通过共分级分离鉴定配体的制作方法
在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文献的公开内容虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但在此通过引用整体并入。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的文献被具体和单独地指出通过引用并入。
近年来在所谓的“组学”技术方面取得了重大进展，允许同时定量数千种生物分子，包括转录物，蛋白质和代谢物(joyce&palsson,nat.rev.mol.cellbiol.7,198–210(2006))。这些分子是生命的构件，但正是它们的相互作用才使得生命成为可能。因此，分子复合体大规模的分析是下一个需要解决的重大挑战之一。其中，考虑到小分子的多样性，特别是当用作诱饵时的检测，鉴定和固定，蛋白质-代谢物相互作用组(pmi)的分析特别麻烦。然而，pmi在学术研究和药物发现方面的重要性推动了pmi分析方法的发展(lietal.,cell143,639-50(2010)；savitskietal.,science346,1255784(2014))。通常，现有方法包括使用小分子作为诱饵来“剔除”相互作用蛋白质的方法(maedaetal.,nat.protoc.9,2256-66(2014))orviceversa(hulceetal.,nat.methods10,259–264(2013)；reinhardetal.,nat.methods12,1129-1131(2015))。当已知至少一个相互作用配偶体时，此类测定提供了表征蛋白质-代谢物复合体的有效方法。然而，它们受到限制，因为它们仅允许检测一对一的相互作用。
生物活性化合物(包括药物)是小分子，其通过将系统状态调节到所需方向而在给定生物系统中发挥所需功能。它们代表了制药，农用化学和生物工程工业(生命科学工业)的关键成分，每年的营业额超过1万亿欧元。
为了开发生命科学市场的新药，需要克服在开发和市场进入阶段以及早期发现阶段的许多障碍。
至于发现阶段，按照两种主要途径之一获得新的基于小分子的药物的先导：(1)将许多小分子应用于给定的生物系统，并监测系统/其表型的反应。诱导所需反应/表型的小分子经化学优化，并阐明其在生物系统中的分子靶标。(2)鉴定需要调节的大分子靶标(在大多数情况下是蛋白质或rna)，以达到系统/表型的所需反应。在第二种方法的情况下，关键的挑战在于鉴定以期望的方式影响目标大分子活性的小分子。为此，使用高通量筛选(hts)筛选高达数百万种不同化合物的综合(化学)文库调节靶活性的能力。
这种鉴定能够调节大分子靶活性并因此用作开发最终药物的先导化合物的化合物的方法存在两个缺点。
(1)通常，应用研究中的生物系统的外源化合物。实例是由数百万化学合成的化合物或天然化合物(文库)组成的化合物文库，其在大多数情况下衍生自不同的生物系统(例如植物或微生物)。相反，制药工业中的目标生物是人类和兽医工业中的动物(主要是哺乳动物)。较少使用内源性化合物作为先导化合物的原因是对人体系统中存在的调节大分子实体如蛋白质，rna等活性的内源性化合物的了解非常有限。
(2)如上所述，已开发出hts，其允许筛选数百万种化合物的调节给定靶标大分子(蛋白质，rna)活性的能力。尽管其具有高通量性质，但该过程是耗时的并且通常通过在离散测定中测试一种接一种化合物来完成。直到最近，才引入了允许测试化合物混合物的新方法。依赖于向化学化合物添加dna标签的示例性程序(参见例如mullard,nature530,367-369(2016)被证明是主要优点，但是它存在两个固有问题：(i)它仅适用于化学合成的化合物库；和(ii)dna标签的添加导致化合物结构发生变化，从而在筛选过程中导致假阴性和假阳性。就第一个限制而言，这意味着在筛选中具有最高命中率的天然化合物被排除在外。
鉴于现有技术的缺点，本发明的技术问题可见于提供改进的或替代的手段和方法，用于阐明生物系统中的分子间相互作用或鉴定生物大分子的调节剂。
在第一方面，本发明涉及测定大分子配体的方法，所述方法包括或组成为(a)使包含(i)由所述大分子和所述配体形成的复合体和(ii)未结合的配体的样品进行分离所述复合体与所述未结合的配体的方法；(b)从步骤(a)中获得的复合体中释放配体；(c)将步骤(b)中得到的释放的配体进行化学分析方法，从而确定所述大分子的所述配体。
根据本发明的术语“配体”表示能够结合本发明的大分子的分子，大分子在下面进一步定义。在配体和大分子之间发生化学和/或物理-化学相互作用的意义上，配体与大分子的结合是直接的。所述化学和物理-化学相互作用优选选自偶极-偶极相互作用，偶极-电荷相互作用，电荷-电荷相互作用，范德华相互作用，疏水相互作用，堆积相互作用和共价相互作用。一般而言，配体和大分子之间的相互作用可以是共价的或非共价的。优选非共价相互作用。
一般而言，但不是必须的，就其分子量而言，配体比大分子更小，优选至少小一个数量级。
配体可以是同源配体。术语“同源配体”表示在生理或体内条件下与大分子相互作用的配体，该配体通常由给定生物系统的生物合成机器形成。根据本发明的配体可以是同源配体，但不一定是这样。例如，可以发现异生化合物，即天然不存在的化合物，特别是在体内环境中不存在的化合物，是大分子的配体。
然而，预期内源性化合物即同源配体具有许多优点，例如较低的毒理学和较高的特异性，因为它们是所研究的生物系统内进化选择的结果。
就结合强度而言，优选配体-大分子复合体的解离常数kd在或低于两位数微摩尔范围，即小于100μm。优选地，kd小于10μm，小于1μm，小于100nm，小于10nm，小于1nm，小于100pm，或小于10pm。
术语“未结合的配体”是指不与大分子结合的配体。该术语包括不能与经受根据第一方面的方法的样品中存在的任何大分子结合的分子。此外，该术语在其最广泛的意义上延伸至那些能够结合大分子但不以结合形式存在的分子，例如出于热力学原因，例如过量存在相应的配体。
在一个优选的实施方案中，术语“未结合的配体”仅表示那些不能结合样品中存在的任何大分子的分子，无论大分子和配体的量如何。这些是通常小于大分子(如上所述)的分子，其不与样品中包含的大分子相互作用。
根据本发明的大分子是在分子量方面大于上述定义的配体的分子。通常，大分子显著大于配体，优选大一个，两个或更多个数量级。术语“数量级”对应于因数10。优选生物大分子。生物大分子是生物系统中存在的大分子。生物大分子通常是较小结构单元的聚合物或缩聚物。特别优选的大分子类型是多肽。还优选核酸。核酸包括dna和rna，rna是优选的。
严格地说，术语“大分子”表示单个分子。从更广泛的意义上讲，术语“大分子”也包含更复杂的分子结构。更复杂的结构的实例包括那些分子或分子组装，其中多于一种聚合物或缩聚物彼此结合。两种或更多种聚合物或缩聚物彼此连接的方式可以是共价的和/或非共价的。根据本发明也属于术语“大分子”的共价分子组装的实例是胰岛素。如本领域所知，胰岛素包含两条通过二硫键连接的多肽链。同样满足根据本发明的术语“大分子”的要求的非共价分子组装的实例是血红蛋白，其是α2β2非共价异四聚体。因此，应理解术语“大分子”包括彼此相同或彼此不同的聚合物或缩聚物的二聚体，三聚体，四聚体，五聚体，六聚体和更高级的寡聚体，从而分别产生同寡聚体或异寡聚体。同样在该特定背景下，优选那些为多肽的缩聚物。
术语“大分子”也延伸到细胞器，特别是那些有时被称为“小细胞器”的细胞器。小细胞器包括蛋白酶体和核糖体。因此，应理解术语“大分子”延伸至包含多肽和核酸(在核糖体rna的情况下)的那些大分子组装。该术语还包括主要的细胞器，如线粒体和叶绿体。
应注意，配体和大分子可具有相同的化合物类别，但优选它们的分子量相差至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，更优选至少100倍。例如，配体可以是肽，大分子是多肽。话虽如此，还设想研究配体-大分子相互作用，其中配体和大分子仅具有不同的分子结构。这将适用于这样的情况，其中研究了天然不是肽的小有机分子配体对蛋白质大分子的结合能力。
术语“样品”不受特别限制。下面更详细描述的优选实施方案包括无细胞细胞提取物。由于如上所述的术语“大分子”的定义，样品不必是透明液体，但也可以是透明液体。而且，它可以是大分子组装体和/或细胞器的悬浮液。
除复合体和配体外，所述样品可包含无配体的大分子，也称为未结合的大分子。
我们注意到，根据第一方面的方法，在其最广泛的定义中，不需要使大分子与配体接触。事实上，所述样品可能来自细胞，组织或生物。在这些生物系统中，通常存在大分子和配体，配体包括或限于样品中存在的大分子的同源配体。因此，应理解，在优选的实施方案中，排除使大分子与配体接触的任何步骤。
尽管如此，但并未排除在使大分子和候选配体进行根据第一方面的方法之前将其有意地聚集在一起。
第一方面的方法的步骤(a)定义了分析方法。步骤(a)可以是，但不必在列中执行。下面描述根据步骤(a)的优选方法。重要的是，步骤(a)的方法提供将未结合的配体与结合的配体分离，结合的配体以所引用的复合体的形式存在。
通常，但不是必须的，与复合体和未结合的大分子相比，配体一方面具有小的分子量。因此，在除去所述配体后，步骤(a)可以产生复合体和未结合的大分子的混合物，达到后者存在的程度。
一旦未结合的配体与复合体分离，根据第一方面的本发明方法继续从大分子释放配体。
鉴于在步骤(a)中已经除去了未结合的配体，因此步骤(b)中得到的混合物仅含有那些最初以复合体形式存在的配体，即与大分子结合的配体。
第一方面的方法的步骤(c)提供了确定所述配体。优选的化学分析方法如下所述。特别优选的是质谱(ms)。
根据第一方面的方法既不限于单个配体或少量配体，也不限于单个大分子或少量大分子。相反，可以用第一方面的方法方便地阐明和绘制复杂的配体-大分子相互作用网络，例如蛋白质-代谢物相互作用组(pmi)。偏离现有技术，并且非常令人惊讶地，这是在不需要特定蛋白质诱饵或配体诱饵的情况下完成的。
本发明利用了这样的观察结果：在小分子为大分子的配体的程度内，当根据大小分离时，小分子与大分子共洗脱。为此，选择本发明方法的步骤(a)的条件，使得所述复合体保持稳定。通常对上面给出的优选解离常数值给出稳定性。合适的条件包括水溶液，例如缓冲的水溶液。
根据本发明第一方面的方法，在其最广泛的定义中，不需要确定所述的大分子。然而，该方法赋予了明显的优点。例如，并且就使用作为测试化合物的配体而言，即其结合特性可能是未知的化合物如异生化合物的化合物，根据第一方面的方法提供了关于哪种类型的化合物与大分子结合的信息。在该上下文中，“化合物的类型”是指诸如化学结构，官能团的存在，logp值等性质。换句话说，根据第一方面的方法提供了在化学空间中定义子空间，其中所述子空间的特征在于它包含那些更可能是大分子配体的测试化合物。这对于测试化合物文库的设计是有价值的信息，此类文库为某些类型的生物大分子或一般的生物大分子定制。
在一个优选的实施方案中，所述配体(i)是天然存在于生物系统中的配体，例如代谢物，肽，脂质和核酸，包括小rna和寡核苷酸；(ii)是测试化合物；(iii)具有约50da至2000da的分子量；和/或(iv)是小有机分子。
示例性代谢物包括甘氨酰脯氨酸，fad，camp，核黄素，fmn和nad。“camp”包括2',3'camp和3',5'camp。实施例8说明了本发明用于鉴定2’,3’camp作为生物大分子配体的用途。
根据项目(i)的小rna包括微小rna和小干扰rna(sirna)。典型的sirna分子描述于wo02/44321和其中引用的参考文献中。
根据本发明的术语“测试化合物”是功能名称。这意味着，在进行本发明的方法之前，不知道所述化合物是否与任何大分子结合。测试化合物可以是合成来源的。它可能是一种异生化合物，但并非必须如此。因此，根据第一方面的方法可用于筛选目的，特别是用于鉴定先前未知的配体。
根据该优选实施方案的项目(iii)的优选分子量范围为100da至1000da。
术语“小有机分子”具有其本领域确定的含义，并且是指包含碳原子并且还包括一个或多个以下原子的分子：氢，氧，氮，硫，磷和卤素，例如f，cl和br。“小”表示根据项目(iii)的分子量。
在进一步优选的实施方案中，所述生物系统是细胞，组织，生物体，取自生物体的样品，生物体分泌的组分或环境样品。所述样品也是根据本发明第一方面的方法的步骤(a)的优选样品。优选地，所述生物系统是样品来自的来源。
优选地，所述细胞是分离的细胞，体外细胞，离体细胞或培养细胞。
优选地，所述组织是离体组织，先前取自生物体或人造组织的组织样品。
所述生物可以是包括人在内的哺乳动物。它也可能是非人体生物。
已经说过，应该理解，所述的生物系统本身并未通过本发明的方法处理。相反，在所述优选类别的配体是源自生物系统的那些配体的意义上，生物系统用于定义优选类别的配体。
优选地，所述环境样品是包含生物材料的样品，例如来自包含其中存在的生物的一段水域的样品或包含其中存在的生物的土壤样品。
在一个优选的实施方案中，步骤(c)中测定的配体是用于开发大分子的调节剂例如，抑制剂或活化剂的候选先导化合物。
如本领域已知的，特别是在药理学领域中，可以开发或优化曾经已知能够结合被认为是治疗性靶分子的大分子的分子，以便最终产生药物。用于这种开发或优化过程的起始化合物也被称为先导化合物。
在优选的实施方案中，当使用测试化合物时，步骤(c)中测定的配体是能够结合一种或多种所述大分子的测试化合物。
如上所述，在优选的实施方案中，第一方面的方法可用于筛选目的，即在测试化合物中鉴定能够结合大分子的那些。能够结合的那些根据本发明称为“配体”。
在进一步优选的实施方案中，所述大分子是(1)蛋白质，核酸，膜和/或大分子组装体，例如细胞器；和/或(2)(i)蛋白质组或rna组；(ii)包含在细胞提取物中，所述细胞提取物优选为细胞裂解物；或(iii)由核酸文库编码的蛋白质，或核酸文库编码的核酸，优选rna。
优选地，所述细胞裂解物是无细胞的。例如，它已经过离心以除去不溶物质。优选地，它不经过进一步纯化。
术语“蛋白质”包括多肽，但不限于此。多肽是单个连续的氨基酸链。蛋白质可具有更复杂的结构，例如相同或不同多肽的同或异寡聚体(详情参见上文)。就组成单体结构单元而言，优选20种蛋白原性α-氨基酸。尽管如此，也可以存在其他α-氨基酸，例如2-氨基-丁酸，吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸。可以存在一种或多种β-氨基酸和/或d-氨基酸代替α-氨基酸。
氨基酸可以衍生化。这可以是天然存在的翻译后修饰形式，例如磷酸化或糖基化，或者可以在合成制备的氨基酸或多肽中人工实现。后者的实例包括o-甲基-丝氨酸。多肽链的c-末端可以被酯化，例如，用c1-c4链烷醇和/或n-末端酰胺化，例如，用c1至c4伯链烷胺。
术语“核酸”包括dna和rna。术语“核酸”也延伸至具有骨架的分子，所述骨架不是经典的糖-磷酸骨架。实例是肽核酸(pna)。在核酸中，可以修饰核碱基。糖也可以被修饰，特别是在核糖核苷酸中，例如在2'位，例如用o-甲基或氟修饰。也可以使用锁定核苷酸(lna)。
如上所述，术语“大分子”包括大分子组装体。这些又可包含蛋白质，核酸和脂质中的一种或多种。提到的膜可以是封闭的囊泡。膜和囊泡可包含一种或多种蛋白质，特别是跨膜和/或膜相关蛋白质。
术语“蛋白质组”具有其本领域确定的含义，并且是指给定细胞器，细胞，细胞类型，组织或生物体中的表达蛋白质的完整集合。因此，可以分析非常复杂的混合物，并且可以用本发明的方法阐明复杂的相互作用网络。已经分析了完整的蛋白质组，这在随附的实施例中显示。
类似地，术语“rna组”具有其本领域确定的含义，并且指的是给定细胞，细胞类型，组织或生物体中的rna的完整集合。
与上述相关，可以方便地分析复杂样品。复杂样品的一个例子是细胞提取物。细胞提取物可以通过破碎细胞而仅仅除去不溶性物质来获得，例如，通过离心，然后优选直接对剩余的无细胞细胞提取物用第一方面的方法进行分析。这是方便的，因为任何进一步的纯化通常是不必要的。这是有利的，因为避免了可能由附加步骤引起的任何材料偏倚或损失。令人惊讶的是，根据第一方面的方法可以方便且成功地处理这种相当粗糙和复杂的样品。
在分析天然存在的蛋白质混合物(例如蛋白质组)的备选方案中，大分子可以是使用异源系统或化学合成合成的蛋白质，例如由核酸文库编码并在合适的微生物中表达的蛋白质。
在优选的实施方案中，(i)所述级分覆盖约10kda至约10000kda的分子量范围；和/或(ii)收集2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个级分。
该优选实施方案要求所述方法产生级分。这可能是尺寸截止的结果，或者是根据步骤(a)的样品中包含的化合物的分离性质，特别是配体，大分子和由配体和大分子形成的复合体的分离性质是它们的大小和/或电荷的连续的功能。
如果没有另外说明，可以理解，当不包含在复合体中时，大分子是不含配体的。
一般而言，分子量范围优选根据应用类型进行调整。当整个蛋白质组，特别是未知或部分未知的蛋白质组关于它们的相互作用配偶体进行表征时，所述的10kda至10000kda的范围是有用的起点。其他优选的范围是10kda至1000kda和10kda至600kda。
关于级分的数量，还要注意随附的实施例。在10至50的程度内，例如收集15,20,25,30,35,40或45个级分，可以获得配体的综合洗脱图。关于术语“洗脱图”，我们参考下面公开的优选实施方案。
在步骤(b)中使多个级分经受释放的程度，并确定每个所述级分的给定配体的量，获得所述给定配体的洗脱图。洗脱图是一个数据集，可以显示为载体，表格或二维图，其中配体的数量取决于被分析样品中包含的复合体的分离性质而存在，分离性质优选为大小。洗脱图在实施例中描述并显示在图中。在洗脱图中观察多峰分布通常表示多种大分子与给定配体结合。术语“洗脱图”和“分级分离图”在本文中等同使用。
在进一步优选的实施方案中，通过如本文所述的化学分析方法，特别是ms，蛋白质组学分析，nmr光谱测定，测序(核酸和/或蛋白质测序)或通过抗体检测来确定一种或多种大分子。更详细地说，并且指的是作为蛋白质的大分子，可以使用ms与lc或maldi偶联鉴定消化的蛋白质，或使用合适的质谱仪器或其他蛋白质鉴定方法(如通过抗体检测，nmr或蛋白质测序)对完整蛋白质进行鉴定。例如，在用特异性蛋白酶或非特异性化学物质切割蛋白质后，优先对它们进行ms/ms分析，以进行(i)在修饰蛋白质或基因组未测序的生物体的蛋白质组的情况下从头测序，或(ii)通过对可用数据库搜索进行鉴定。
确定大分子优选包括确定与配体结合的大分子和未与配体结合的大分子。
一旦大分子结合配体，大分子和配体将共洗脱或共分级分离，这两个术语在本文中等同使用。通过分析共分级分离或共洗脱行为，确定哪种配体与哪种大分子结合。统计方法可用于该目的。
如本文所用，“测定”是指阐明化学结构和/或组成，并且可包括定量。
在一个特别优选的实施方案中，确定哪种配体结合哪种大分子，优选通过测定根据本发明的每种级分中给定大分子的量，并比较配体的分级分离图或洗脱图与获得的分级分离图或大分子的洗脱图。
该优选实施方案提供了在确定相互作用分子的身份的意义上阐明一种或多种大分子-配体相互作用。
换句话说，本发明提供了一种测定配体和大分子之间复合体的方法，所述方法包括或组成为(a)使包含(i)由所述大分子和所述配体形成的复合体和(ii)未结合的配体的样品进行将所述复合体与所述未结合配体分开的方法；(b)从步骤(a)中获得的复合体中释放配体；(c)将步骤(b)中得到的释放的配体进行化学分析方法，从而确定所述大分子的所述配体，(d)通过化学分析方法测定一种或多种大分子，和(e)确定哪种配体结合哪种大分子。
在大分子的复杂混合物中，例如细胞裂解物中，由于大分子复合体的类似流体动力学体积，某些大分子可以在给定的分离方法(例如sec)中沿着几个级分紧密共洗脱。步骤(c)中特定级分的释放的小分子的最可能的大分子相互作用配偶体是具有与配体最相似的洗脱图的配偶体。
为了找到所述大分子中各个配体的类似洗脱图，可以在视觉上比较洗脱图。优选地，它们经受数学分析，更具体地是统计分析，优选地在适当的和本领域建立的数据转换之后，例如缩放和/或居中。洗脱图的数学分析通常包括通过在表示洗脱图的矢量之间应用各种距离测量(如欧几里德距离，曼哈顿距离等)来识别与相关或类似图的因果关系。这种共洗脱(或共分级分离)分析的结果可以显示为列表，二维图或网络(参见图4)。具有最高相关系数或与特定配体的最小距离的大分子代表最可能的相互作用配偶体。
上述公开的优选实施方案，即确定哪种配体结合哪种大分子直接提供关于所述样品中哪种大分子最初与配体结合的信息。换句话说，在未结合的大分子(如果存在的话)和在本发明的方法开始时与配体结合的大分子之间提供了区别。那些与配体，优选低分子量配体，即分子量小于或等于各自大分子分子量的十分之一的配体结合的大分子是具有升高的可成药概率的大分子。在这种情况下，“升高的”意味着与给定样品中存在的所有大分子相比具有统计学上显著的差异。为了进一步解释，开发用于大分子例如蛋白质的药物的关键问题是靶标的“可成药”问题，即其通过小分子调节其活性的一般可及性。通过确定给定生物系统中存在的一种，多种或所有大分子-配体复合体，将鉴定那些可成药的大分子，从而促进可成药靶标的进一步开发和选择。
因此，本发明还提供鉴定可成药大分子的方法，所述方法包括或组成为(a)使包含(i)由所述大分子及其配体形成的复合体和(ii)未结合配体的样品进行分离所述复合体与所述未结合的配体的方法；(b)从步骤(a)中获得的复合体中释放配体；(c)将步骤(b)中得到的释放的配体进行化学分析方法，从而确定所述大分子的所述配体，(d)通过化学分析方法测定一种或多种大分子，和(e)确定哪种配体结合哪种大分子，其中结合配体的大分子是可成药的大分子。
上述公开的鉴定可成药大分子的方法中所述的配体优选是同源配体。换句话说，它们是天然存在的配体。因此，与上述进一步公开的方法类似，它是鉴定可成药分子的方法的优选实施方案，排除使大分子与配体接触的任何步骤。事实上，当要研究天然存在的大分子-配体相互作用时，这种接触被认为是不必要的。
可以延长上面公开的共洗脱行为的分析。除了根据主要实施方案的步骤(a)的给定分析方法之外，这种更复杂的方法通常还涉及一种或多种其他分析方法。换句话说，根据该优选实施方案，本发明的方法可包括至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少15种，或至少20种不同的分离方法，优选层析分离方法。
更具体地，该优选实施方案的可能实施包括重复进行根据第一实施方案的方法，其中对于每次重复，使用不同的层析方法和/或不同的层析材料。优选的层析方法和材料在下面进一步详述。
备选地或另外地，可以实施本发明的主要实施方案的方法的步骤(a)，使得包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少10个，至少15个，或者至少20种不同的分离方法。在这种情况下，并且偏离上述实现，这不等于并行执行不同的层析，而是随后进行不同的层析，其中将第一层析的结果进料到第二层析中。如上所述，可以组合这两种方法。
使用不同的分离原理和/或不同的层析树脂进行一次以上的分离，然后通过一种以上的分离方法确定共洗脱行为，减少了大分子-配体对的潜在候选物的数量。优选的方法使用至少2种和至多20种不同的层析分离，并使用大分子和配体的洗脱行为的统计分析来确定最可能的大分子-配体复合体。
上述公开的优选实施方案被认为特别适用于要分析非常复杂的混合物的那些情况。特别复杂的混合物可以确定哪种配体难以与哪种大分子结合。
在这种情况下，作为上述优选实施方案的补充或替代，可以分析一种以上的样品。这些不同的样品可以取自一种给定生物的不同细胞类型或不同组织类型，或者可以是给定植物的不同部分的提取物。出现在多个不同样品中的那些配体-大分子相互作用是那些具有更高的实际发生可能性的相互作用。
在整个大分子限定蛋白质组并且配体是与所述蛋白质组中的大分子结合的天然存在的分子的程度上，第一方面的方法提供了获得蛋白质-代谢物相互作用组(pmi)。
确定给定生物系统的pmi相对于现有的先导鉴定和药物开发方法提供了许多优点。
首先，了解pmi定义了该生物系统的可成药蛋白质以及与可成药蛋白质结合的配体的化学空间。这有助于为药物开发选择更好的目标以及为药物开发提供先导化合物。
在优选的实施方案中，进行比较不同组织例如患病组织与健康组织的pmi。这允许识别仅在患病细胞中发生的相互作用。这些提供直接获得药物开发，专门解决患病细胞中的可成药靶标。示例性疾病是癌症。
在另一个优选的实施方案中，分析叶绿体的pmi并与其他pmi进行比较。叶绿体特异性pmi允许开发植物特异性除草剂。
术语“蛋白质-代谢物相互作用组”表示天然存在于生物系统中的蛋白质与小分子之间发生的全部相互作用。这是一个本领域成熟的术语。术语“代谢物”是指代在生物系统中发生并通过所述系统中酶的作用产生的小分子的通用术语。小分子包括但不限于氨基酸，肽，核苷，核苷酸，寡核苷酸，单糖，二糖，寡糖，脂肪酸，单酰基甘油，二酰基甘油，三酰基甘油，磷脂和代谢的中间体，例如在糖酵解或糖异生中发生的c6和c3分子，三羧酸，丙酮酸，乳酸；此外还有辅酶，辅因子和辅基。
在进一步优选的实施方案中,(i)步骤(a)的所述方法根据大小和/或电荷分离复合体和未结合的配体，并且优选是大小过滤，大小排阻层析(sec)，电泳，离心，热泳(thermophoresis)和/或场流分级法(fff)；和/或(ii)所述化学分析方法是质谱(ms)，核磁共振(nmr)，测序和/或通过抗体检测。
如上所述，在第一方面的方法的步骤(a)中使用的方法可以根据大小提供分析物的分离。分离可以使得小分子比较大分子更快地通过。或者，大分子可以比小分子更快地通过。分析物越大，大小过滤可以在越大的程度上保留分析物。另一方面，当分析物较小时，大小排阻层析法提供分析物的较高程度的保留。用于进行大小过滤和大小排阻的优选装置和基质在本领域中是公知的。在随附的实施例中提及示例性或优选的材料和装置。
在一个实施方案中，术语“大小”是分子量。在其他实施方案中，“大小”是表观大小，表观大小是在给定分析方法据以发生分离的参数。表观大小可以是流体动力学体积。表观大小和分子量将相关，相关性优选由单调函数控制。表观大小和分子量可能重合。优选地，大小是分子量。
在电泳中，较小的分子迁移得更快。已经说过，必须注意的是，另外，给定分析物的电荷状态控制给定分子的电泳迁移率。
离心提供更大的分析物的更快速沉降。
在热泳中，分子根据soret系数分离，soret系数是大小，水合外层和电荷的函数；见，例如duhrs,braund.whymoleculesmovealongatemperaturegradient.procnatlacadsciusa.2006dec26；103(52):19678-82.epub2006dec12.pubmedpmid:17164337；pubmedcentralpmcid:pmc1750914。
场流分级法(fff)是一种分离方法，其中将场施加到流体悬浮液或溶液。将悬浮液或溶液泵送通过通道。垂直于通过该通道的流动方向，应用所述场。在该上下文中术语“场”相当宽并且可以是电场，磁场，离心场，热梯度或通过半透膜的流动。因此，控制fff分离的分子性质也可以变化。通常，将具有大小/流体动力学体积和/或电荷的函数。
根据本发明特别优选的是大小过滤和大小排阻层析。
在进一步优选的实施方案中，所述配体是非共价配体。
在一个特别优选的实施方案中，并且在所述配体是非共价配体的程度上，步骤(b)中的所述释放是通过所述复合体的变性实现的。
一旦完成第一方面的方法的步骤(a)，就从混合物中除去未结合的配体。然而，配体仍然存在，只是到它们与大分子结合的程度。为了最终确定所述配体，必须从复合体中释放它们。优选的手段是变性。变性干扰大分子的三维结构，包括它们结合给定配体的能力。
在一个特别优选的实施方案中，所述变性通过(ba)加热，优选加热至100℃；(bb)加入变性化学品，如包括尿素和盐酸胍的离液化合物和包括sds的去污剂；(bc)加入干扰配体-大分子相互作用的有机溶剂，如丙酮和乙腈；和/或酶促和/或化学裂解所述大分子来实现。可以进行酶促切割；例如，用胰蛋白酶。
这些变性的手段和方法是本领域确立的。一般而言，任何本领域已建立的用于使大分子或包含大分子的复合体变性的方法都是适用的，只要它不干扰配体的完整性即可。
在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括一个，多个或全部下列进一步的步骤：(aa)在步骤(a)之前，破碎包含所述大分子和任选的所述配体的细胞，然后除去不溶物质；(ab)在步骤(a)之后和步骤(b)之前，洗涤；(ca)在步骤(b)之后和步骤(c)之前，除去大分子，提取配体和/或进行配体或者，如果适用的话，所提取的配体的液相层析(lc)或气相层析(gc)，其中优选地，所述lc或gc，在其进行的程度上，在在线lc/ms装置，在线lc/nmr装置和在线gc/ms装置或在线gc/nmr装置中进行；(da)在步骤(b)之后和步骤(d)之前，在进行步骤(d)的程度上，提取大分子并任选地进行提取的大分子的lc，其中优选lc在在线lc/ms装置或在线lc/nmr装置中进行。
步骤(aa)提供步骤(a)之前的步骤，其使用细胞作为起始材料。这些细胞可以是分离的细胞或组织或生物样品中包含的细胞。在破碎所述细胞后，可以除去不溶性物质，例如通过离心。进一步的纯化步骤不太优选且通常是可有可无的。因此，步骤(aa)在提供去除不溶性物质的同时，优选在将细胞提取物进料到第一方面的方法的步骤(a)之前排除任何进一步的处理，尤其是纯化步骤。所述细胞提取物是根据步骤(a)的优选样品。
根据步骤(ab)的洗涤是优选的，因为它提供了任何未结合的材料的去除。在大小排阻的情况下，未结合的材料是大分析物，在大小过滤的情况下，未结合的材料是小分析物。
第一方面的方法的步骤(b)提供从大分子释放结合的配体。在步骤(c)中对释放的配体进行分析之前，优选在步骤(ca)中除去大分子。这可以通过例如离心来完成。特别是，如果已经使用变性来释放配体，则通过离心可以容易地除去变性的大分子。
提取配体可以如giavalisco,etal.(plantj.68,364-76(2011))所述进行。一般而言，水与极性溶剂的混合物可用于提取。用于提取的特别优选的溶剂混合物是甲基叔丁基醚(mtbe)，甲醇和水的三元混合物。这对于提取半极性配体特别有用。这对于随后沉淀的大分子的同时沉淀也是有用的。
提取大分子，特别是蛋白质可以与配体提取平行进行，使用mtbe方法(见上文)或使用其他提取方法如丙酮，甲醇/氯仿，或蛋白质可以在化学分析之前直接溶解在尿素/硫脲混合物或去污剂中。
关于第一方面，本发明还提供了测定蛋白质配体的方法，所述方法包括或组成为(a)使由所述蛋白质和所述配体形成的复合体进行大小过滤或大小排阻层析；(b)使步骤(a)中得到的一种，多种或所有级分变性；(c)将步骤(b)中获得的释放的配体进行质谱分析(ms)，从而确定所述大分子的所述配体；(d)将步骤(b)中得到的释放的大分子进行ms处理，从而确定所述大分子；(e)比较配体的洗脱图与洗脱图大分子，从而确定哪种配体结合哪种大分子。
在第二方面，本发明提供了一种从多种测试化合物中鉴定(a)一种或多种大分子的配体的方法，所述方法包括或由以下组成：(a)将所述大分子与所述多种测试化合物接触；(b)对步骤(a)中得到的混合物进行一种方法，该方法分离所述大分子与配体之间形成的复合体(如果有的话)与未结合的测试化合物；(c)解离复合体，从而从大分子中释放结合的配体(如果有的话)；(d)将步骤(c)中得到的释放的配体(如果有的话)进行化学分析方法，从而鉴定所述大分子的配体。
关于第一方面的方法和其优选实施方案给出的定义和解释加以必要的变更应用于本发明的第二方面。
根据第二方面的复合体和配体分别是非共价复合体和非共价配体。
第二方面的方法是筛选方法。不同于通常要求在每次测定中仅测定单一测试化合物其结合大分子的潜在能力的现有技术方法，本发明提供了多种配体的伴随测定。配体的数量在这方面没有特别限制，并且可以高达1000，高达10000，高达100000，高达1000000或更高。此外，还可以在同一混合物中同时测定几种大分子。因此，关于配体的多路化是方便提供的。而且，甚至可以实现二维多路化，即关于配体和大分子二者。
特别是在第二方面的方法中使用一种大分子，特别是已知的大分子的程度下，确定所述大分子显然是可有可无的。
另一方面，在第二方面的方法中使用多种大分子的程度下，优选通过化学分析方法测定一种或多种大分子。
特别优选的是，在步骤(d)和(e)，(f)之后，确定哪种配体结合哪种大分子，优选通过比较配体的洗脱图与大分子的洗脱图。
在第二方面的优选实施方案中，(i)所述大分子是蛋白质或核酸，优选rna；(ii)所述配体如关于第一方面及其优选实施方案所定义；和/或(iii)所述多种大分子是2,3,4,5,6,7,8,9或10种大分子。
在第二方面的另一个优选实施方案中，(i)步骤(b)的所述方法是大小过滤层析，大小排阻层析，电泳，离心，热泳和/或fff；和/或(ii)所述步骤(d)的化学分析方法是质谱(ms)或核磁共振(nmr)。
在另一个优选的实施方案中，步骤(c)中的所述解离是通过所述复合体的变性实现的，所述变性优选通过(ca)加热，优选加热至100℃；(cb)加入变性化学品，例如包括尿素和盐酸胍的离液化合物和包括sds的去污剂；和/或(cc)加入干扰配体-大分子相互作用的有机溶剂，如丙酮和乙腈；和/或(cd)酶促和/或化学裂解所述大分子实现。
在进一步优选的实施方案中，所述方法还包括一个，多个或全部下列其他步骤：(ba)在步骤(b)之后和步骤(c)之前，洗涤；(da)在步骤(c)之后和步骤(d)之前，除去所述大分子，并提取配体(如果有的话)。
关于在本说明书中，特别是在权利要求中表征的实施方案，旨在将从属权利要求中提到的每个实施方案与所述从属权利要求所从属的每个权利要求(独立权利要求或从属权利要求)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1引用3个备选方案a，b和c，从属权利要求2引用3个备选方案d，e和f以及从属于权利要求1和2的权利要求3引用3个备选方案g，h和i的情况下，应理解，该说明书明确地公开了对应于组合a,d,g；a,d,h；a,d,i；a,e,g；a,e,h；a,e,i；a,f,g；a,f,h；a,f,i；b,d,g；b,d,h；b,d,i；b,e,g；b,e,h；b,e,i；b,f,g；b,f,h；b,f,i；c,d,g；c,d,h；c,d,i；c,e,g；c,e,h；c,e,i；c,f,g；c,f,h；c,f,i的实施方案，除非另有说明。
类似地，并且在独立和/或从属权利要求没有引用备选方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求引用多个在前权利要求，则认为由此涵盖的主题的任何组合被明确公开。例如，在独立权利要求1的情况下，从属权利要求2引用权利要求1，并且从属权利要求3引用权利要求2和权利要求1，其结果是权利要求3和权利要求1的主题的组合清楚且明确地公开为权利要求3,2和1的主题的组合。在存在引用权利要求1至3中任一项的另外的从属权利要求4的情况下，其结果是清楚且明确地公开了权利要求4和1，权利要求4,2和1，权利要求4,3和1，以及权利要求4,3,2和1的主题的组合。
附图显示了：
图1：实验工作流程。使用天然tmn缓冲液提取细胞(步骤1-2)。通过超速离心步骤(步骤3)获得天然可溶性级分。使用10kda旋转柱进行大小过滤。施加热变性以释放复合体结合的小分子(步骤4a)。或者，使用sec将蛋白质-代谢物复合体与游离代谢物分离(步骤4b)。将收集的样品进行一体化mtbe-甲醇-水代谢物和蛋白质提取(步骤5)。通过lc/ms定量半极性代谢物(步骤5)。
图2：大小过滤分离结合的蛋白质与游离小分子。这里给出的是可以使用15n和13c标记信息(giavalisco(2011),上述引文)推定注释为总和公式和/或使用参考化合物推定注释为代谢的那些的子集。注意，注释集中于洗脱液中存在的质量特征，因此归类为结合的复合体。
图3：sec分离结合的蛋白质与游离小分子。(a)四个sec重复(黑色)和非蛋白质对照(虚线)在280nm处的吸光度的层析图。由标准曲线确定的近似分子量分布以灰色绘制。(b)来自sec分析的57个分析的级分的蛋白质含量。(c)在(d)中绘制的独立实验(圆圈)的83个选定小分子的sec级分的总计离子计数和它们的平均值(线)。(d)来自大小过滤实验的大于10kda的42个级分的83种选定小分子的sec曲线的热图(n＝4个实验的平均值的z得分)。辅因子fmn(e)和nad(f)的示例性sec图。
图4：共分级分离分析的结果。也见实施例5。
图5：组合图，其给出在sec实验中含有蛋白质的级分之间用gly-pro亲和珠捕获的蛋白质的洗脱图。还给出了在sec实验中测量的gly-pro洗脱模式。将数据对sec分离中测量的最大强度归一化。用框架gly-pro与fba6和fba8共洗脱来表示。
图6：组合图，其给出在sec实验中含有蛋白质的级分之间用亲和标记的fba6捕获的代谢物的洗脱图。将数据对sec分离中测量的最大强度归一化。注意除了gly-pro之外以及除了哌可酸之外，在sec实验中用fba6牵引的所有其他小分子与fba6共洗脱。因此，可能的是，不是一种，而是多种不同的二肽可以与fba6相互作用。
图7：dhap(底物)和gly-pro，但不是pro-gly，以大约200nm的kd结合fba6。
图8：泛酸盐与3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶1(kphmt1)相互作用。
a)在sec实验中，泛酸盐在含有蛋白质的级分之间与kphmt1共洗脱，人相关性r＝0.93。
b)通过微量热泳(mst)测定测试泛酸盐-kphmt1相互作用。数据表示为在结合和非结合的kphmt1之间计算的归一化荧光的差异(δfnorm)，kd为367.4μm。作为对照肽，在mta存在下测定6xhis标签肽，未观察到结合。数据是平均值±sd，n＝3。
图9：甲硫基腺苷(mta)与甲硫基核糖-1-磷酸异构酶(mtr-1-p)相互作用。
a)在sec实验中在含蛋白质的级分之间共洗脱mta和mtr-1-p，其中人相关性r＝0.75。
b)通过微量热泳(mst)测定测试mta-mtr-1-p相互作用，数据表示为在结合和未结合的mtr-1-p之间计算的归一化荧光(δfnorm)的差异，kd为2.7μm。作为对照肽，在mta存在下测定6xhis标签肽，未观察到结合。数据是平均值±sd，n＝3。
图10：2’,3’-camp与天然细胞提取物中的rbp47b蛋白结合。
(a)使用四个连续洗脱步骤的亲和纯化实验的示意图(左图)。实验一式三份进行。在所有三个独立样品中，特定蛋白质被定义为仅存在于一次洗脱中。非特异性蛋白质定义为存在于多于一个洗脱中(右图)。(b)sec实验的示意图(左图)；在sec实验中，在含蛋白质的级分中共洗脱2’,3’-camp和rbp47b(右图)。将数据对最大强度归一化，并作为3(蛋白质)或4(代谢物)个独立实验的平均值给出。(c)热稳定性测定的示意图(左图)；rbp47b-tap蛋白丰度的蛋白质印迹分析(右图)。提出的实验重复三次。
图11：2’,3’-camp在体外与rbp47b蛋白结合。(a)测试rbp47b与2’,3’-camp/3’,5’-camp之间相互作用的mst测量。数据表示为在结合的和未结合的rbp47b之间计算的归一化荧光(δfnorm)的差异。数据是平均值±sd，n＝3(技术复制)。计算出rbp47b-2’,3’-camp相互作用的kd为1.02μm。(b)将拟南芥天然裂解物(正方形)中测量的2’,3’-camp强度的log2针对用于从lc-ms代谢物测量计算绝对2’,3’-camp浓度的校准曲线(点)作图(平均值±sd，n＝3)。样品来自一个实验。
图12：2’,3’-camp响应于应激条件而累积并促进rbp47b自组装。
(a)在不同胁迫条件下成熟拟南芥莲座中2’,3’-camp的积累31。数据表示为对时间点0归一化的2’,3’-camp强度的移动平均值。第一个样品在胁迫开始后5,10和20分钟取得，之后每20分钟取样直至6小时。在胁迫开始后10和20小时后取最后两个样品。21：21℃(对照条件)，32：32℃(热胁迫)，l：对照光条件(150μem-2sec-1)，ll：低光(70μem-2sec-1)，d：黑暗。数据是三次独立测量的平均值。(b)在50μm2’,3’-camp存在下(kd＝8.9nm)或不存在(kd＝127.87nm)下的rbp47b自组装的mst测量。数据表示为结合和未结合的蛋白质。数据是平均值±sd，n＝2(技术复制)。
图13：2’,3’-camp与rbp47b-tia1的人同源物结合并促进其寡聚化。
(a)tia1和2’,3’-camp/3’,5’-camp之间相互作用的mst测量。数据表示在结合的和未结合的tia1之间计算的归一化荧光(δfnorm)的差异。数据是平均值±sd，n＝3(技术复制)。计算tia1-2’,3’-camp相互作用的kd为217μm。(b)在500μm2’,3’-camp存在下(kd＝20.55nm)或不存在(kd＝36.28nm)的tia1自组装的mst测量。数据表示为结合的级分，表示结合和未结合的蛋白质。数据是平均值±sd，n＝3(技术复制)。
图14：2’,3’-camp在rna命运的调节中建议的作用。
在最佳条件下，发生蛋白质翻译并且tia1/rbp47b位于细胞核中。在胁迫时和由于停滞的翻译，在加工体中引发mrna降解，导致2’,3’-camp的积累。同样在胁迫条件下，tia1/rbp47b被输出到胞质溶胶中，在那里它可以与2’,3’-camp形成复合体。后者促进tia1/rbp47b自组装，从而促进胁迫-颗粒形成，其中rna被储存并保护其免于降解。
这些实施例说明了本发明。
实施例1
材料和方法
拟南芥细胞培养物的生长
将mm2d拟南芥细胞培养物(menges&murray,plantj.30,203-12(2002))在补充有3％蔗糖，0.05mg/l激动素和0.5mg/l1-萘乙酸的msmo培养基中在有轨摇床上130rpm下在光照下生长。将细胞每周传代至新鲜培养基，并在对数生长期间使用快速过滤和液氮快速冷冻收获。
细胞裂解和可溶性蛋白质级分的制备
将冷冻的细胞用研钵和研杵或retsch研磨机(retschgmbh,haan,germany)在30rps下研磨4次，每次1分钟。每1g细胞加入1.5ml(用于大小过滤)或0.7ml(用于大小排阻层析法)裂解缓冲液(50mmtris-hclph7.5,500mmnacl,1.5mmmgcl2,5mmdtt,1mmpmsf,1x蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrich)，0.1mmna3vo4和1mmnaf)。在sec实验中，使用50mm碳酸氢铵-hclph7.5代替tris作为缓冲剂。在冰上解冻后，将提取物通过miracloth过滤，随后在3452g，4℃下离心10分钟。在35000rpm(最大165052g，平均125812g)，4℃下超速离心45分钟，用于制备可溶性级分。
大小过滤
使用amicon10kdaultra离心过滤单元(millipore)过滤2.5-3ml可溶性级分(参见上文)。在此阶段，保留400μl等分的输入和流穿液用于代谢分析。使用两个洗涤步骤，首先使用5ml接着使用1.5ml洗涤缓冲液(50mmtrishclph7.5,500mmnacl,1.5mmmgcl2,tnm)以除去剩余的游离代谢物。向柱中加入约1.5ml洗涤缓冲液以覆盖过滤器，10分钟，100℃处理用于使蛋白质变性，从而解离蛋白质-代谢物复合体。将来自第二次洗涤步骤的1ml-1.2ml等分试样和洗脱液保持用于代谢分析。离心步骤在3452g下进行15-30分钟。
大小排阻层析
对应于50mg蛋白质的2.5ml可溶性级分用于分离。使用与在4℃下运行的
代谢物提取和lc/ms代谢组学
按照giavalisco(2011),上述引文中的定义提取样品。实质上，该方法使用甲基叔丁基醚(mtbe)/甲醇/水溶剂系统将蛋白质，脂质和极性化合物分别分离成沉淀，有机相和水相。提取后，将水相在speed-vac中干燥并储存在-80℃直至lc/ms分析。如giavalisco(2011),上述引文processingofchromatograms,peakdetection,andintegrationwereperformedusingrefinerms7.5(genedata；http://www.genedata.com)中所述，使用以正电离模式和负电离模式耦合exactive质谱仪(thermo-fisher；http://www.thermofisher.com)的超高效液相层析法测量样品。质谱数据的处理包括去除同位素峰以及化学噪声。针对内部标准数据库和/或metlin数据库(https://metlin.scripps.edu/index.php)(允许7ppm误差)查询获得的代谢特征(在给定保留时间的m/z)。可用时，从13c或15n标记的细胞的代谢谱中检索到给定特征中的碳和氮原子数的信息(类似于giavalisco(2011)，上述引文)。
实施例2
分析大小过滤中的配体
将天然拟南芥mm2d细胞培养物裂解物(后来称为输入物)加载到具有10kda截止值的大小过滤旋转柱上，以将蛋白质级分与游离代谢物级分(流穿)分离。随后彻底洗涤蛋白质级分以除去任何未结合的代谢物(洗涤)。在最后一步中，应用热变性以使蛋白质变性并从蛋白质中释放非共价结合的代谢物(洗脱)。通过应用我们的lc/ms代谢组学平台分析所有样品的半极性化合物(giavalisco(2011),loc.cit.)(图1，步骤5)。总体而言，输入，流穿，洗涤和洗脱液样品的lc/ms分析产生大约8892个代谢特征(由分子量(m/z)和保留时间定义)，其中约150个可以推定注释为代谢物。流穿物中含有许多代谢物，洗涤中代谢物含量降低。引人注目的是，在热处理后，许多代谢物(约占所有检测到的代谢特征的50％)虽然在洗涤样品中不存在，但在洗脱液中再次可检测到，从而表明这一大级分代谢物确实与蛋白质形成稳定的复合体。其中包括众所周知的配体，如环核苷酸(cgmp，camp，ccmp)，辅因子(fad，nad，fmn)和肽(图2a-b)。在截止滤器上消化蛋白质，释放肽用于进一步分析。
这些结果表明，在分析的生物系统中，有许多代谢物/小分子与蛋白质形成非共价但稳定的复合体。
实施例3
大小排阻原则的证明
在下一步中，使用了备选的大小分级分离方法。为此，大小排阻层析法(kristensenetal.,nat.methods9,907-909(2012)；olinaresetal.,mol.cell.proteomics9,1594-1615(2010))已经应用于原生蛋白质-代谢物提取物，使用分离从大约600kda到10kda的分子复合体的柱(图1)。280nm处吸光度的层析图表明通过sec可重复分离复合体(图3a)。收集的级分中的蛋白质含量显示含有蛋白质的分子复合体的分离，而在对应于小于10kda的分子量的c12之后的级分中没有检测到蛋白质(图3a-b)。
实施例4
分析任一方法中发现的配体
为了观察蛋白质级分是否含有代谢物/小分子，通过lc/ms分析了57个级分的半极性代谢物的发生。根据从大小过滤获得的结果，我们检测到大部分代谢特征，即配体，作为结合的非蛋白质并因此在柱的总流动相体积后洗脱(图3c)。然而，此外并且更重要的是，我们在代表在10到600kda之间理论mw的级分中检测到小分子的特定洗脱图。
小分子洗脱图的三个特征值得评论。首先，sec结果在很大程度上证实了上述大小过滤实验的结果。因此，在沿整个分离范围分布的sec数据中也观察到来自大小过滤实验的83个推定注释的蛋白质相互作用物，即配体(图3d)。其次，对于大多数代谢物/配体，我们观察到它们在sec实验的特定级分中出现而不是在所有级分中出现，这清楚地表明在这些级分中洗脱的一种或多种蛋白质的特异性结合。第三，也是最重要的概念证据，我们观察到众所周知的代谢物与蛋白质相互作用，最明显的是辅因子，如fmn或nad，在分离范围内显示不同的峰，表明存在多种特异性结合蛋白质(图3e-f)。
为了确保差异洗脱代谢物是衍生的真正的代谢物-蛋白质复合体，我们用无蛋白质样品进行了对照实验。为此，我们使用80％丙酮从输入样品中沉淀蛋白质，并在将其应用于sec柱之前在裂解缓冲液中重构小分子。根据sec基于它们的大小分离分子复合体，我们没有观察到sec级分中任何显著的差异代谢特征(图3c)，但是如对游离小分钟预期的，所有代谢物在总流动相体积之后出现。
实施例5
共分级分离分析
已经进行了小分子和大分子(蛋白质)的共分级分离分析。图4(a)显示了基于pearson相关性的蛋白质和推定注释的小分子的层级聚类树状图。灰色框表示相关系数大于0.7的聚类。图4(b)示出了来自(a)的聚类5作为网络，其中边缘权重对应于相关性强度。图4(c)显示了来自所选小分子(实线)和两种具有高度相似谱的蛋白质(虚线)的洗脱图的各个二维图。插图中显示了相关性图。
实施例6：
鉴定新的gly-pro：rba6相互作用
我们证明，通过对天然生物裂解物应用任何类型的大小分离，可以将游离的小分子与结合到蛋白质复合体的那些分离。使用单步大小过滤，我们发现多个二肽与分离自拟南芥细胞培养物的可溶性级分的蛋白质结合的证据。通过大小排阻层析分离蛋白质-小分子复合体的后续实验证明，二肽不仅与蛋白质结合，而且与特定蛋白质复合体结合。大多数测量的二肽具有一个特定的洗脱峰。我们关注于测量的二肽之一，即gly-pro，其与约145-165kda的蛋白质复合体一起洗脱(图5)。
使用甘氨酸的n末端基团或脯氨酸的c末端基团(称为n或c珠子)将l-gly-l-pro固定在琼脂糖珠子上。将两种树脂与天然拟南芥裂解物一起温育，并用高浓度的gly-pro洗脱珠子上捕获的蛋白质。亲和力实验遭受与非特异性结合相关的高假阳性率。为了抵消这一点，在gly-pro洗脱之前，我们引入了额外的步骤，其中珠子与甘氨酸和脯氨酸的混合物一起温育。这个额外的步骤减少了用n和c珠子牵引的数百到34个蛋白质的命中数。这些包括细胞质果糖二磷酸醛缩酶(fba8和fba8)(图5)。它们还在sec实验中与gly-pro共洗脱(图5)。醛缩酶是糖酵解和糖异生途径中的酶。它们催化可逆反应，其中果糖1,6二磷酸(fru1,6bp)被裂解成两个三碳产物，即3-磷酸甘油醛(g3p)和磷酸二羟丙酮(dhap)。
我们随后可以通过独立方法在细胞提取物和体外确认gly-pro：fba6相互作用。
我们推断如果使用gly-pro作为诱饵可以拉动fba6，反过来也是如此。为了测试该假设，制备了表达fba6和亲和标签的转基因品系，并用于下拉实验。正如所料，在具有标记的fba6的复合体中发现了gly-pro(图6)。
从大肠杆菌中表达并纯化fba6蛋白。mst利用所有生物分子的内在趋势以在温度梯度中移动。这种移动取决于分子大小，电荷和水合外层。复合体形成影响改变移动和指示结合事件的三个参数中的至少一个。gly-pro，但不是pro-gly，以大约200nm的kd结合fba6，这与底物(dhap)相当。获得的结果表明强烈和特定的相互作用。
实施例7
在分析来自sec实验的共洗脱蛋白质和代谢物的过程中，我们寻找存在于相同代谢途径中的那些，因为这可能表明反馈调节。
可以确认两个例子：
·泛酸与3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶1共同洗脱，所述酶是泛酸合成上游的酶(图8)。
·甲硫腺苷与甲硫基核糖-1-磷酸异构酶(mtr-1-p)共洗脱，甲硫基核糖-1-磷酸异构酶是甲硫氨酸补救途径的酶(图9)。
实施例8：
鉴定和表征camp-rbp47b相互作用
介绍
蛋白质-代谢物相互作用(pmi)在细胞调节的所有方面都是必不可少的。最近，为了鉴定潜在的调节性小分子，因为它们以与蛋白质的稳定复合体存在，我们开发了一种基于共分级分离的简单方法，该方法利用蛋白质-代谢物复合体和游离代谢物之间的大小差异(veyeletal.(2017)system-widedetectionofprotein-smallmoleculecomplexessuggestsextensivemetaboliteregulationinplants.scirep7:42387)。
应用最先进的代谢组学分析(giavaliscoetal.(2011)elementalformulaannotationofpolarandlipophilicmetabolitesusing(13)c,(15)nand(34)sisotopelabeling,incombinationwithhigh-resolutionmassspectrometry.plantj68:364-376.)，我们鉴定了大量蛋白质结合的小分子，表明在拟南芥细胞中存在许多新的小分子调节剂。在与蛋白质共分级分离的代谢物中，我们可以鉴定2’,3’-camp。与其位置异构体3’,5’-camp(一种众所周知的第二信使)相比，2’,3’-camp的生物学功能还远未完全了解。事实上，仅在2009年(renetal.(2009)identificationandquantificationof2',3'-campreleasebythekidney.jpharmacolexpther328:855-865.)报道了生物材料中存在2’,3’-camp。从那以后，在哺乳动物和植物细胞中检测到2’,3’-camp，其水平对应于胁迫和损伤(vandammeetal.(2014)woundingstresscausesrapidincreaseinconcentrationofthenaturallyoccurring2',3'-isomersofcyclicguanosine-andcyclicadenosinemonophosphate(cgmpandcamp)inplanttissues.phytochemistry103:59-66；jacksonetal.(2009)extracellular2',3'-campisasourceofadenosine.jbiolchem284:33097-33106；verrieretal.(2012)thebraininvivoexpressesthe2',3'-camp-adenosinepathway.jneurochem122:115-125)。当rnases介导的p-o5'键水解伴随着mrna的转磷酸化形成2’,3’-环核苷酸时,在mrna降解过程中形成2’,3’-camp(thompsonetal.(1994)energeticsofcatalysisbyribonucleases:fateofthe2',3'-cyclicphosphodiesterintermediate.biochemistry33:7408-7414)。由于mrna多聚-a尾，2’,3’camp是所有2’,3’-环核苷酸中最丰富的。与其代谢相似，2’,3’-camp的作用也不是很清楚。在大鼠脑线粒体中，2’,3’-camp显示激活线粒体转换孔(azarashvilietal.(2009)ca2+-dependentpermeabilitytransitionregulationinratbrainmitochondriaby2',3'-cyclicnucleotidesand2',3'-cyclicnucleotide3'-phosphodiesterase.amjphysiolcellphysiol296:c1428-1439.)，导致细胞凋亡和坏死。为了抵消这种效应，建议细胞将2’,3’-camp输出到细胞外区室，在那里它被代谢成2'-amp和腺苷(jacksonetal.(2009)(上述引文)；jackson(2016)discoveryandrolesof2',3'-campinbiologicalsystems.handbexppharmacol.)。我们观察到2’,3’-camp与蛋白质共迁移(veyel(2017)(上同))，我们质疑2’,3’-camp是否可能不仅仅是在细胞外2’,3’-camp腺苷补救途径中的一种中间体。
在本文中，我们显示2’,3’-camp在体外和天然细胞裂解物中与rbp47b蛋白形成复合体。rbp47b蛋白及其哺乳动物同源物tia1被公认为rna加工机制的一部分(kedershaetal.(1999)rna-bindingproteinstia-1andtiarlinkthephosphorylationofeif-2alphatotheassemblyofmammalianstressgranules.journalofcellbiology147:1431-1441；gilksetal.(2004)stressgranuleassemblyismediatedbyprion-likeaggregationoftia-1.molbiolcell15:5383-5398)。在非胁迫条件下，rbp47b/tia1定位于细胞核，作为前mrna剪接机制的组分(gilks(2004)(上述引文)；lorkovicetal.(2000)rbp45andrbp47,twooligouridylate-specifichnrnp-likeproteinsinteractingwithpoly(a)+rnainnucleiofplantcells.rna6:1610-1624)。胁迫后，rbp47b/tia1重新定位于细胞质，在细胞质中其聚集标志着胁迫颗粒的形成(kedersha(1999)(上述引文)；weberetal.(2008)plantstressgranulesandmrnaprocessingbodiesaredistinctfromheatstressgranules.plantj56:517-530)。sg是mrnp颗粒，由停滞翻译启动前复合体的大的聚集体组成，其含有mrna，40s核糖体亚基，翻译起始因子和rna结合蛋白(rbp)(sgs)(kedersha(1999)(上述引文),weber(2008)(上述引文)；kedershaetal.(2005)stressgranulesandprocessingbodiesaredynamicallylinkedsitesofmrnpremodeling.jcellbiol169:871-884；andersonandkedersha(2009)rnagranules:post-transcriptionalandepigeneticmodulatorsofgeneexpression.natrevmolcellbiol10:430-436；vonroretzetal.(2011)turnoverofau-rich-containingmrnasduringstress:amatterofsurvival.wileyinterdisciprevrna2:336-347；mahboubiandstochaj(2017)cytoplasmicstressgranules:dynamicmodulatorsofcellsignalinganddisease.biochimbiophysacta1863:884-895)。由于其参与翻译抑制，sg形成过程对于细胞存活是必需的。实质上，sg隔离(sequester)管家mrna和凋亡调节因子，同时排除编码参与胁迫耐受的蛋白质的mrna。sg装配和解装配中的缺陷可促进神经变性(wolozin(2012)regulatedproteinaggregation:stressgranulesandneurodegeneration.molneurodegener7:56)。
sg装配也是癌症研究的目标，因为sg在癌细胞中的存在使得它们对治疗更具抗性并且易于转移(mahboubiandstochaj(2017)(上述引文))。相反，通过限制病毒rna和蛋白质，sg完整性对于病毒抗性是重要的(yoneyamaetal.(2016)regulationofantiviralinnateimmunesignalingbystress-inducedrnagranules.jbiochem159:279-286)。
对于人类健康至关重要，胁迫颗粒装配和解装配在过去引起了很多关注，并且仍然备受争议(andersonandkedersha(2008)stressgranules:thetaoofrnatriage.trendsbiochemsci33:141-150；wheeleretal.(2016)distinctstagesinstressgranuleassemblyanddisassembly.elife5)。已知事件包括翻译起始因子eif2的磷酸化，其阻止trnamet与43s前起始复合体的结合，并因此导致翻译抑制。不是经历翻译，而是43s复合体的mrna分子与rna结合蛋白，例如rbp47b和tia1结合，其支持蛋白质聚集和胁迫颗粒形成。rbp47b/tia1蛋白的自组装依赖于已知募集mrna的rrmrna结合基序，以及支持蛋白质-蛋白质相互作用的朊病毒样prd结构域(gilks(2004)(上述引文)；weber(2008)(上述引文))。与其颗粒成核活性一致，即使在没有胁迫的情况下，tia-1的过表达也诱导sg组装(gilks(2004)(上述引文))。
sg蛋白的翻译后修饰(ptm)可影响颗粒动力学。例如，tia1蛋白的氧化抑制形成sg的致敏细胞凋亡(arimoto-matsuzakietal.(2016)tia1oxidationinhibitsstressgranuleassemblyandsensitizescellstostress-inducedapoptosis.natcommun7:10252)。
我们的研究表明，除了ptm之外，sg组装可以通过小分子调节剂直接调节，因为2’,3’-camp不仅与rbp47b/tia1结合，而且还促进其寡聚化。这样，我们的研究因为许多原因是重要的。首先，我们为一种新的小分子指定了一种重要的调节功能，迄今为止，这种小分子仅被作为rna降解的副产物进行讨论。其次，我们提供了在胁迫颗粒形成过程中存在小分子调节的证据，胁迫颗粒形成是一个在胁迫应答过程中至关重要的过程。第三，我们的研究结果指向真核细胞中保守的机制，提示了进化重要性。
结果
鉴定天然细胞提取物中的2’,3’-camp蛋白受体
为此，我们开始通过使用琼脂糖珠进行亲和纯化(ap)来鉴定2’,3’-camp的结合蛋白配偶体，其中2’,3’-camp通过嘌呤环的nh2基团连接。将珠子与来自拟南芥细胞悬浮培养物的总可溶性蛋白质提取物温育(参见材料和方法)后，用adp，gdp，5'-amp，最后用2’,3’-camp进行顺序洗涤，并通过lc-ms/ms蛋白质组学分析在不同洗涤中洗脱的蛋白质。仅用2’,3’-camp但不存在任何其他洗脱液(adp，gdp或5'-amp；图10a)从琼脂糖珠中洗脱的蛋白质被定义为2’,3’-camp结合。应用该严格标准仅剩下一种蛋白质：聚腺苷酸结合蛋白rbp47b。我们推断，体内rbp47b-2’,3’-camp复合体的推定的形成应该通过大小排阻实验(sec)中两种组分的大部分重叠洗脱图来反映，实际情况确实如此(图10b)。为了获得在rbp47b和2’,3’-camp之间形成复合体的进一步和独立的证据，我们进行了细胞热变换分析(cetsa)(frankenetal.(2015)thermalproteomeprofilingforunbiasedidentificationofdirectandindirectdrugtargetsusingmultiplexedquantitativemassspectrometry.natprotoc10:1567-1593)。cesta是一种用于药物研究以验证天然细胞裂解物中配体-受体结合的方法，基于观察到配体的存在改变了蛋白质受体的热稳定性。在此，我们调整了适合植物材料和内源98代谢物的方案。我们使用表达标记形式的rbp47b的拟南芥细胞，因此可以用抗标签抗体容易地检测rbp47b水平。用10和100μm2’,3’-camp温育天然蛋白质裂解物导致rbp47b蛋白质的热去稳定化和其熔解温度分别改变2.4℃和5.1℃，表明2’,3’-camp确实与rbp47b结合(图10c)。在使用位置异构体3’,5’-camp而不是2’,3’-camp的类似实验中没有观察到这种效果。总之，三种独立的实验方法(ap，sec和cetsa)提供了天然拟南芥裂解物中2’,3’-camp与rbp47b结合的证据。
体外确认2'3'-camp-rbp47b相互作用
虽然亲和纯化的结果表明2’,3’-camp与rbp47b的特异性结合，但是对于结合亲和力并因此假定的结合特异性没有明确的结论。因此，我们尝试使用微量热泳(mst)来生物物理地确定体外结合亲和力(jerabek-willemsenetal.(2011)molecularinteractionstudiesusingmicroscalethermophoresis.assaydrugdevtechnol9:342-353)。mst利用大小，电荷和水合外层对温度梯度中分子运动的影响。导致三个参数中的至少一个的改变的复合体形成导致差异运动，由此可以确定结合亲和力。出于mst实验的目的，rbp47b在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中纯化。mst结果显示清楚的结合，kd值为1μm。最重要的是，我们没有观察到3’,5’-camp的任何结合，表明rb47b对2’,3’-camp具有非常高的特异性(图11a)。测量的kd值还对应于在天然拟南芥裂解物中测量的2’,3’-camp的～20μm浓度(图11b)。
rbp47b-2’,3’-camp相互作用的生物学重要性
在植物'中，2’,3’-camp水平在创伤胁迫下迅速增加(vandamme(2014)(上述引文))。为了测试其他胁迫条件下2’,3’-camp水平是否发生变化，我们从胁迫时间过程中查询了代谢组学数据(caldanaetal.(2011)high-densitykineticanalysisofthemetabolomicandtranscriptomicresponseofarabidopsistoeightenvironmentalconditions.plantj67:869-884)。不久，在对照环境中生长的成熟col-0莲座(先前抽苔)被转移到光(低光，高光，黑暗)和温度胁迫条件(热和冷)的组合中，并在多个时间点采样直到胁迫开始后24小时。2’,3’-camp在低光照和黑暗中积累，但最显著的是在热胁迫条件(图12a)下，所述条件的特征在于rna降解增加(merretetal.(2013)xrn4andlarp1arerequiredforaheat-triggeredmrnadecaypathwayinvolvedinplantacclimationandsurvivalduringthermalstress.cellrep5:1279-1293；baginskyandgruissem(2002)endonucleolyticactivationdirectsdark-inducedchloroplastmrnadegradation.nucleicacidsres30:4527-4533)和形成胁迫颗粒(sgs)(kedersha(1999)(上述引文)；weber(2008)(上述引文))。与热胁迫下2’,3’-camp水平的快速积累一致(在前20分钟内，图12a)，gutierrez-beltranetal.(2015)(tudorstaphylococcalnucleaselinksformationofstressgranulesandprocessingbodieswithmrnacatabolisminarabidopsis.plantcell27:926-943)显示含有rfp-rbp47b的胁迫颗粒在热胁迫的前30分钟内形成。如果相互作用发生在胞质溶胶中，其中rbp47b和2’,3’-camp都存在，人们会预期2’,3’-camp可能影响胁迫颗粒的形成，这意味着rbp47b的寡聚化。由于缺乏2’,3’-camp分子的市售的膜可渗透衍生物，我们无法跟踪在体内胁迫颗粒形成。然而，我们通过mst在存在和不存在饱和量的2’,3’-camp的情况下确定rbp47b的寡聚化来直接测试该假设。如图12b所示，rbp47b自组装在没有2’,3’-camp的情况下发生，kd值为128nm。值得注意的是，在饱和量(50μm)的2’,3’-camp存在下观察到寡聚化亲和力常数的显著变化，其特征在于kd值为9nm(图12b)。这些数据强烈表明2’,3’-camp由于其与rbp47b的结合而对该蛋白质的寡聚化产生直接影响，因此可能对需要rbp47b寡聚化的sg组装过程产生直接影响。2’,3’-camp除了是mrna的降解产物外，还可以通过影响rbp47b蛋白的寡聚化进而影响sgs的形成而发挥调节作用。
rbp47b-2’,3’-camp相互作用的进化保守性
期望2’,3’-camp的这种基本作用是保守的，我们用tia1(rbp47b的人功能同源物)进行了类似的分析。标记tia1并使用mst测定其与2’,3’-camp的相互作用。与rbp47b结果一致，重组tia1与2’,3’-camp(kd＝217μm)形成复合体，但不与3’,5’-camp形成复合体(图13a)。最重要的是，这里2’,3’-camp也降低了tia1自组装的kd，这次是2倍(500μm2’,3’–camp存在下从kd＝36nm到kd＝20nm；图13b)，证明了非常保守的机制。
讨论
2’,3’-camp是一种胁迫颗粒(sgs)组装的新型的调节子
本文提出的研究的主要发现是2’,3’-camp与拟南芥rbp47b蛋白及其动物同源物tia1蛋白的特异性和高亲和力结合。对于rbp47b-2’,3’-camp相互作用测量的1μm的kd值在为各种受体-配体相互作用报道的结合亲和力范围内，例如赤霉素受体gid1和16,17-二氢-ga4之间(kd＝1.4μm)，以及脱落酸和pyr1受体之间(kd＝97μm)的结合亲和力((ueguchi-tanakaetal.(2005)gibberellininsensitivedwarf1encodesasolublereceptorforgibberellin.nature437:693-698；dupeuxetal.(2011)athermodynamicswitchmodulatesabscisicacidreceptorsensitivity.emboj30:4171-4184)。以这种方式，首先我们为一种新的小分子指定了一种重要的调节功能，迄今为止，该分子仅作为rna降解的副产物进行了讨论(thompson(1994)(上述引文))。在细胞中，mrna衰变与细胞质mrnp病灶相关，称为加工体(p体，pb)。在胁迫条件下在动物和植物中诱导与停滞翻译相关的rna衰变，例如(merret(2013)(上述引文)；heikkinenetal.(2003)initiation-mediatedmrnadecayinyeastaffectsheat-shockmrnas,andworksthroughdecappingand5'-to-3'hydrolysis.nucleicacidsres31:4006-4016；somaf,mogamij,yoshidat,abekuram,takahashif,etal.(2017)aba-unresponsivesnrk2proteinkinasesregulatemrnadecayunderosmoticstressinplants.natplants3:16204)。这伴随着pb的数量和大小的增加(shethandparker(2003)decappinganddecayofmessengerrnaoccurincytoplasmicprocessingbodies.science300:805-808；xuetal.(2006)arabidopsisdcp2,dcp1,andvaricoseformadecappingcomplexrequiredforpostembryonicdevelopment.plantcell18:3386-3398)。在胁迫和损伤下，2’,3’camp水平也增加，例如vandamme(2014)(上述引文)，其符合2’,3’-环核苷酸的推测的来源。我们可以证明热处理导致在胁迫发生后的前30分钟内2’,3’-camp积累。该时间线与胁迫颗粒(sgs)的热触发形成一致(kedersha(1999)(上述引文)；weber(2008)(上述引文))，通过选择性稳定和储存mrna,细胞质mrnp病灶在翻译抑制中发挥作用(kedersha(1999)(上述引用)；weber(2008)(上述引文)；kedersha(2005)(上述引文)；anderson(2009)(上述引文))。
rbp47b/tia1聚集甚至是sg形成的关键，我们可以进一步证明2’,3’-camp结合促进自组装。以这种方式并且其次，我们提供了在胁迫颗粒形成期间存在小分子调节的证据，此外已经报道了sg蛋白的ptm，例如arimoto-matsuzaki(2016)(上述引文)。rna降解产物2’,3’-camp非常适合于这种作用，提供rna降解和储存之间的负反馈调节手段。我们推测在控制条件下，rbp47b/tia1的核定位防止发生相互作用。在胁迫条件下，通常伴随着2’,3’-camp水平的快速增加，rbp47b/tia1迁移至细胞质，在细胞质中可发生相互作用，促进sg形成。总之，我们的结果表明，在人类和植物中，2’,3’-camp可能是rna降解和储存之间平衡的关键调节子。
大小排阻层析作为受体研究的起点
小分子靶标识别对化学生物学界来说是一项至关重要但仍然艰巨的任务。最近，我们提出大小过滤作为一种有效的方法，用于全局鉴定与天然细胞提取物中的蛋白质复合体结合的小分子。因此，该方法允许快速筛选多种生物样品，以找到选择的分子存在于蛋白质复合体中的条件。当通过大小排阻层析(sec)跟踪时，可以从共洗脱图推断蛋白质受体的同一性。这项研究构成了我们方法的概念证明。我们在简单大小过滤和sec实验中基于其在来自拟南芥细胞培养物的蛋白质复合体中的存在选择2’,3’-camp分子。2’,3’-camp与数百种蛋白质共同洗脱(数据未显示)，因此为了限制候选蛋白质配偶体的数量，我们随后进行亲和层析。两种方法的叠加产生一种候选蛋白，其特异性结合2’,3’-camp树脂，并在sec实验中与2’,3’-camp共洗脱。rbp47b-2’,3’-camp相互作用然后通过靶向方法(cetsa和mst)验证。这里介绍的实验管道具有许多优点(1)它是时间(不到一年)和劳动有效的，(2)结合了多种证据，(3)结合了原位(细胞提取物)和体外方法。
材料和方法
拟南芥细胞培养物
拟南芥细胞培养物(mengesandmurray(2002)synchronousarabidopsissuspensionculturesforanalysisofcellcyclegeneactivity.plantj30:203-212)在补充有3％蔗糖，0.05mg/l激动素和0.5mg/l1-萘乙酸的msmo培养基中在130rpm的有轨摇床上光照下生长。将细胞每周传代至新鲜培养基，并在对数生长期间使用快速过滤和液氮快速冷冻收获。
制备天然拟南芥裂解物
如上所述收集植物细胞材料并用研钵和研杵在液氮中粉碎至均匀，然后每1g植物材料重悬浮于1ml裂解缓冲液(25mmtris-hcl,ph7.5；0.5mnacl；15mmmgcl2；0.5mmdtt；1mmnaf；1mmna3vo4；1×proteaseinhibitorcocktail,sigma-aldrichp9599,steinheim,germany)中。通过在4℃，14,000rpm下离心10分钟分离细胞碎片。将粗裂解物进行超速离心(45分钟，4℃，35,000rpm)以获得称为天然拟南芥裂解物的可溶性级分。
亲和纯化
定制的2’,3’-camp琼脂糖珠购自cubebiotech(monheim，germany)。使用嘌呤环的胺(nh2)基团和14碳间隔臂将2’,3’-camp与珠子偶联。使用前，用裂解缓冲液平衡珠子。将3ml天然裂解物(约90mg总蛋白)与150μl琼脂糖树脂(见上文)合并，在4℃旋转轮上温育1小时(结合)，转移至mobicol“classic”(35μm孔径过滤)柱并用10ml洗涤缓冲液(0.025mtris-hcl，ph7.5；0.5mnacl)洗涤。将溶解在裂解缓冲液中的400μl1mm腺苷二磷酸(sigma01905)加入到珠子中，然后在4℃下在台式振荡器(1,000rpm)中温育1小时。收集洗脱液，用10ml洗涤缓冲液洗涤珠子。使用1mm鸟苷二磷酸(sigmag7127)，1mm5'-腺苷一磷酸(sigmaa2252)和1mm2’,3’-camp(sigmaa9376)重复该过程。使用2.5体积的预冷丙酮沉淀蛋白质。将蛋白质颗粒在真空浓缩器中干燥并储存在-20℃。
大小排阻层析
按照veyel(2017)(上述引文)中的描述进行。不久，在sec实验中，将2.5ml对应于50mg蛋白质的可溶性级分用于分离。使用与在4℃下运行的
蛋白质组学：样品制备和蛋白质鉴定
按照veyel(2017)(上述引文)中的描述进行。
细胞热转移测定和蛋白质印迹分析
tap标记的rbp47b和空载体系如(vanleeneetal.(2015)animprovedtoolboxtounraveltheplantcellularmachinerybytandemaffinitypurificationofarabidopsisproteincomplexes.natprotoc10:169-187)所述，使用pkcs二元载体和标准农杆菌转化制备。将天然拟南芥裂解物与10或100μm2’,3’-camp和dmso(用于camp溶液制备)一起作为对照在室温下混合温育30分钟。进一步的步骤改编自franken(2015)(上述引文)。不久，为了应用3分钟的温度处理，我们使用pcr热循环仪(eppendorf，hamburg，germany)，使用如下温度：39.9；41.7；43.5；45.8；48.4；51.1；53.8；56.2；和59.9℃。通过离心(1分钟，14,000rpm)沉淀变性蛋白质。使用2.5体积的预冷丙酮沉淀剩余的可溶性蛋白质。通过在10％丙烯酰胺凝胶上的sds-page分离重悬于6m尿素/2m硫脲(ph8)中的蛋白质沉淀，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(biorad,münchen,germany)上。然后进行与过氧化物酶抗过氧化物酶可溶性复合体抗体(sigmap1291)的温育并用tris缓冲盐水/1％tween-20进行洗涤步骤。supersignaltmwestpicochemiluminescentsubstrate(thermofisher34080,bremen,germany)试剂盒用作检测系统。
时程实验的数据分析
热和黑暗拟南芥样品来自时程实验(caldana(2011)(上述引文))。如前所述(giavalisco(2011)(上述引文))，使用以正电离模式和负电离模式与exactive质谱仪(thermofisher)偶联的超高效液相层析法检测2’,3’-camp。进行注释，允许0.1rt和5ppm265偏离参考化合物，得到碎片数据的支持。
2’,3’-camp绝对定量
将2’,3’-camp参考化合物(sigmaa9376)掺入细胞提取物(可溶性级分；参见上文)，浓度范围为100pm至1mm。为了能够区分内源性2’,3’-camp和参考化合物，从用15n标记的细胞中获得裂解物(kierszniowskaetal.(2009)ratio-dependentsignificancethresholdsinreciprocal15n-labelingexperimentsasarobusttoolindetectionofcandidateproteinsrespondingtobiologicaltreatment.proteomics9:1916-1924)。检测到内源性2’,3’-camp，m/z＝333.03(m-h)，而参考化合物的m/z＝328.05(m-h)，差异对应于5个氮原子。所有样品均用甲基叔丁基醚(mtbe)/甲醇/水溶剂系统提取，分别将蛋白质，脂质和极性化合物分离成沉淀，有机相和水相(giavalisco(2011)(同上)。))。如前所述(giavalisco(2011)(上述引文))，使用超性能液相层析联用exactive质谱仪(thermofisher)以正离子和负离子模式测量样品。对于增加浓度的2’,3’-camp标准测量的相对强度用于绘制校准曲线；线性范围为100nm至100μm。
重组蛋白的来源
tia1蛋白购自origene(herford，germany)。将rbp47b作为c末端gfp融合物(以增加蛋白质溶解度)克隆到gateway(karlsruhe，germany)盒的n-末端含有his6-标签的大肠杆菌表达载体pdest14中。表达his6-rbp47b-gfp的rosetta细胞在28℃生长过夜，第二天移至补充1％蔗糖和相关抗生素的terrificbroth培养基中。通过加入0.1mmiptg诱导od0.4的培养物，并转移至16℃过夜培养。
第二天，用avestin(mannheim，germany)emulsiflexc3匀浆器破碎细胞，并使用咪唑-梯度纯化在ni-nta琼脂糖(qiagen34080，hilden，germany)中纯化蛋白质。接下来，我们进行大小排阻层析并收集12个蛋白质级分。rbp47b以两个级分洗脱，第一个作为his6-rbp47b-gfp融合物，第二个作为his6-rbp47b融合物：gfp标签的自发切割是有记录的现象(birdetal.(2015)greenfluorescentprotein-basedexpressionscreeningofmembraneproteinsinescherichiacoli.jvisexp:e52357)。his6-rbp47b用于mst测量。通过sds-page评估蛋白质纯度，并使用抗his6抗体使用蛋白质印迹进行蛋白质鉴定。
微量热泳
使用monolithnt.115仪器(nanotemper，münchen，germany)进行mst测量。将毛细管作为13-16点配体滴定组装入仪器中。根据制造商的说明，使用monolithtm蛋白质标记试剂盒red-nhs(胺反应性；mo-l001)在磷酸盐缓冲液(pbs)中标记蛋白质(rb47b和tia1)。通过改变led功率来优化激发以产生高于200au的发射强度，对应于10-50nm标记的蛋白质。monolith功率设定为60％。将配体[2’,3’-camp(sigmaa9376)]和[3’,5’-camp(sigmaa6885)]溶解在pbs中。使用0.5％tween和优质涂层毛细管来防止粘连。未标记的tia1和rbp47b用作自组装实验中的配体。mo亲和力分析软件用于分析(kd计算)并可视化数据。提交的数据来自2-3个技术平行测定。
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