血脑屏障功能障碍的生物标志物的制作方法

本发明涉及可用于确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障受损的风险中的生物标志物和生物标志物组合。本发明还涉及可用于确定个体是否处于发展成认知损害(例如，阿尔茨海默病或血管性认知损害)的风险中的生物标志物和生物标志物组合。

背景技术：

血脑屏障(bbb)是将循环血液与大脑分离开的选择性屏障。bbb由通过紧密连接蛋白质而结合在一起的内皮细胞构成，其中紧密连接蛋白质形成面向脑内小血管的管腔侧的血液。此外，星形细胞(具体地讲是那些细胞的突出部，被称为星形细胞脚板)和周皮细胞促进bbb的结构和功能。

bbb的内皮细胞表达多个底物特异性运输系统，这些运输系统控制营养物质、能量代谢物以及其它必要分子从血液到脑的运输以及代谢废物从脑组织间液到血液的运输(aspelunda.etal.2015,j.exp.28(212):991-999(aspelunda.等人，《实验医学杂志》，第28卷第212期，第991-999页))。因此，bbb充当神经系统中关键的自我平衡位点，因为其连接中枢神经系统(cns)、体循环以及身体中的主要系统，诸如呼吸系统、泌尿系统、肝脏系统和免疫系统(zhao,zetal.2015,cell163,1064-1078(zhao,z等人，2015年，《细胞》，第163卷，第1064-1078页))。

多个研究都将bbb功能障碍与认知损害相关联。例如，尸检分析证明阿尔茨海默病患者存在bbb受损(zlokovic,bv,2008,neuron,57,178-201(zlokovic,bv，2008年，《神经元》，第57卷，第178-201页))。此外，神经影像研究显示阿尔茨海默病患者存在铁积聚和微出血，这表明在人生的一些时间点，大脑中存在微量出血或小血管破裂(montagnea.etal.2015,neuron,85,296-302(montagnea等人，2015年，《神经元》，第85卷，第296-302页))。进一步的研究表明，与年龄相仿的对照者相比，所有痴呆患者(包括阿尔茨海默病患者)的血源性白蛋白的脑脊液(csf)对血清之比更大(bowmangletal.2008aginghealth,4,47-55(bowmangl等人，2008年，《老年健康》，第4卷，第47-55页))。事实上，bbb功能的这种量度与阿尔茨海默病的进程加速相关联，而与年龄和其它阿尔茨海默病风险因素无关(bowmangletal.,2008,neurology,68,1809-1814(bowmangl等人，2008年，《神经病学》，第68卷，第1809-1814页))。

bbb功能障碍被认为是引发年龄相关认知减退、认知损害和痴呆(包括阿尔茨海默病及其进展)发展风险的血管动因。

因此，迫切需要识别活体个体尤其是未表现出认知损害症状或未被诊断为患有认知损害的个体的bbb功能障碍的方法。对个体进行bbb受损早期诊断可实现治疗性干预，从而可能预防或降低个体与bbb受损相关联病症的进展，例如认知损害，诸如阿尔茨海默病(ad)、轻度认知功能障碍(mci)、血管性认知障碍、血管性痴呆、帕金森病(pd)、外伤性脑损伤(tbi)以及年龄相关认知减退。

技术实现要素：

本发明人证实，某些脑脊液(csf)和血清生物标志物可鉴定个体尤其是老年人是否具有血脑屏障(bbb)受损。

具体地讲，本发明人收集了118名年龄在55岁及以上的成年人的csf和血清样本，用以分析炎症生物标志物与bbb功能之间的横截面关系。以先验方式将bbb功能障碍定义为csf对血清白蛋白之比大于或等于9.0。本发明人执行了最小绝对收缩和选择算子(lasso)逻辑回归分析，以选择对患有bbb受损的个体进行最佳分类的生物标志物。随后，通过计算接收者操作特征(roc)曲线下方的面积来评估诊断的准确性。

本发明人确定了用于鉴定bbb受损的生物标志物。此类生物标志物包括血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc；也称为c-c基序趋化因子22，ccl22)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)、血管内皮生长因子(vegf)和/或白介素8(il-8)。

因此，在一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含血清淀粉样蛋白a(saa)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含血清淀粉样蛋白a(saa)。

在一个实施方案中，认知损害选自：阿尔茨海默病(ad)、血管性认知损害和血管性痴呆、帕金森病(pd)、年龄相关认知减退和外伤性脑损伤(tbi)。优选地，认知损害是阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，saa是人saa。

在一个实施方案中，saa是saa1、saa2或saa4，优选地是saa1。

在一个实施方案中，该方法还包括确定得自个体的样本中巨噬细胞来源趋化因子(mdc)的水平。

在一个实施方案中，该方法还包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)、血管内皮生长因子(vegf)和白介素8(il-8)。

在一个实施方案中，该方法还包括确定得自个体的样本中可溶性细胞间粘附分子1(sicam-1)的水平。

在一个实施方案中，该方法还包括确定得自个体的样本中血管内皮生长因子(vegf)的水平。

在一个实施方案中，该方法还包括确定得自个体的样本中白介素8(il-8)的水平。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含巨噬细胞来源趋化因子(mdc)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)、血管内皮生长因子(vegf)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含巨噬细胞来源趋化因子(mdc)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)、血管内皮生长因子(vegf)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、血管内皮生长因子(vegf)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、血管内皮生长因子(vegf)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含血管内皮生长因子(vegf)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含血管内皮生长因子(vegf)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)和白介素8(il-8)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含白介素8(il-8)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)和血管内皮生长因子(vegf)。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的方法，该方法包括确定一个或多个得自个体的样本中一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物包含白介素8(il-8)。该方法还可包括确定一个或多个得自个体的样本中选自以下的一种或多种生物标志物的水平：血清淀粉样蛋白a(saa)、巨噬细胞来源趋化因子(mdc)、可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)和血管内皮生长因子(vegf)。

在一个实施方案中，该方法包括确定得自个体的一个或多个样本中saa、mdc、sicam-1、vegf和il-8的水平。

在一个实施方案中，将一种或多种生物标志物的水平与一个或多个参考值进行比较。在此情况下，优选地使用相同的分析方法确定每个样本中的每种生物标志物水平和对应的参考值。参考值可基于例如先前已被确定为具有正常或受损血脑屏障的个体群体中一种或多种生物标志物的值(例如，平均值)。

在一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种生物标志物的水平与个体的一个或多个人口统计学、临床和/或生活方式特征相结合。优选地，人口统计学变量包括年龄、性别和教育水平。优选地，临床变量包括存在其它病症，诸如糖尿病、肥胖症和高血压。优选地，生活方式特征为个体是吸烟者还是不吸烟者。

在另一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种生物标志物的水平与个体的一个或多个人口统计学、临床和/或生活方式特征相结合，其中临床量度包括阿尔茨海默病生物学参数，诸如apoee4等位基因的存在情况、临床痴呆评定量表(cdr)、csfabeta1-42、磷酸化-tau181和总tau(t-tau)。

在一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种生物标志物的水平与个体的性别相结合。

在一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种生物标志物的水平与个体的年龄相结合。

在一个实施方案中，该方法包括确定代表预示血脑屏障(bbb)受损的值。这可被称为血脑屏障受损得分(s)，可使用公式计算得出：

s＝a+b×(il-8)+c×(mdc)+d×(saa)+e×(sicam-1)+f×(vegf)+g×(性别)

其中a、b、c、d、e、f和g为系数。系数可根据预先确定的模型来选择。如果s高于或低于预定水平，例如如果s>0，则可预测血脑屏障受损。

在一个实施方案中，方法包括使用公式确定血脑屏障受损得分(s)：

s＝-1.04+6.20×10^-4×log10(il-8)+2.24×10^-1×log10(mdc)+2.33×10^-1×log10(saa)+1.28×log10(sicam-1)+4.31×10^-1×log10(vegf)-5.16×10^-1×sex_value

其中sex_value＝-sqrt(2)/2适用于男性，sex_value＝+sqrt(2)/2适用于女性，代表性别，并且其中如果s>0，则预测存在血脑屏障(bbb)受损。生物标志物sicam1、vegf、il8、saa和mdc以pg/ml测量。

在一个实施方案中，saa的水平在血清样本中测定。在另一个实施方案中，saa的水平在脑脊液(csf)样本中测定。

在一个实施方案中，mdc的水平在血清样本中测定。在另一个实施方案中，mdc的水平在脑脊液(csf)样本中测定。

在一个实施方案中，sicam1的水平在血清样本中测定。在另一个实施方案中，sicam1的水平在脑脊液(csf)样本中测定。

在一个实施方案中，vegf的水平在血清样本中测定。在另一个实施方案中，vegf的水平在脑脊液(csf)样本中测定。

在一个实施方案中，il-8的水平在血清样本中测定。在另一个实施方案中，il-8的水平在脑脊液(csf)样本中测定。

在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的水平在一个或多个csf样本中测定。

在一个实施方案中，个体是人。

在一个实施方案中，个体是年老的人。在另一个实施方案中，个体是年龄超过30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁的人。优选地，个体是年龄在55岁以上的人。

在一个实施方案中，个体基本上不表现出认知损害的任何症状。

在一个实施方案中，个体未被诊断为患有认知损害。

优选地，该方法为体外方法。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或是否处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的试剂盒，其中试剂盒包含一种或多种抗体，优选地为2种、3种、4种或5种抗体，其中每种抗体对于如本文所公开的生物标志物是特异性的。

在另一个方面，本发明提供一种确定个体是否处于发展成认知损害的风险中的试剂盒，其中试剂盒包含一种或多种抗体，优选地为2种、3种、4种或5种抗体，其中每种抗体对于如本文所公开的生物标志物是特异性的。

在另一个方面，本发明提供一种治疗或预防血脑屏障(bbb)受损的方法，该方法包括以下步骤：

(a)根据本发明的方法确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或是否处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中；以及

(b)向被鉴定为需要干预的个体应用能够改善血脑屏障(bbb)功能的干预。

在另一个方面，本发明提供一种预防或降低认知损害风险的方法，该方法包括以下步骤：

(a)根据本发明的方法确定个体是否处于发展成认知损害的风险中；以及

(b)向被鉴定为需要干预的个体应用能够预防或降低认知损害风险的干预。

在一个实施方案中，干预为膳食干预。

在一个实施方案中，膳食干预包括增加由个体摄入的维生素b，优选地通过施用维生素b补充剂来增加。

在一个实施方案中，膳食干预包括增加由个体摄入的ω-3脂肪酸，优选地通过施用ω-3脂肪酸补充剂来增加。

在另一个方面，本发明提供一种对个体的生活方式改变进行选择的方法，该方法包括以下步骤：

(a)根据本发明的方法确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或是否处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中；以及

(b)选择能够改善被鉴定为需要该改变的个体的血脑屏障(bbb)功能的生活方式改变。

在另一个方面，本发明提供一种对个体的生活方式改变进行选择的方法，该方法包括以下步骤：

(a)根据本发明的方法确定个体是否处于发展成认知损害的风险中；以及

(b)选择能够预防或降低被鉴定为需要该改变的个体的认知损害风险的生活方式改变。

在一个实施方案中，方法还包括向个体应用所选的生活方式改变。

在一个实施方案中，生活方式改变包括如本文所公开的膳食干预。

在另一个方面，本发明提供一种用于治疗或预防血脑屏障(bbb)受损的膳食产品，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为具有血脑屏障受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的个体。

在另一个方面，本发明提供一种用于预防或降低认知损害风险的膳食产品，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为处于发展成认知损害的风险中的个体。

在另一个方面，本发明提供将膳食产品用于制造治疗或预防血脑屏障(bbb)受损的药物方面的用途，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的个体。

在另一个方面，本发明提供将膳食产品用于制造预防或降低认知损害风险的药物方面的用途，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为处于发展成认知损害的风险中的个体。

在另一个方面，本发明提供将膳食产品用于治疗或预防血脑屏障(bbb)受损方面的用途，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为具有血脑屏障(bbb)受损或处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中的个体。

在另一个方面，本发明提供将膳食产品用于预防或降低认知损害风险方面的用途，其中根据本发明的方法将该膳食产品施用于被确定为处于发展成认知损害的风险中的个体。

在一个实施方案中，膳食产品为维生素b补充剂。在另一个实施方案中，膳食产品为ω-3脂肪酸补充剂。

在另一个方面，本发明提供一种包括计算机可执行指令的计算机程序产品，该指令致使可编程计算机根据本发明所公开的方法确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或是否处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中。

在另一个方面，本发明提供一种包括计算机可执行指令的计算机程序产品，该指令致使可编程计算机根据本发明所公开的方法确定个体是否处于发展成认知损害的风险中。

在另一个方面，本发明提供一种包括计算机可执行指令的计算机程序产品，该指令致使可编程计算机在已给出一种或多种得自使用者的生物标志物的水平的情况下确定个体是否具有血脑屏障(bbb)受损或是否处于发展成血脑屏障(bbb)受损的风险中，其中生物标志物选自一种或多种如本文所公开的生物标志物。

在另一个方面，本发明提供一种包括计算机可执行指令的计算机程序产品，该指令致使可编程计算机在已给出一种或多种得自使用者的生物标志物的水平的情况下确定个体是否处于发展成认知损害的风险中，其中生物标志物选自一种或多种如本文所公开的生物标志物。

附图说明

图1

老年人血脑屏障(bbb)受损的脑脊液(csf)炎性特征图。对参考模型(标记为“refref”)和最佳模型(标记为“neuro”)进行血脑屏障(bbb)受损诊断得到的接收者操作特征(roc)曲线。对于参考模型，曲线下方的面积(auc)为0.80，而对于最佳模型，曲线下方的面积(auc)为0.95。选自最佳模型的变量为：性别和5种csf生物标志物(il-8、sicam-1、vegf、saa和mdc)。

图2

在研究队列的csf和血清中测得的血清淀粉样蛋白a(saa)的浓度相关性。浓度(以pg/ml计)经过对数转换。r为0.7083，r2为0.5017，并且p<1e-5。

具体实施方式

现将通过非限制性示例来描述本发明的各优选特征和实施方案。

除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围之类。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.(1989)“molecularcloning：alaboratorymanual”，第二版，coldspringharborlaboratorypress；ausubel,f.m.等人(1995andperiodicsupplements)currentprotocolsinmolecularbiology,ch.9,13and16,johnwiley&sons；roe,b.、crabtree、j.和kahn,a.，1996年，“dnaisolationandsequencing:essentialtechniques”，johnwiley&sons；polak,j.m.和mcgee,j.o’d.，1990年，“insituhybridization:principlesandpractice”，oxforduniversitypress；gait,m.j.(1984)oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；以及lilley,d.m.and和dahlberg,j.e.(1992)methodsinenzymology:dnastructuresparta:synthesisandphysicalanalysisofdna,academicpress。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。

血脑屏障(bbb)

血脑屏障(bbb)是将循环血液与大脑分离开的选择性屏障。bbb由通过紧密连接蛋白质而结合的单层内皮细胞构成，紧密连接蛋白质形成脑内小血管的管腔。此外，星形细胞(具体地讲是自那些细胞的突出部，称为星形细胞脚板)和周皮细胞促进bbb的结构和功能。

bbb控制所有周边循环因子的进入，诸如水扩散、一些气体和脂溶性分子的进入，以及其它物质的选择性运输，诸如葡萄糖、氨基酸以及对神经功能而言至关重要的微量营养素。相反地，bbb保护大脑以免可能将中枢神经系统(cns)置于风险中的有毒物质通过。

术语“血脑屏障(bbb)受损”是指没有正确充当循环与大脑之间的选择性屏障的bbb。如本文所用，术语“血脑屏障(bbb)受损”可等同于“血脑屏障(bbb)功能障碍”。

一个示例情况是在循环中更为丰富的某些较大蛋白质开始渗透bbb(“泄漏”)，并且渗入脑脊液(csf)也是bbb受损的一个情况。

bbb受损可能发生在例如csf对血清白蛋白之比大于正常值的个体中，例如csf对血清白蛋白之比大于或等于5、6、7、8或9，优选地大于或等于9。

认知损害

多项研究观察到具有所有痴呆形式(包括阿尔茨海默病)的bbb功能障碍。例如，尸检分析证明阿尔茨海默病患者存在bbb受损。此外，神经影像研究显示阿尔茨海默病患者存在铁积聚和微出血，这表明在人生的一些时间点，大脑中存在微量出血或小血管破裂。进一步的研究表明，与年龄相仿的对照者相比，所有痴呆患者(包括阿尔茨海默病患者)的血源性白蛋白的脑脊液(csf)对血清之比更大。事实上，bbb功能的这种量度与阿尔茨海默病的进程加速相关联，而与年龄和其它阿尔茨海默病风险因素无关。

因此，bbb功能障碍似乎是导致认知损害诸如阿尔茨海默病形成并发展的重要风险因素。

术语“认知”是指一套精神思考能力和注意力领域以及处理速度、短期和长期记忆、工作记忆、计划和灵活性的执行功能、决策制定、判断和评价、推理和“计算”、问题解决能力、理解和语言。“认知损害”是指这些认知领域中的一者或多者发生恶化。

技术人员可使用多种经验证的用于评估例如信息处理速度、执行功能和记忆的标准化神经心理测试中的任一种来轻松地评估认知水平和改善。

合适的示例测试包括简易智力状况检查(mmse)、临床痴呆评定量表(cdr)、剑桥神经心理自动化成套测试(cantab)、阿尔茨海默病评估量表-认知测试(adascog)、威斯康星卡片分类测验、词语和图形流畅性测验以及连线测验。

此外，大脑的医学成像提供对大脑功能的评定。用于评估大脑功能的医学成像技术的示例包括：脑电图(eeg)、脑磁图(meg)、正电子发射计算机断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、核磁共振成像(mri)、功能性磁共振成像(fmri)、计算机控制断层扫描和长时程增强。还可使用动态钆增强mri来评估血脑屏障(bbb)功能。

eeg(大脑的电活动的量度)是通过将电极放置在各种界标处的头皮上并记录极大放大的脑信号来完成的。meg与eeg类似，它测量与电场有关的磁场。meg用于测量自发性脑活动，包括神经系统中的同步波。

pet提供了氧利用率和葡萄糖代谢的量度。在该技术中，施用放射性正电子发射示踪剂，并且脑摄取示踪剂与脑活动相关。这些示踪剂发射的伽玛射线由头部周围的传感器检测，从而得到脑激活的3d绘制图。一旦该示踪剂被脑摄取，则检测到的放射性就作为局部大脑血流量的函数发生。在激活期间，大脑血流量和神经元葡萄糖代谢的增加可以在数秒内被检测到。

合适的分析也可基于神经心理测试、一般性和神经学检查以及个体对认知减退(例如，主观记忆丧失)抱怨。

认知损害可例如解释为在合适测试的任何时间点表现具有统计意义上显著的差异。

阿尔茨海默病(ad)

阿尔茨海默病由大脑区域萎缩所致。虽然人们不知道是什么引发萎缩，但研究发现在阿尔茨海默病患者的大脑中存在淀粉样斑块、神经纤维缠结和乙酰胆碱失衡。大脑中可能损伤健康神经元的血管损伤在阿尔茨海默病患者中也是常见的。

阿尔茨海默病是影响多个脑功能的渐进式病症。疾病的早期迹象通常包括较小的记忆问题，例如忘记最近的活动或位置或物体的名字。随着疾病的发展，记忆问题变得越来越严重并且可引起另外的症状，诸如混淆、定向障碍、难以做出决定、言语障碍以及人格改变。

血管性痴呆

血管性痴呆由流向大脑的血液减少所致，血液减少将损伤脑细胞。减少的血流可由多种原因引起，包括脑血管变窄(皮层下血管性痴呆)、中风(单发梗塞性痴呆)以及多次小中风(多发梗塞性痴呆)。另外，减少的血流还可能由阿尔茨海默病所致，阿尔茨海默病是被称为混合性痴呆的组合症状。

血管性痴呆的早期症状包括思维缓慢、规划困难、语言困难、注意力和专注度问题以及行为改变。在数月或数年的稳定期之后，症状通常逐步恶化。

帕金森病(pd)

帕金森病是黑质中的神经细胞渐进损伤的病症。大脑该区域中的神经细胞产生多巴胺，多巴胺充当大脑部分与控制身体运动的神经系统之间的信使。这些神经细胞损伤导致大脑中所产生的多巴胺量减少，产生的影响是减弱大脑中控制运动的部分的功能。

帕金森病的症状包括震颤、动作迟缓以及肌肉僵硬和不灵活。帕金森病患者还可能经历另外的症状，包括抑郁、便秘、失眠、嗅觉缺失和记忆问题。

年龄相关认知减退

年龄相关认知减退是与变老相关联的正常非病理性认知功能下降。虽然某些心智功能表现出少许年龄相关的减退(例如，语言、阅读和词汇技能，一些数字能力和常识)，但其它心智功能从中年就开始下降(例如，情景记忆、执行功能、处理和推理速度)。个体受年龄相关认知减退的影响程度因人而异。

年龄相关认知减退通常不被视为严重到满足轻度认知损害的条件。轻度认知损害(mci)被视为是对至少一种不影响日常生活活动的认知领域的认知缺陷的客观评价(根据年龄和性别有所调整)。相比之下，要诊断出很有可能患阿尔茨海默病，需要有至少两个认知领域受到损伤并且日常生活活动受到损害。

外伤性脑损伤(tbi)

外伤性脑损伤是源于外部机械力的非先天性脑损伤，可能导致认知、身体和心理社会功能的永久或暂时性损害，伴有相关联的意识减弱或意识状态改变。

生物标志物

血清淀粉样蛋白a(saa)

血清淀粉样蛋白a(saa)是与血浆中的高密度脂蛋白(hdl)相关联的阿朴脂蛋白，主要由肝脏产生。

在一个实施方案中，saa是人saa。

已知有多种同工型的人saa。在一个实施方案中，saa是saa1、saa2或saa4，优选地是saa1。

saa1的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_000322.2保藏的序列。

saa1的另一个示例性氨基酸序列为：

mklltglvfcslvlgvssrsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggvwaaeaisdareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpaglpeky

(seqidno:1)

saa1的另一个示例性氨基酸序列为：

mklltglvfcslvlgvssrsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevisdareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpaglpeky

(seqidno:2)

saa1可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，saa1的另一个示例性氨基酸序列为：

rsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevisdareniqrffghgaedsladqaanewgrsgkdpnhfrpaglpeky

(seqidno:3)

saa2具有两个剪接变体。saa2的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_110381.2保藏的序列。

saa2的另一个示例性氨基酸序列为：

mklltglvfcslvlsvssrsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevisnareniqrltgrgaedsladqaankwgrsgrdpnhfrpaglpeky

(seqidno:4)

saa2可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，saa2的另一个示例性氨基酸序列为：

rsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevisnareniqrltgrgaedsladqaankwgrsgrdpnhfrpaglpeky

(seqidno:5)

saa2的另一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_001120852.1保藏的序列。

saa2的另一个示例性氨基酸序列为：

mklltglvfcslvlsvssrsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevislfsael

(seqidno:6)

saa2可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，saa2的另一个示例性氨基酸序列为：

rsffsflgeafdgardmwraysdmreanyigsdkyfhargnydaakrgpggawaaevislfsael

(seqidno:7)

saa4的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_006503.2保藏的序列。

saa4的另一个示例性氨基酸序列为：

mrlftgivfcslvmgvtseswrsffkealqgvgdmgraywdimisnhqnsnrylyargnydaaqrgpggvwaaklisrsrvylqglidcylfgnsstvledsksnekaeewgrsgkdpdrfrpdglpkky

(seqidno:8)

saa4可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，saa4的另一个示例性氨基酸序列为：

eswrsffkealqgvgdmgraywdimisnhqnsnrylyargnydaaqrgpggvwaaklisrsrvylqglidcylfgnsstvledsksnekaeewgrsgkdpdrfrpdglpkky

(seqidno:9)

巨噬细胞来源趋化因子(mdc)

巨噬细胞来源趋化因子(mdc)蛋白质由树突细胞和巨噬细胞分泌。mdc与细胞表面趋化因子受体诸如ccr4相互作用以引出针对靶细胞的效应，并且这在将活化的/效应器t淋巴细胞转运到炎症部位时可能有所涉及。

mdc也被称为c-c基序趋化因子22(ccl22)。

在一个实施方案中，mdc是人mdc。

mdc的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_002981.2保藏的序列。

mdc的另一个示例性氨基酸序列为：

mdrlqtallvvlvllavalqateagpyganmedsvccrdyvryrlplrvvkhfywtsdscprpgvvlltfrdkeicadprvpwvkmilnklsq

(seqidno:10)

mdc可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，mdc的另一个示例性氨基酸序列为：

gpyganmedsvccrdyvryrlplrvvkhfywtsdscprpgvvlltfrdkeicadprvpwvkmilnklsq

(seqidno:11)

可溶性细胞间粘附分子1(sicam-1)

可溶性细胞间粘附分子-1(sicam-1)是细胞表面结合蛋白质的可溶性细胞粘附分子(scam)类别的成员。具体地讲，sicam-1是icam-1细胞粘附分子的可溶形式。

在一个实施方案中，sicam-1是人sicam-1。人sicam-1的示例为：esvtvtrdlegtylcrarstqgevtreppgmrlssslw

(seq.idno.12)

血管内皮生长因子(vegf)

血管内皮生长因子(vegf)是刺激血管生成和血管新生的信令蛋白。

在一个实施方案中，vegf是人vegf。

在一个实施方案中，vegf是vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d或胎盘生长因子(pgf)，优选地vegf是vegf-a。

vegf的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_001165094.1保藏的序列。

vegf的另一个示例性氨基酸序列为：

mnfllswvhwslalllylhhakwsqaapmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqekksvrgkgkgqkrkrkksrykswsvyvgarcclmpwslpgphpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprr

(seqidno:13)

vegf可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，vegf的另一个示例性氨基酸序列为：

apmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqekksvrgkgkgqkrkrkksrykswsvyvgarcclmpwslpgphpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprr

(seqidno:14)

氨基酸序列vegf-a同工型的另外示例为：

mnfllswvhwslalllylhhakwsqaapmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqekksvrgkgkgqkrkrkksrykswsvyvgarcclmpwslpgphpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprr

(seqidno:15)

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(seqidno:16)

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(seqidno:17)

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(seqidno:18)

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(seqidno:19)

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(seqidno:20)

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(seqidno:21)

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(seqidno:23)

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(seqidno:24)

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(seqidno:25)

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(seqidno:26)

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(seqidno:27)

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(seqidno:28)

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(seqidno:30)

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(seqidno:31)

vegf-b同工型的另外示例为：

mspllrrlllaallqlapaqapvsqpdapghqrkvvswidvytratcqprevvvpltvelmgtvakqlvpscvtvqrcggccpddglecvptgqhqvrmqilmirypssqlgemsleehsqcecrpkkkdsavkpdraatphhrpqprsvpgwdsapgapspadithptpapgpsahaapsttsaltpgpaaaaadaaassvakgga

(seqidno:32)

mspllrrlllaallqlapaqapvsqpdapghqrkvvswidvytratcqprevvvpltvelmgtvakqlvpscvtvqrcggccpddglecvptgqhqvrmqilmirypssqlgemsleehsqcecrpkkkdsavkpdsprplcprctqhhqrpdprtcrcrcrrrsflrcqgrglelnpdtcrcrklrr

(seqidno:33)

vegf-c同工型的示例为：

mhllgffsvacsllaaallpgpreapaaaaafesgldlsdaepdageatayaskdleeqlrsvssvdelmtvlypeywkmykcqlrkggwqhnreqanlnsrteetikfaaahynteilksidnewrktqcmprevcidvgkefgvatntffkppcvsvyrcggccnseglqcmntstsylsktlfeitvplsqgpkpvtisfanhtscrcmskldvyrqvhsiirrslpatlpqcqaanktcptnymwnnhicrclaqedfmfssdagddstdgfhdicgpnkeldeetcqcvcraglrpascgphkeldrnscqcvcknklfpsqcganrefdentcqcvckrtcprnqplnpgkcacectespqkcllkgkkfhhqtcscyrrpctnrqkacepgfsyseevcrcvpsywkrpqms

(seqidno:34)

vegf-d同工型的示例为：

myrewvvvnvfmmlyvqlvqgssnehgpvkrssqstlerseqqiraassleellrithsedwklwrcrlrlksftsmdsrsashrstrfaatfydietlkvideewqrtqcspretcvevaselgkstntffkppcvnvfrcggccneeslicmntstsyiskqlfeisvpltsvpelvpvkvanhtgckclptaprhpysiirrsiqipeedrcshskklcpidmlwdsnkckcvlqeenplagtedhshlqepalcgphmmfdedrcecvcktpcpkdliqhpkncscfeckesletccqkhklfhpdtcscedrcpfhtrpcasgktacakhcrfpkekraaqgphsrknp

(seqidno:35)

白介素8(il-8)

白介素8(il-8)是由巨噬细胞、上皮细胞、气道平滑肌细胞和内皮细胞产生的趋化因子。il-8结合到多种细胞表面受体，包括cxcr1和cxcr2，并且它是先天免疫应答的重要媒介物。

il-8也称为趋化因子(c-x-c基序)配体8(cxcl8)。

在一个实施方案中，il-8是人il-8。

il-8的一个示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_000575.1保藏的序列。

il-8的另一个示例性氨基酸序列为：

mtsklavallaaflisaalcegavlprsakelrcqciktyskpfhpkfikelrviesgphcanteiivklsdgrelcldpkenwvqrvvekflkraens(seqidno:36)

il-8可例如通过分裂信号肽而被加工成成熟形式。因此，il-8的另一个示例性氨基酸序列为：

avlprsakelrcqciktyskpfhpkfikelrviesgphcanteiivklsdgrelcldpkenwvqrvvekflkraens

(seqidno:37)

确定生物标志物的水平

样本中各个生物标志物物质的水平可通过本领域已知的任何合适的方法测量或确定。例如，可使用质谱(ms)、基于抗体的检测方法(例如酶联免疫吸附测定(elisa))、基于非抗体蛋白质支架的方法(例如纤粘蛋白质支架)、放射性免疫测定(ria)或基于适体的方法。也可使用其它光谱学方法、色谱法、标记技术或定量化学方法。

在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的水平可通过结合到对一种或多种生物标志物为特异性的一种或多种抗体来确定。合适的抗体是已知的或可使用已知的技术生成。

用于检测抗体水平的合适方法包括但不限于免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法、western印迹和免疫沉淀法。

优选地，使用夹心免疫测定法确定一种或多种生物标志物的水平。

抗体可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其片段，前提条件是其特异性结合到进行检测的生物标志物。抗体可通过包括将动物用目标抗原免疫然后从血清分离抗体的标准技术获得。单克隆抗体可通过kohler等人(kohleretal.(1975)nature256：495(kohler等人，1975年，《自然》，第256卷：第495页))首次描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组dna方法(例如，us4816567中所公开)制得。单克隆抗体也可使用例如以下文献中所描述的技术从噬菌体抗体库分离出来：clackson等人(clacksonetal.(1991)nature352:624-628(clackson等人，1991年，《自然》，第352卷：第624-628页))和marks等人(marksetal.(1991)j.mol.biol.222:581-597(marks等人，1991年，《分子生物学杂志》，第222页：第581-597页))。抗体也可以是嵌合抗体或人源化抗体。

在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的水平可通过将样本用标记该一种或多种生物标志物的试剂染色而确定。“染色”通常是组织学方法，该方法使得生物标志物可例如通过显微技术诸如使用可见光或荧光的那些技术检测。

在一个实施方案中，生物标志物在样本中通过免疫组织化学(ihc)检测。在ihc中，生物标志物可通过特异性结合到生物标志物中的一种或多种的抗体来进行检测。

可获得两种基于抗体检测的一般方法(包括针对基于ihc的方法)：直接测定法和间接测定法。根据第一种测定法，直接确定抗体与目标抗原的结合。该直接测定法使用经标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的一抗，该试剂可在无进一步抗体相互作用的情况下可视化。

在典型的间接测定法中，未偶联的一抗结合到抗原，然后经标记的二抗结合到一抗。在二抗偶联到酶标记的情况下，添加显色或荧光底物以可视化抗原。由于数个二抗可与一抗上的不同表位反应，发生信号放大。

所用的一抗和/或二抗可用能够检测的部分进行标记。许多标记是可用的，包括放射性同位素、胶体金粒子、荧光标记和各种酶-底物标记。荧光标记包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红(texasred)、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺(lissamine)、伞形酮、藻红蛋白和藻青蛋白，和/或上述标记中任一种或多种的衍生物。荧光标记可用已知的技术偶联到抗体。

各种酶-底物标记是可用的(例如，us4275149中所公开)。酶通常催化显色底物的化学改变，这种改变可通过显微镜例如在可见光下检测。例如，酶可催化底物的颜色变化，或可改变底物的荧光或化学发光。酶标记的示例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；例如，在us4737456中所公开)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(hrpo)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖糖化酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如，尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶偶联到抗体的技术是熟知的。

通常，ihc方法可包括检测图像中被染色区域的步骤。图像中对应于与生物标志物相关的染色的像素可通过颜色转换方法鉴定，例如，如us6553135和us6404916中所公开。在此类方法中，所关注的染色对象可通过识别与染色相关的独特颜色而鉴定。该方法可包括将图像的像素转化成不同的色彩空间，并应用阈值以抑制背景染色。例如，可形成两个rgb信号值的比率，以提供区分色彩信息的方式。特定的染色可通过存在特定信号比的最小值而与背景加以区分。例如，对应于主要是红色染色的像素可通过大于最小值的红色除以蓝色(r/b)比率而鉴定。

kongetal.(kongetal.(2013)am.j.clin.nutr.98(6):1385-94(kong等人，2013年，《美国临床营养学杂志》，第98卷第6期：第1385-1394页))描述了亲和素-生物素-过氧化物酶方法的用途，并且两名独立的研究员对阳性染色细胞数计数。

使用适体的检测可包括以下步骤：

特异性识别生物标志物的适体可使用标准核酸合成技术合成或选自大随机序列库，例如使用指数富集配体系统进化(selex)技术；

将适体与样本混合，形成适体-蛋白质络合物；

分离非特异性络合物；

从其靶蛋白中除去结合的适体；

收集并测量适体，例如使用微阵列或质谱技术。

适体可以是以具有折叠成茎、环、四链体、假结、凸部或发夹状物的组合的独特3d结构的单链dna或rna序列。适体的分子识别由分子间相互作用产生，例如芳环的堆叠、静电和范德华相互作用或与目标化合物的氢键合。此外，适体与其靶标之间的特异性相互作用通过诱导契合机理来补充，其需要适体对其靶标采用独特的折叠结构。适体可被修饰以与标记分子诸如染料连接，或固定在珠粒或底物表面以用于不同应用。

样本

本发明包括确定得自个体的一个或多个样本中一种或多种生物标志物的水平的步骤。

优选地，样本为脑脊液(csf)样本或源自血液的样本。

源自血液的样本可包含血液成分或可为全血。优选地，源自血液的样本为血浆或血清样本，最优选地为血清样本。

从个体采集样本的技术是本领域熟知的。

个体

本文所公开的个体优选地为哺乳动物，尤其优选的是人。人和兽类应用均在本发明的范围之内。

例如，个体可为老年人个体，诸如30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁以上年龄段的人。优选地，个体是年龄在55岁以上的人。对于兽类应用而言，动物的年龄应根据人类的情况使用平均寿命进行缩小来校准。

治疗方法

应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、姑息性和预防性治疗；但在本发明的上下文中，对预防的提及更常与预防性治疗相关。治疗还可包括抑制疾病严重性的进展。

膳食干预

术语“膳食干预”是指应用于个体且引起个体的膳食变化的外部因素。

在一个实施方案中，膳食干预是补充有维生素和/或矿物质优选地是补充有维生素b的膳食。

在另一个实施方案中，膳食干预是补充有ω-3脂肪酸的膳食。

在一个实施方案中，膳食干预包括增加由个体摄入的维生素b，优选地通过施用维生素b补充剂来增加。

在另一个实施方案中，膳食干预包括增加由个体摄入的ω-3脂肪酸，优选地通过施用ω-3脂肪酸补充剂来增加。

维生素b可为例如维生素b12、维生素b6和/或叶酸。

ω-3脂肪酸可为例如二十碳五烯酸(epa)或二十二碳六烯酸(dha)，优选地为epa。

膳食可以是适应个体起始体重的膳食。

膳食干预可包括施用至少一种膳食产品。膳食产品可为饮食替代产品或补充剂产品。膳食产品可包括食物产品、饮料、宠物食物产品、食品补充剂、营养品、食品添加剂或营养配方产品。

实施例

实施例1

材料和方法

个体群体

120名55岁或以上的社区居住成年人(他们当中有48名未患有认知损害，72名患有认知损害(轻度认知损害(mci)，n＝63；和轻度痴呆，n＝9))参加了这项研究。临床评价包括神经学和一般检查以及广泛的神经心理学评估。排除患有神经学或精神疾病或患有严重或不稳定内科疾病的个体。随着临床检查一起执行医院焦虑抑郁情绪(had)评定量表(zigmond&snaith,actapsychiatr.scand.(1983)67(6):361-370(zigmond和snaith，《斯堪的纳维亚精神病学学报》，1983年，第67卷第6期：第361-370页))。

患有mci的研究参与者以及患有轻度痴呆的参与者招募自被洛桑大学医院的精神病科的记忆力诊所和临床神经学科的leenaards记忆力中心视为患有认知损害的医院门诊病人，对他们的认知抱怨进行了调查。对mci或轻度痴呆的诊断基于神经心理学评估和临床评估，并且该诊断是由精神病学家和/或神经学家以及神经心理学家的共识会议在纳入本研究之前做出的。例如，mci条件要求记忆力受损(<1.5sd，低于buschke双记忆力测试言语记忆量表(buschkedoublememorytestverbalmemoryscore)的年龄、性别和教育水平调整平均数)(buschke,sliwinski,kuslansky,&lipton,neurology1997,48(4),989-997(buschke、sliwinski、kuslansky和lipton，《神经病学》，1997年，第48卷第4期，第989-997页))和/或另一个认知领域诸如执行任务的受损以及临床痴呆评定评定量表(cdr)(morris,neurology1993,43(11),2412-2414(morris，《神经病学》，1993年，第43卷第11期，第2412-2414页))等于0.5。

可能的阿尔茨海默病痴呆根据得自美国国家老龄化研究所和阿尔茨海默病学会的临床诊断标准以及阿尔茨海默病类型的dsm-iv痴呆标准(美国精神病学协会)定义。该组的参与者具有1.0的cdr。未患有认知损害的参与者(n＝48)没有认知减退的病史或证据，并且cdr评分为0。他们是通过广告招募到的社区居住志愿者或记忆力临床患者的配偶。

神经心理学和功能评价

神经心理学评估包括对记忆力和其它主要认知领域诸如语言、注意力和执行功能的测量。该评估包括简易智力状况检查(folsteinmfetal.1975,j.psychiatr.res12,189-198(folsteinmf等人，1975年，《精神病学研究杂志》，第12卷，第189-198页))、buschke双记忆力测试(buschkehetal.1997,neurology,48,989-997(buschkeh等人，1997年，《神经病学》，第48卷，第989-997页))、顺序和逆序数字记忆广度(wisdomnmetal.2012,archclinneuropsychology27,389-397(wisdomnm等人，2012年，《临床神经心理学档案》，第27卷，第389-397页))、斯特鲁测验(stroopjr1935,j.ofexpt.psychology18,643-662(stroopjr，1935年，《实验心理学杂志》，第18期，第643-662页))、文字流利性测试(cardebatdetal.1990,actaneurolbelg90,207-217(cardebatd等人，1990年，actaneurolbelg，第90卷，第207-217页))以及连线测验a和b(reitanrm1955,j.consultpsychol19,393-394(reitanrm，1955年，《咨询与临床心理学杂志》，第19卷，第393-394页))。功能评价包括adl和仪器adl(iadl)(lawtonmpetal.1969,gerontologist9,179-186(lawtonmp等人，1969年，《老年医学》，第9卷，第179-186页))以及cdr(morrisjc1993,neurology,43,2412-2414(morrisjc，1993年，《神经病学》，第43卷，第2412-2414页))。神经心理成套测试、adl和iadl以及cdr被用于验证纳入和排除条件。

另外的评价

施行神经精神科问卷的简短临床形式(kaufer,d.i.etal.(2000)j.neuropsychiatryclin.neurosci.12:233-9(kaufer,d.i.等人，2000年，《神经精神病学和临床神经科学杂志》，第12卷：第233-239页))，以评估所有参与者的神经精神症状。使用老年疾病累计评分表(millermdetal.1992,psychiatryres41,237-248(millermd等人，1992年，《精神病学研究》，第41卷，第237-248页))来测量参与者个体的内科慢性疾病负担。

脑脊液(csf)和血液采集及处理

在绝食一夜之后，于早上8:30和9:30之间在记忆力中心执行静脉和腰椎穿刺。将血液引入含edta的真空采血管(德国莎斯特(sarstedt,germany))，并向下旋转以得到上层清液(血浆和血清)等分试样用于分析。采用22g“无创伤”腰椎穿刺针在个体处于坐立或卧位时对个体执行腰椎穿刺和脊髓液收集，将10至12mlcsf采集到聚丙烯管中。用2至3ml进行csf细胞计数和蛋白定量，对剩余的csf进行离心、等分、急冻并存储在-80℃下直至进行分析。

神经炎症生物标志物分析

“三明治”免疫测定法(美国马里兰州罗克维尔市的mesoscalediscovery公司(msd)(mesoscalediscovery(msd),rockville,md,usa))在csf和血清中定量了37种分析物(ifn-γ、il-1b、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-13、tnfa、il-1a、il-5、il-7、il-12/23p40、il-15、il-16、il-17a、tnf-b、vegfa、嗜酸粒细胞趋化因子、mip-1b、嗜酸粒细胞趋化因子-3、tarc、ip-10、mip-1a、mcp-1、mdc、mcp-4、vegf-c、vegf-d、tie-2、flt-1、pigf、bfgf、saa、crp、vcam-1、icam-1)。

按照制造商的说明书测量样本。简而言之，用5％msdblockera溶液阻塞预涂覆有所采集抗体的96孔板。制备校准器稀释剂，并且如针对每个含msd稀释剂的试剂盒的建议那样稀释样本。然后将样本和校准器添加至板中，在室温下温育并晃动2小时。用磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph为7.4，美国维吉尼亚州马纳萨斯的康宁公司(corning,manassas,va,usa))-tween20(美国宾夕法尼亚州匹兹堡的飞世尔科技公司(fisherscientific,pittsburgh,pa,usa))的10倍自制溶液冲洗板三次。如每个试剂盒的使用方案中所指示的那样将检测抗体与msd稀释剂混合，在室温下温育并晃动1至2小时。用pbs-tween20溶液冲洗板三次。添加msd读出缓冲器(msdreadbuffer)，在msd仪器(sectorimager6000读取器)上读出板。使用msddiscoveryworkbench软件生成并插置数据。

apoe基因型分型

使用qiagen血液分离试剂盒(德国希尔登的qiagen公司(qiagen,hilden,germany))将白血球基因组dna从9mledta血液中分离出来，并确定apoe基因型。

对人研究的伦理批准

该研究由沃州大学中心医院(chuv)、洛桑医院伦理委员会以及位于瑞士沃州坎顿的州人类伦理研究委员会(cer-vd)批准。取得了所有研究参与者的书面知情同意书。

统计分析-对生物标志物数据的预分析质量控制

在进行假设检验之前，首先通过排除缺失数据超过5％的生物标志物数据对生物标志物数据进行质量控制。通过随机绘制在所观察到的生物标志物值的范围之间的测量值来估算剩余的缺失数据(<5％)。随后对生物标志物数据进行对数转换以得到高斯分布并进行标准化，之后才能用于最终假设检验。

统计分析-参考模型

使用逻辑回归模型分析bbb受损与人口统计学变量(年龄、性别)和候选人阿尔茨海默病生物参数(apoee4等位基因的存在情况、cdr、教育水平、csfabeta1-42、磷酸化-tau181和总tau(t-tau))的关联。所得分类器的性能通过测量以下值进行评估：(i)其接收者操作特征(roc)曲线下方的面积以及其95％置信区间(使用bootstrap方法，迭代次数为1000次)以及(ii)其准确度(所得2×2混淆矩阵中的真阳性数和真阴性数的累积比例)。

bbb受损被定义为csf对血清白蛋白之比大于9.0。

统计分析-最佳模型

使用最小绝对收缩和选择算子(lasso)逻辑回归来选择相关生物标志物特征并建立bbb受损的预测模型。所有生物标志物变量连同参考模型中所用的变量(年龄、性别、apoee4等位基因的存在情况、cdr、教育水平、csfabeta1-42、磷酸化-tau181和总tau(t-tau))都包含在该模型中。这些参考变量作为非惩罚性变量包括在内，以确保不在lasso选择过程中将它们过滤出来并且使得与参考模型具有可比性。使用glmnet包对每个lasso分析执行10倍交叉验证方法，glmnet包允许对正规化参数的每个值的分类错误率进行95％置信区间估计。重复lasso分析100次。选择对100次运行进行交互验证时分类错误率最小的模型。性能由roc曲线下方的面积(auc)估计值评价，并与参考模型相比。

结果与讨论

基线特征示于表1中。118名个体通过缺失数据的预分析质量控制，其中13.5％(n＝16)满足血脑屏障(bbb)受损标准。在患有和不患有bbb受损的个体中，年龄、教育水平、mmse、had量表、cdr、apoee4等位基因的存在情况、csfabeta1-42、csft-tau和csf磷酸化-tau181之间不存在显著差异。然而，患有bbb受损的男性更多。与文献一致，与cdr0的个体相比，cdr0.5/1的个体具有显著更大的白蛋白比，证实了bbb功能的功能性意义。

¹平均和标准偏差(sd)，除非另外指明，否则为mmse(简易智力状况检查)的平均和标准偏差；had，医院焦虑抑郁情绪量表；cdr，临床痴呆评定量表；apoe4，阿朴脂蛋白eε4；

²cdr得分包括0(n＝48)、0.5(n＝61)和1(n＝9)

用于bbb受损分类的csf生物标志物

图1示出针对预测bbb受损计算得出的参考和最佳模型roc曲线。参考模型包括年龄、性别、教育水平、cdr、apoee4等位基因的存在情况以及abeta42、t-tau和磷酸化-tau181的csf水平，得到rocauc＝0.80，并且bbb受损的诊断准确度为87.3％。对于采用包括性别和5种csf生物标志物(sicam-1、vegf、il-8、saa和mdc)的最佳模型，添加经鉴定的csf神经炎症生物标志物将rocauc提高至0.95，并将准确度提高至92.3％。这5种csf生物标志物中每种之间的平均浓度差异示于表1中。

对bbb受损进行最佳分类的五种csf生物标志物：csfsicam-1、vegf、il-8、saa和mdc在患有bbb受损的个体中均更高。

用于bbb受损分类的血清生物标志物

在研究队列中，我们观察到csf和血清中所测得的saa浓度均具有显著相关性(图2)。该观察表明，在人体中，测定血清中saa的浓度可能是测定csf中saa浓度的替代方式。对人血清采样并测定血清中saa的浓度可提供替代测定csf中saa的更少侵入性方式。

在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明的所述方法的各种修改形式和变型形式将在不脱离本发明范围和精神的情况下对本领域的技术人员显而意见。虽然已结合具体优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员显而易见的对用于实践本发明的所述模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。