产生并赋予相应的蛋白质变应原性质的肽(表1)：蛋白质肽序列seqidno:csn1s1lwhlfqkclerrrsmn1csn1s2lpafwllplqrirwnmsppvrnlssprkhisrkriwpliparrtfaphsarkl2csn2eafqavrnllhasirklrsfrvrnsskqrmnsrikstplprhsl3csn3fwvprsktknnqyavrkmkdssvtk4paepkstcssawrtvlspskawpasawsgprrwttrpwrnstkpsrpcpctsgcpstqpswrssatsr5继续我们的研究，我们还意外观察到，由rna序列中碱基遗漏(缺口)而导致阅读框架移位所产生的ti蛋白质具有较高的带正电荷碱性氨基酸的含量，而酸性氨基酸的含量则低得多。这导致蛋白质具有阳离子性质。作为说明，下表2中给出了在乳汁中鉴定的ti缺口蛋白的等电点：蛋白质规范蛋白质mw(da)规范蛋白质piti蛋白质mw(da)ti蛋白质picsn1s1227914,5641811,2csn1s2260198,6703213,4csn2292216,61219611,6csn3212696,7490611,4paep198834,7196849,3从该表2可以看出，具有变应原性质的ti缺口蛋白质的等电点也远高于规范蛋白质的等电点。这些蛋白质的这种阳离子性质是有利的，因为它使得特别有可能通过基于等电点的分离技术来去除它们。因此，通过阳离子交换技术，有可能去除等电点高于预定值的蛋白质。于是，有可能通过从中去除阳离子级分来产生低变应原性(或低免疫原性)组合物。在这方面，如实施例3中所证实的，阳离子级分贫化的乳汁没有在体内诱导ige，而阳离子级分导致大量ige产生。本发明因此使得有可能设计新的工具和方法，用于i)所有形式的临床显著变态反应的早期和精确的分子诊断，ii)通过去除阳离子蛋白质或ti产生的蛋白质而产生具有较低免疫原性/变应原性性质的组合物，iii)从某些食物制备物中去除ti产生的阳离子蛋白质，以防止或减少变态反应的发作，iv)去除某些食物制备物的变应原的主要来源，所述食物制备物旨在用于被鉴定为有风险的对象，v)产生新的用于诱导抗体的佐剂，或vi)定义新的脱敏策略，其能够与变态反应的特异性无关地解决所有形式的变态反应。因此，本发明的一个方面涉及通过从产品中去除ti蛋白质或通过从产品中去除阳离子级分来降低产品的变应原性或免疫原性的方法。这种方法可以应用于各种产品，例如食品(例如乳汁，花生)、美容品、饲料、药品等。在这方面，本发明的目的涉及一种制备食品的方法，所述方法包括(i)提供食品制备物，(ii)处理所述食品制备物以从中去除ti蛋白质，优选ti缺口蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的食品。本发明的另一个目的涉及一种制备食品的方法，所述方法包括(i)提供食品制备物，(ii)处理所述食品制备物以从中去除阳离子蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的食品。本发明的另一个目的涉及一种制备美容品的方法，所述方法包括(i)提供美容剂，(ii)处理所述美容剂以从中去除ti蛋白质(优选ti缺口蛋白质)或阳离子蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的美容剂。本发明的另一个目的涉及一种制备药剂的方法，所述方法包括(i)提供药剂，(ii)处理所述药剂以从中去除ti蛋白质(优选ti缺口蛋白质)或阳离子蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述经处理的药剂。在一种优选实施方式中，上述方法包括从产品或组合物中去除由转录失真、甚至更特别地由转录失真缺口产生的阳离子蛋白质。更优选地，所述方法包括去除至少50％的等电点为7.4或更高的阳离子蛋白质。在一种优选实施方式中，所述经处理的组合物含有小于2重量％的等电点高于8的阳离子蛋白质，更优选小于1％，更加优选小于0.5％，小于0.2％，或小于0.1％。例如，我们的分析表明，未处理的乳汁含有约3重量％的等电点高于7.4的阳离子蛋白质。本发明的方法优选去除至少50％的所述蛋白质，从而得到含有小于1.5重量％阳离子蛋白质的乳汁制备物。在一种优选实施方式中，本发明的经处理的乳汁制备物含有小于1％、更优选小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、或甚至小于0.1重量％的等电点高于8的阳离子蛋白质。所述乳汁可以来自任何非人类哺乳动物，例如牛、山羊或绵羊。所述乳汁也可以是人造乳汁。在这方面，本发明还涉及包含食品和合适的赋形剂的食物组合物，其中所述食品含有小于1重量％的等电点高于7.4的阳离子蛋白质，更优选小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。在最特定的实施方式中，所述食品是乳汁、谷物或花生。本发明还涉及包含食品和合适的赋形剂的食物组合物，其中所述食品含有小于1重量％的具有由ti缺口产生的序列的蛋白质，更优选小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。在最特定的实施方式中，所述食品是乳汁、谷物或花生。在一个具体实施方式中，本发明涉及一种制备乳汁或乳制品的方法，所述方法包括去除至少一种包含选自seqidno：1至5的ti缺口肽序列的蛋白质。在另一个具体实施方式中，本发明涉及一种制备花生制品的方法，所述方法包括去除至少一种包含选自seqidno：110至120的ti缺口肽序列的蛋白质。在一个具体实施方式中，本发明涉及一种制备乳汁或乳制品的方法，所述方法包括去除至少一种包含选自seqidno：6至10的序列的蛋白质。在另一个具体实施方式中，本发明涉及一种制备花生制品的方法，所述方法包括去除至少一种包含选自seqidno：121至131的序列的蛋白质。本发明还涉及一种乳汁或乳制品或花生制品，其分别包含小于0.5重量％的包含选自seqidno：1至5或seqidno：110至120的ti缺口肽序列的蛋白质，优选小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。本发明还涉及一种乳汁或乳制品或花生制品，其分别包含小于0.5重量％的包含选自seqidno：6至10或seqidno：121至131的序列的蛋白质，优选小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。本发明还涉及一种包含美容剂和合适的赋形剂的美容组合物，其中所述美容剂含有小于1重量％的等电点高于7.5的阳离子蛋白质，更优选小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。本发明还涉及一种包含药剂和合适的赋形剂的药物组合物，其中所述药剂含有小于1重量％的等电点高于7.5的阳离子蛋白质，更优选小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。本发明还可用于生产变应原性降低的免疫原性制备物，所述免疫原性制备物适用于变态反应性对象的脱敏。在这方面，本发明的目的还涉及制备变应原组合物的方法，所述方法包括(i)提供蛋白质变应原制备物，(ii)处理所述制备物以从中去除阳离子蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述制备物。这样处理的制备物保留了免疫原性，并可用于诱导变态反应性对象的耐受性。然而，这样处理的制备物本身的变应原性降低，不太可能引起不希望的副作用。这样的方法可以用于任何变应原制备物，例如呼吸、接触、食物或环境变应原(即花生、蛋、乳汁、螨变应原等)。所述变应原可以是重组蛋白质变应原或部分纯化的天然变应原。本发明因此还涉及一种包含蛋白质变应原和合适的赋形剂的组合物，其中所述蛋白质变应原含有少于2重量％的阳离子蛋白质，更优选小于1％、小于0.5％、小于0.2％或小于0.1％。本发明还涉及一种治疗对变应原有变态反应的对象以使所述对象对所述变应原脱敏的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的如上定义的组合物。本发明还可用于产生变应原性或免疫原性降低的药物制备物。在这方面，本发明的目的还涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括(i)提供蛋白质药物制备物，(ii)处理所述制备物以从中去除阳离子蛋白质，和(iii)任选用一种或多种合适的赋形剂配制所述制备物。这样处理的制备物保留了药物活性，并可用于治疗对象。然而，这样处理的制备物本身的变应原性/免疫原性降低，不太可能引起不希望的副作用。这样的方法可以用于任何蛋白质药物制备物，例如药物、激素、细胞因子、酶、生长因子等。如前所述，去除阳离子级分或蛋白质可以通过本身在本领域中已知的技术完成。特别地，可以通过使用阳离子交换技术进行分离来去除阳离子蛋白质。用于阳离子交换的合适材料的例子包括，例如，hitrapsp或cm、hiloadsp或cm、或bulksp或cm。在一种具体方法中，所述过程包括(i)将ph调节到期望值(通常在7.4和9之间)和(ii)使所述制备物进行阳离子交换，其中基本上去除等电点高于所调节的ph值的所有物质。在一个具体实施方式中，所述方法因此包括(i)将组合物的溶液调节到包含于7.4和9之间、优选7.4和8.5之间的ph，(ii)使所述溶液经历阳离子交换色谱，和(iii)回收洗脱液。可替选地，或附加于阳离子交换，所述方法可包括利用例如针对转录失真蛋白质的抗体的亲和色谱步骤。这样的抗体可以通过本领域通常已知的方法产生。例如，通过将ti蛋白质或其ti肽、或生物样品的阳离子级分单独或与合适的载体或佐剂结合注射到非人类动物中，可以产生多克隆抗体。在适当的一段时间后，将动物放血，通过本领域已知的技术回收和提纯血清(paul，w.e.“基础免疫学(fundamentalimmunology)”第二版，ravenpress，ny，176页，1989；harlow等，“抗体：实验室手册(antibodies：alaboratorymanual)”，cshpress，1988；ward等(nature341(1989)544)。本发明还涉及一种降低花生的免疫原性或变应原性的方法，所述方法包括降低一种或多种选自arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11的花生蛋白质中的转录失真率。这样的方法可以包括将合成dna核苷酸序列整合到花生籽粒、种子或植物中的步骤，其中所述合成序列限制导致ti缺口的转录失真(ti)率。这样的方法可以替选性地包括下述的步骤：通过使用各种已知的基因工程技术，例如成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)技术，来校正和/或遗传修饰dna序列以限制转录失真率和避免生成ti花生蛋白质变体。在一个具体实施方式中，本发明涉及一种转基因花生植物或其种子或籽粒，其包含转录失真率降低的修饰的arah蛋白基因。所述修饰的基因优选包含修饰的t或a重复序列结构域。本发明还允许开发用于检测对象中的变态反应的方法。对此，本发明还涉及一种用于检测有变态反应倾向的对象的方法，所述方法包括测量来自所述对象的样品中针对具有由转录失真产生的序列的蛋白质的ige水平，其中所述水平与对照值相比的差异指示有变态反应倾向的对象。本发明还允许刺激免疫应答。实际上，所鉴定的ti蛋白或肽显示出增加的免疫原性并可用于诱导或刺激免疫应答，例如作为佐剂。本发明因此还涉及一种阳离子蛋白质或肽，其包含由转录失真产生的序列，用作佐剂以刺激哺乳动物中的免疫应答，特别是刺激抗体产生。本发明特别适于刺激或诱导哺乳动物中的ige产生。所述哺乳动物可以是非人类或人类哺乳动物。本发明还涉及一种诱导或刺激哺乳动物、例如人类中抗体产生的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用具有由转录失真产生的序列的阳离子蛋白质或肽。本发明还涉及一种疫苗组合物，其包含免疫原和具有由转录失真产生的序列的蛋白质或肽。本发明的另一个目的涉及一种产生抗体的方法，所述方法包括(i)向非人类哺乳动物施用由转录失真产生的阳离子蛋白质或肽，(ii)收集所产生的抗体，和(iii)任选从所述收集的抗体衍生单克隆和/或人源化抗体。本发明还有一个目的是提供制备抗ige抗体的方法，所述方法包括(i)在允许诱导抗体产生的条件下向非人类哺乳动物施用由转录失真产生的阳离子蛋白质或肽，(ii)收集所产生的抗体，和(iii)选择结合fc受体的抗体。本发明还涉及包含选自seqidno：1-5或seqidno：74至109或seqidno：110至120的序列的蛋白质或肽，其片段，以及包含这样的蛋白质或肽的组合物。本发明的肽或其片段优选具有低于70个氨基酸残基的长度，更加低于60、低于50、40、低于35或低于30。具体的本发明的肽由seqidno：1-5中任一者或含有其至少10个连续残基的其片段组成。所述片段优选应保持免疫原性或变应原性。本发明还涉及包含seqidno：6-10或seqidno：16至51或seqidno：121至131中任一者的蛋白质。本发明的其他方面和优点将在下面实验部分中公开，所述实验部分是对权利要求的说明。实施例实施例1：变态反应的分子起源的概念的证明申请人拥有经批准的用于对小鼠进行实验的动物设施，并开发和发表了两个临床前小鼠变态反应模型，一个是花生(proust等，2008，intarchallergyimmunol146，212–218)，另一个是牛奶(proust等，2009，europeanannalsofallergyandclinicalimmunology41(3)：85–94)。在牛奶变态反应模型中检验了变态反应的分子起源的假设，其中如果蛋白质是变应原性的，则连续6次胃内施用所述蛋白质(以每周一次的速率)诱导ige产生。选择两种不同的肽来检验该假设：未经历ti事件的正常肽(非ti肽)和ti肽(由转录失真事件产生)。将这两种肽给小鼠施用6周，并随时间跟踪ige产生(图1)。如图1所示，当小鼠暴露于ti肽时，ige合成是大量的，而用非ti肽时则可忽略不计。利用单次腹膜内施用ti和非ti肽，获得相同的结果(图2)。这两个实验显示，ti肽通过它们特定的物理化学性质，在胃内和腹膜内施用中都是ige产生的起源。本实施例说明由转录失真造成的巨大的蛋白质异质性是变态反应触发物的来源。实施例2：乳蛋白质的分析为了获得编码乳蛋白质的rna，我们使用了乳汁中存在的上皮细胞。实际上，这些细胞是研究在牛乳腺中表达的rna的表达的良好替选物(canovas等人，2014，scientificreports4：5297)。我们从农场获得未经处理的prim'holstein牛的乳汁。从该乳汁中纯化上皮细胞。从这些细胞提取总rna。在制备用于illumina下一代测序的文库之前，证实了这些rna的完整性(rna完整性数值(rin)＝7.6)。该rin值与illumina文库的制备相容。我们已经能够证实这两个文库的平均质量指数高于30(文库1：35.6和文库2：35.6)，而且对于这两个文库，94％的读段(reads)的质量指数高于30。所述序列的质量与我们分析所需的标准相容。为了限定ti发生的位置，将获得的读段与bostaurus参考基因组版本umd_3.1.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/82)并与从所述基因组构建的转录组进行比对。首先，我们研究了导致由rna编码的蛋白质序列的最重要修饰的ti差异类型。这是一种缺失，也被称为“ti缺口”(图3)。当rna序列中出现ti缺口时，蛋白质序列就被高度修饰。实际上，碱基缺失导致阅读框的移位，其本身对位于事件下游的蛋白质序列具有严重的后果。引人注目的是，我们发现由转录失真(缺失)产生的蛋白质的羧基末端部分富含碱性氨基酸并且酸性氨基酸贫乏。因此，由ti产生的蛋白质具有阳离子性质。作为概念的证明，我们分析了在allergome数据库(http://www.allergome.org/)中鉴定的主要乳汁变应原的序列。所述变应原列于下表3中。基因描述染色体alb白蛋白6csn1s1酪蛋白αs16csn1s2酪蛋白α-s26csn2酪蛋白β6csn3酪蛋白κ6lalba乳清蛋白，α-5lpo乳过氧化物酶19ltf乳转铁蛋白22paepβ乳球蛋白11表3：牛乳中主要变应原列表用所述序列数据，我们可以估算这些基因在从乳汁分离的细胞中的表达。为此，我们计算了与每个基因比对的读段的数量(rpkm：每百万个映射读取的读段中每千碱基的读段数(readsperkilobasepermillionmappedreads))(mortazavi等人，2008，naturemethods，5(7)：621–28)。结果示于下表4中：表4.编码主要变应原的基因在从牛乳分离的细胞中的表达。表达在2个文库中以rpkm测量。我们选择了在两个文库中的相同位置处高频发生的ti缺口事件。类似地，选择编码具有最富含碱性氨基酸的序列的蛋白质的ti缺口。我们由此能够鉴定乳汁中的以下ti蛋白质(seqidno：6-10)：下划线部分对应于ti缺口肽的序列。为了比较，提供了规范蛋白质的序列(seqidno：11-15)：csn1s1(seqidno：11)mklliltclvavalarpkhpikhqglpqevlnenllrffvapfpevfgkekvnelskdigsestedqamedikqmeaesissseeivpnsveqkhiqkedvpserylgyleivpnsaeerlhsmkegihaqqkepmigvnqelayfypelfrqfyqldaypsgawyyvplgtqytdapsfsdipnpigsensekttmplwcsn1s1_ti(seqidno：6)mklliltclvavalarpkhpikhqglpqevlnenllrflwhlfqkclerrrsmncsn1s2(seqidno：12)mkffiftcllavalakntmehvssseesiisqetykqeknmainpskenlcstfckevvrnaneeeysigssseesaevateevkitvddkhyqkalneinqfyqkfpqylqylyqgpivlnpwdqvkrnavpitptlnreqlstseenskktvdmestevftkktklteeeknrlnflkkisqryqkfalpqylktvyqhqkamkpwiqpktkvipyvrylcsn1s2_ti(seqidno：7)mkffilpafwllplqrirwnmsppvrnlssprkhisrkriwpliparrtfaphsarklcsn2(seqidno：13)mplntiykqpqnqiiihsappsllvlyfgkkelramkvlilaclvalalareleelnvpgeiveslssseesitrinkkiekfqseeqqqtedelqdkihpfaqtqslvypfpgpihnslpqnippltqtpvvvppflqpevmgvskvkeamapkhkempfpkypvepfterqsltltdvenlhlplpllqswmhqphqplpptvmfppqsvlslsqskvlpvpqkavpypqrdmpiqafllyqepvlgpvrgpfpiivcsn2_ti(seqidno：8)mplntiykqpqnqiiihsappsllvlyfgkkelramkvlilaclvalalareleelnvpgeiveafqavrnllhasirklrsfrvrnsskqrmnsrikstplprhslcsn3(seqidno：14)mmksfflvvtilaltlpflgaqeqnqeqpircekderffsdkiakyipiqyvlsrypsyglnyyqqkpvalinnqflpypyyakpaavrspaqilqwqvlsntvpakscqaqpttmarhphphlsfmaippkknqdkteiptintiasgeptstptteavestvatledspeviesppeintvqvtstavcsn3_ti(seqidno：9)mmksfflvvtilaltlpfwvprsktknnqyavrkmkdssvtkpaep(seqidno：15)mkclllalaltcgaqalivtqtmkgldiqkvagtwyslamaasdislldaqsaplrvyveelkptpegdleillqkwengecaqkkiiaektkipavfkidalnenkvlvldtdykkyllfcmensaepeqslacqclvrtpevddealekfdkalkalpmhirlsfnptqleeqchipaep_ti(seqidno：10)mkclllalaltcgaqalivtqtmkgldiqkvagtwyslamaasdislldaqsaplrvyveelkptpegdleillqkwengecaqkkiiaektkipavfkidalnenkvlvldtdykstcssawrtvlspskawpasawsgprrwttrpwrnstkpsrpcpctsgcpstqpswrssatsr我们分析了全基因组并证实所公开的肽不能从牛转录组或基因组中的其它序列产生。如此鉴定的肽和含有它们的全长蛋白质是乳汁变应原。从乳汁中去除这些蛋白质有可能获得低变应原性乳汁。此外，这些蛋白质和肽也可用作佐剂来刺激哺乳动物的免疫应答，特别是刺激抗体产生。实施例3：低变应原性乳汁的产生ti肽的物理化学性质及其在ige生产中的重要性引导我们开发缺乏这些蛋白质的低变应原性婴儿配方奶粉。为此目的，我们进行了乳汁的色谱分离，以产生两种级分：一种富含ti蛋白质，另一种贫化ti蛋白质。初始原料是固相的(乳清粉)。该物质由除酪蛋白外的所有可溶性天然乳蛋白质组成。将所述物质溶于调节至要求值(即ph7.4)的缓冲溶液中。然后通过过滤或离心除去剩余的不溶部分。将所述物质注射在利用aktaxpress色谱系统(gehealthcarelifesciences)的阳离子交换色谱柱(hitrapspff)上。基于每种蛋白质的等电点进行分离。等电点高于ph7.4的蛋白质(即阳离子级分)将与树脂结合，等电点等于或低于ph7.4的蛋白质(即不带电和阴离子级分)将在过流(ft)中洗脱。一旦收集ft，就洗涤柱子。然后从柱中洗脱阳离子级分(其含有等电点高于ph7.4的蛋白质)并通过注入ph7.4的缓冲溶液收集。因此，ft对应于其阳离子级分贫化的初始物质，并被称为产物n°1。产物n°1的主要性质是95％的触发变态反应的阳离子级分已被去除。产物n°1因此可通过一步物理化学分离获得并且是工业相容性的。如果合适，可以进行进一步的处理步骤以基本上去除所有ti蛋白质。这样的进一步处理是使用转录失真抗体(tiab)的亲和结合步骤。更特别地，tiab获自牛血清。简言之，将牛血清热活化，然后通过亲和色谱(基于g蛋白)来纯化总igg。产物n°1与牛tiab一起温育，然后进行基于g蛋白的亲和色谱。总igg，包括与源于转录失真的蛋白质复合的igg，与树脂结合，并且ft含有变态反应触发物完全贫化的物质(称为产物n°2)。根据图1中所示的方案，将产生的级分经由胃内途径施用于小鼠，并随时间追踪ige产生(图4)。图4中呈现的结果显示，暴露于富含ti蛋白的级分的小鼠以大量方式产生ige，而暴露于贫化级分的小鼠产生的ige很少或无。我们因此可以得出结论，1/乳汁中的ti蛋白质确实是乳汁变应原性的起源，2/贫化级分比富集部分的变应原性低得多。因此本发明使得生产低变应原性乳汁成为可能。实施例4：螨变应原分析该分析基于螨变应原和非变应原中ti缺口事件的定位。我们已经意外观察到，ti缺失事件主要存在于编码螨变应原的转录物的编码区(orf-in)内，而在不编码螨变应原的转录物的情况下，ti缺失事件主要在编码区(orf-out)之外。为了进行这项研究，我们通过illumina下一代测序分析了粉尘螨(dermatophagoidesfarina)的rna序列。我们形成了两组序列：(1)已知为变应原的转录物和(2)不是变应原的转录物。如表5中所总结，这两组具有相似的序列特征(例如四种碱基的频率，每个位置的平均覆盖度，覆盖的转录物的长度，外显子数)。表5：编码变应原的转录物与编码非变应原(即，从未被描述为变应原的蛋白质)的转录物的比较。每组包括35种转录物。评价的参数显示两组相似。我们已经在这些转录物中鉴定了转录失真(ti)事件，并且我们比较了两个组，即变应原和非变应原。我们的结果表明，影响变应原序列的ti缺失主要位于编码区内，即orf中，这与影响非变应原序列的ti缺失事件相反，后者主要见于非编码区中(见图5)。我们还分析了编码序列中的缺失数与非编码序列中的缺失数之间的比率，我们观察到变应原编码序列中的缺失优先影响a或t碱基重复序列(参见图6)。受影响的a碱基重复后面主要跟着t碱基，而受影响的t碱基重复后面跟着g碱基；这两种类型的事件，当它们位于orf中时，由此对变应原非常具有特异性。这些事件影响相当部分的转录物，约0.2％至10％，更优选0.2％至5％。对于粉尘螨中的所有ti缺口事件，我们能够鉴定以下ti变应原性蛋白质：seqidno：16-51。序列的下划线部分对应于ti缺口肽的序列，后者也在下文作为seqidno：74至109列出。为了比较，还提供了规范蛋白质的序列(seqidno：52-73)。derf1_iso1(seqidno：52)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhdngyqpnyhavnivgygstqgvdywivrnswdttwgdsgygyfqagnnlmmieqypyvvimderf1_iso1_ti(seqidno：16)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesafwptvtrlwiflnrnssiahlntdvtaiqyqeasntsnkmvslkkeaihtlhennnaddqirnitvsqttakfihqmderf1_iso1_ti(seqidno：17)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrasnimmdeqsfnmtmvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso1_ti(seqidno：18)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhemvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso1_ti(seqidno：19)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhdngyqpnyhavnivgygstqgvdigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2(seqidno：53)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhdngyqpnyhavnivgygstqgvdywivrnswdttwgdsgygyfqagnnlmmieqypyvvimderf1_iso2_ti(seqidno：20)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesafwptvtrlwiflnrnssiahlntdvtaiqyqeasntsnkmvslkkeaihtlhennnaddqirnitvsqttakfihqmderf1_iso2_ti(seqidno：21)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrasnimmdeqsfnmtmvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2_ti(seqidno：22)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhemvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2_ti(seqidno：23)mkfvlaiasllvlstvyarpasiktfeefkkafnknyatveeeevarknfleslkyveankgainhlsdlsldefknrylmsaeafeqlktqfdlnaetsacrinsvnvpseldlrslrtvtpirmqggcgscwafsgvaatesaylayrntsldlseqelvdcasqhgchgdtiprgieyiqqngvveersypyvareqqcrrpnsqhygisnycqiyppdvkqirealtqthtaiaviigikdlrafqhydgrtiiqhdngyqpnyhavnivgygstqgvdigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf23_iso1(seqidno：54)mkfnitiafvslailihssyadidhfdnddqnsstsrpdddpttmidvqtttvqpssmpttsesqstvkpttttvkpspttvklttttvkpttttvkpttttvkpspttvkpttttvkpsptttttttteqpedefecptrfgyfadpkdpckfyicsnweaihkscpgntrwnekeltctderf23_iso1_ti(seqidno：24)mkfnitiafvslailihssyadidhfdnddqnsstsrpdddpttmidvqtttvqpssmpttsesqstvkpttttvkpspttvklttttvkpttttvkpttttvkpspttvkpttttvkpsptttttttteqpedefecptrfgyfadpkdpckfifvqigklyikvvqviqdgmkknderf11_iso1(seqidno：55)msartakymyrssgagasgdisveygtdlgaltrledkirllsddleseremrqrierekaelqiqvmslgerleeaegssesvtemnkkrdselaklrklledvhieseetahhlrqkhqaaiqemqdqldqlqkaknksdkekqkfqaevfellaqletankekltalknvekleytvhelnikieeinrtvieltshkqrlsqentelikevhevklqldnanhlktqiaqqledtrhrleeeerkraslenhahtleveleslkvqldeesearlelerqltkangdaaswkskyeaelqahadeveelrrkmaqkiseyeeqleallnkcsslekq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qidno：76)mvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso1_ti(seqidno：77)igsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2_ti(seqidno：78)fwptvtrlwiflnrnssiahlntdvtaiqyqeasntsnkmvslkkeaihtlhennnaddqirnitvsqttakfihqmderf1_iso2_ti(seqidno：79)snimmdeqsfnmtmvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2_ti(seqidno：80)mvinqtimpstlsvtevhkasiigsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf1_iso2_ti(seqidno：81)igsyetvgiqpgviadtdiskpettsderf23_iso1_ti(seqidno：82)ifvqigklyikvvqviqdgmkknderf11_iso1_ti(seqidno：83)yvinvinwhvktrnlqtilpklnhnderf11_iso1_ti(seqidno：84)tmkyiknleflmneyrnlqlnsnllkicderf15_iso1_ti(seqidno：85)wigsildldwvtrkstnktiwlwlenlktllnlmatcderf32_iso1_ti(seqidno：86)llkkslkkhinigkkderf25_iso1_ti(seqidno：87)gplvlvkqpvhnkhkkfiknfdngflkmfhhklpkqfesfmvvqderf25_iso1_ti(seqidno：88)mfhhklpkqfesfmvvqderf16_iso1_ti(seqidno：89)ykrikvavnfdqirlderf26_iso1_ti(seqidno：90)eisvhfalvkkdlvlnhphfivsypilderf26_iso1_ti(seqidno：91)krwkamahnrvnhprkderf23_iso2_ti(seqidno：92)ifvqigklyikvvqviqdgmkknderf13_iso1_ti(seqidno：93)kvtinlfkhnsvikkderf7_iso1_ti(seqidno：94)lpinsnvmlvfwiskvnderf27_iso1_ti(seqidno：95)miltkfvnqsiqlllmklldkllvvshqlfisrklnsvhhincrkfderf7_iso2_ti(seqidno：96)lpinsnvmlvfwiskvnderf29_iso1_ti(seqidno：97)krwkamahnrvnhprkderf18_iso1_ti(seqidno：98)kpciivpityrhltkderf16_iso2_ti(seqidno：99)ykrikvavnfdqirlderf7_iso3_ti(seqidno：100)lpinsnvmlvfwiskvnderf20_iso1_ti(seqidno：101)cvmwiqimnlsfqhvyvvadhckvihlihaderf20_iso1_ti(seqidno：102)wkkllaniiykyvvlpvntpkvlavftisvinvvwvllnirpskrckmvflnderf20_iso1_ti(seqidno：103)vntpkvlavftisvinvvwvllnirpskrckmvflnderf20_iso1_ti(seqidno：104)tisvinvvwvllnirpskrckmvflnderf1_iso3_ti(seqidno：105)eqvmvllntepdmvslavderf1_iso3_ti(seqidno：106)vahmdhhiqynqpatelvmvtlpiavmptqseknklvlpfsfderf15_iso2_ti(seqidno：107)wigsildldwvtrkstnktiwlwlenlktllnlmatcderf20_iso2_ti(seqidno：108)vvsmilvtndewvspntkllrkckmaslnderf20_iso2_ti(seqidno：109)tndewvspntkllrkckmasln总之，我们由此能够鉴定对螨变应原的编码序列有影响的转录失真(ti)事件，所述ti事件产生导致触发螨变态反应的蛋白质变体。实施例5：花生变应原的分析：转录失真(ti)肽与花生变态反应之间的相关性a–对花生致敏在本实验中，我们在balbc小鼠中每周一次腹腔内注射花生提取物(400μg蛋白质)或重组规范花生蛋白质arah2(400μg)，为期3周，以诱导对花生的致敏(10只小鼠的组)。免疫接种方案根据下图进行：测试的佐剂是lewisx。还测试了不含佐剂的对照样品。然后，我们测量了在开始注射后第33天(参见图7a)和第49天(参见图7b)收集的样品中针对花生提取物的ige速率。我们的结果清楚表明，花生提取物在第33天显著诱导致敏，在第49天甚至更多两倍，而单独的重组规范花生蛋白arah2不能诱导致敏，因为从arah2致敏小鼠获得的针对花生提取物的ige水平与从对照获得的水平相当(如图7所示)。b–重组arah2-ti蛋白的产生及其变应原性的确认我们通过illumina下一代测序分析了花生(arachishypogaea)的arah2rna序列，然后将其应用于顺序免疫接种技术以产生重组转录失真(ti)蛋白质，即，arah2-ti。为了限定发生转录失真(ti)事件的位置，将获得的读段进行比对，并且我们选择了位于arah2表位水平的缺失的转录失真(ti)位置。arah2表位中的这些ti缺失以级联形式存在，如图8所示。我们能够在花生中鉴定出以下ti蛋白质(seqidno：121至131)：arah2-ref1-g11-id30(seqidno：121)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmrksnvtrihmdgtrtalvrirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id31(seqidno：122)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyslvrirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id32(seqidno：123)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsrirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id33(seqidno：124)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsqdpyspsqdpdrrdpyslvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id34(seqidno：125)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsqdpyspsqdpdrrdpyspspydrrgagslstkrgvamsarah2-ref1-g12-id35(seqidno：126)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsqdpyspsqdpdrrdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennkgacarhcnrarah2-ref1-g12-id36(seqidno：127)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsqdpyspsqdpdrrdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqgacarhcnrarah2-ref2-g13-id37(seqidno：128)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsyerdpyspsqdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennkgacarhcnrswrtraigcrggnrsnssrgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id38(seqidno：129)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsyerdpyspsqdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqgacarhcnrswrtraigcrggnrsnssrgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id39(seqidno：130)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsyerdpyspsqdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqrcmcealqqimenqsdrlqgrqqeqqsrgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id40(seqidno：131)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsyerdpyspsqdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqrcmcealqqimenqsdrlqgrqqeqqfkrelrnlpqqcglrahsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiti缺口肽的序列(包含在上述seqidno：121至131的ti花生蛋白质中并加下划线)在图8中以粗体表示，如下：arah2-ref1-g11-id30(seqidno：110)rksnvtrihmdgtrtalvrirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id31(seqidno：111)lvrirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id32(seqidno：112)rirtalvrtrtdvirtalvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id33(seqidno：113)lvhmigealdllstkrgvamsarah2-ref1-g11-id34(seqidno：114)lstkrgvamsarah2-ref1-g12-id35(seqidno：115)kgacarhcnrarah2-ref1-g12-id36(seqidno：116)gacarhcnrarah2-ref2-g13-id37(seqidno：117)kgacarhcnrswrtraigcrggnrsnssrgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id38(seqidno：118)gacarhcnrswrtraigcrggnrsnssrgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id39(seqidno：119)srgssgtclnsaalghhsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayiarah2-ref2-g13-id40(seqidno：120)hsvatwtskvaaetdtkhlsqkkkrkekkiayi为了比较，在下面的seqidno：132和133中提供了规范蛋白质的序列：arah2-ref1(seqidno：132)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsygrdpyspsqdpyspsqdpdrrdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqrcmcealqqimenqsdrlqgrqqeqqfkrelrnlpqqcglrapqrcdlevesggrdryarah2-ref2(seqidno：133)marqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrdedsyerdpyspsqdpyspspydrrgagssqhqerccnelnefennqrcmcealqqimenqsdrlqgrqqeqqfkrelrnlpqqcglrapqrcdldvesggrdry然后，我们产生重组蛋白质并测量针对变体36、38和40的ige(所述变体36、38和40对应于seqidno：127、129和131的ti蛋白质，分别包含seqidno：116、118和120的ti缺口肽)。我们使用了之前描述的balbc小鼠(参见图9)。因此，图9显示对花生的致敏诱导特异性针对变体-40而非针对变体-38的ige反应性。变体-40含有在变体-38中不存在的2个表位(表位8和9)。将arah2的重组变体注射到balbc小鼠中以诱导对花生的致敏。阴性对照是arah2重组规范蛋白，其不诱导致敏。本实施例使得表明，重组规范arah2蛋白(在本领域中被认为是“变应原”)完全没有变应原性。相反，重组arah2-ti蛋白是高度变应原性的。总之，只有由转录失真(ti)缺失事件引起的arah2-ti蛋白变体才是花生变态反应的起源。c–花生变应原的发病率关于各种花生变应原的变态反应发病率的百分比数据在文献中是已知的(critrevfoodscinutr.2013，peanutallergens：sáizj1，montealegrec，marinaml，garcía-ruizc)，如表6中所总结。变应原发病率(％)arah190arah290arah350arah513arah638arah743arah870arah945arah1021arah1121表6：花生变应原的发病率在本实验中，我们通过illumina下一代测序分析了arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11的mrna以鉴定转录失真缺失事件。然后我们选择a碱基重复序列中存在的缺失，并报告相对于转录物尺寸所鉴定的缺失数。我们对已知花生变应原发病率(来自表6)的分析和比较结果在图10中显示。该图清楚地表明了ti缺失事件(即，每1000个碱基中影响orf内a重复序列的缺口事件数)与花生变应原的发病率之间存在强相关。这两个变量——发病率和a重复序列中的缺失——之间的相关性有非常高的显著性(rhospearman＝0.68；p-值＝0,003)。总之，arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11花生蛋白的变应原性与转录失真(ti)事件严格相关，因此花生变态反应是由于因转录失真缺口事件引起的arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10和arah11的ti变体的产生。实施例6：强变应原性花生和基本上无变应原性的青豆中的ti事件的比较本研究涉及花生(其是强变应原性的)中和另一种豆科植物如青豆(基本上是无变应原性的)中的转录失真(ti)缺失事件现象的比较。为了比较这两种植物中的ti现象，所述ti现象影响不同尺寸的转录物并且转录物的表达也变化，我们使用(rna-dna差异)rdd率的测量，所述rdd率通过基于与参考序列的比较而鉴定rna序列中的序列变异来计算，并表示为在所有转录物位置上计算的缺失率(如下表7中所示)。表7：通过基于与参考序列的比较来鉴定rna序列中的变异而计算rdd率、并表示为在所有转录物位置上计算的缺失率的实例我们比较花生中和青豆中的rdd率的结果清楚地表明，花生中的与ti缺失事件相对应的总rdd率显著高于绿豆中的与ti缺失事件相对应的总rdd率，特别是关于编码区(orf)中存在的影响a或t碱基重复序列的ti缺失事件。如图11所示，这些差异非常显著(wilcoxon检验p值<0,001)。以上数据进一步证实，在变应原性花生蛋白质中高度存在的ti缺失事件必然是花生变态反应的起源。当前第1页12