用于监测细胞凋亡的特异于γ-谷氨酰基-L-ε-赖氨酸(GGEL)的单克隆抗体的制作方法

背景细胞凋亡是在多细胞生物中发生的程序性细胞死亡的严格调节过程。细胞凋亡是细胞中固有的用于衰老和受损细胞的消除以及免疫系统的正常发挥功能的基本机制。与其中发生细胞肿胀的细胞坏死相反，细胞凋亡的特征在于细胞收缩、染色质浓缩、dna片段化成120个碱基对的多重片段以及细胞质成分交联成不溶于洗涤剂的凋亡小体。每个细胞固有的死亡机制的故障可能在各种疾病中起主要或次要作用，其中基本上过少或过多的细胞凋亡(或在错误的地方和/或在错误的时间发生细胞凋亡)分别导致增生性或退行性疾病。细胞凋亡的失调确实能够导致各种疾病(包括自身免疫疾病和神经退行性疾病)中正常组织的破坏(过多的细胞凋亡)或肿瘤的生长(过少的细胞凋亡)。另外，肿瘤的有效治疗需要通过放射、化疗或两者来医源性诱导程序性细胞死亡(blankenbergf,g.,jnuclmedjune2008vol.49no.suppl281s-95s)。已经开发了非侵入性成像方法来使用在细胞凋亡期间结合细胞质膜的示踪剂监测体内细胞凋亡(blankenbergf,g.,jnuclmedjune2008vol.49no.suppl281s-95s；brauerm.,progressinneuro-pyschopharmacology&biologicalpsychiatry2003apr；27(2):323-31)。然而，这些方法特别依赖于磁共振成像(mri)、正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)，因此不是随时可用的。“n-ε-(γ-谷氨酰基)-l-赖氨酸”也称为“γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸”、“nε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸”或“ggel”，其是由转谷氨酰胺酶反应产生的异肽。组织转谷氨酰胺酶是通常存在于许多细胞中的ca2+依赖性细胞质酶。然而，该酶不会被细胞中存在的正常ca2+水平激活。酶的体内激活直到细胞内游离ca2+浓度增加(这通常例如发生在淋巴细胞经历激活诱导的细胞凋亡时)才发生。组织转谷氨酰胺酶在经历细胞凋亡的细胞中被激活以在蛋白质之间形成n-ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键。在细胞凋亡末期形成的凋亡小体具有表面标记磷脂酰丝氨酸(ps)，其代表了由巨噬细胞介导的消除的识别标记。但是这种消除非常迅速地发生，因此淋巴细胞凋亡被低估(mccarthy等人,1998curr.top.dev.biol.vol36p259-278)。相反，凋亡小体中蛋白质的肽键能够被切割，而它们的n-ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键对蛋白质水解具有抗性，并以游离n-ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽的形式释放到血流中。因此，ggel(“释放的ggel”或“游离ggel”)由被诱导至凋亡的细胞的吞噬作用产生，并且是细胞蛋白酶对交联的细胞蛋白的降解的最终产物。在国际专利申请wo96/40985中已经描述了一种定量测量细胞凋亡的方法。该方法应用偶联酶反应以释放赖氨酸并在其中消耗nadh的过程中将赖氨酸转化为酵母氨酸，然后定量nadh消耗。然而，在临床环境例如基于免疫测定的方法中，仍然需要快速、可重复、定量的方法来检测体内细胞凋亡水平。针对ggel的小鼠单克隆抗体ab424可从abcam(cambridge，uk；目录号ab424)获得。ab424如thomas等人2004,j.immunol.methods292,83-95所述分离。然而，ab424与异肽n1,n8双(γ-谷氨酰基)亚精胺交叉反应。因此，多胺交联可能干扰使用抗体的免疫测定中ggel的检测。因此，抗ggel的特异性单克隆抗体的缺乏已经阻碍了用于监测体内细胞凋亡的基于免疫测定的方法的开发。发明概述本发明涉及特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的分离的单克隆抗体，其包含序列seqidno：3的cdr-h1、序列seqidno：4的cdr-h2、序列seqidno：5的cdr-h3、序列seqidno：6的cdr-l1、序列seqidno：7的cdr-l2和序列seqidno：8的cdr-l3。本发明还涉及测量样品中γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的水平的方法，其包括：a)使样品与根据本发明的特异于ggel的单克隆抗体接触；和b)测量与根据本发明的特异于ggel的单克隆抗体形成的复合物的水平；其中样品中ggel的水平是从与特异于ggel的单克隆抗体形成的复合物的水平推断的。本发明还涉及一种用于监测受试者中的细胞凋亡的离体方法，其包括：a)使用根据本发明的特异于ggel的单克隆抗体，用免疫测定法测量受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)将游离ggel的所述测量的水平与对照进行比较；和c)基于与对照的比较监测所述受试者中的细胞凋亡。本发明还涉及根据本发明的特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体用于监测细胞凋亡的用途。本发明还涉及监测受试者中的细胞凋亡诱导治疗的有效性的方法，其包括：a)用权利要求4的方法测量经历细胞凋亡诱导治疗的受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)适时重复步骤a)的测量；和c)如果游离ggel的水平随时间增加，则推断细胞凋亡诱导治疗是有效的，或者如果游离ggel的水平不变或随时间降低，则细胞凋亡诱导治疗是无效的。本发明还提供了监测受试者中的细胞凋亡抑制治疗的有效性的方法，其包括：a)用权利要求4的方法测量经历细胞凋亡抑制治疗的受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)适时重复步骤a)的测量；和c)如果游离ggel的水平随时间降低，则推断细胞凋亡抑制治疗是有效的，或者如果游离ggel的水平不变或随时间增加，则细胞凋亡抑制治疗是无效的。本发明还涉及治疗有此需要的受试者中与失调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)对患有与失调的细胞凋亡相关的疾病的受试者施用细胞凋亡调节治疗，b)通过实施权利要求5或9的监测细胞凋亡的方法，监测所述治疗是否调节受试者的细胞凋亡；和c)基于步骤b)的监测结果继续或修改细胞凋亡调节治疗。还提供了用于监测细胞凋亡的试剂盒，其包含：a)根据本发明的针对γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体；和b)对照。另一方面，本发明涉及治疗有此需要的受试者中的脓毒症的方法，其包括：a)通过根据本发明的诊断脓毒症的离体方法诊断受试者中的脓毒症；和b)对被诊断患有脓毒症的受试者施用针对脓毒症的治疗性治疗。本发明还涉及侧流免疫测定装置，其包含根据本发明的针对γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体。发明描述“n-ε-(γ-谷氨酰基)-l-赖氨酸”也称为“γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸”、“nε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸”或“ggel”，其表示由转谷氨酰胺酶反应产生的异肽，并且其由于被诱导至细胞凋亡的细胞的吞噬作用而释放。ggel(或游离ggel)是细胞蛋白酶对交联的细胞蛋白的降解的最终产物。如本文所用，“受试者”表示哺乳动物，例如猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类动物。优选地，受试者旨在用于人，特别是儿童、女性或男性。在整个本申请中，术语“包含”应被解释为包含所有具体提到的特征以及可选的、附加的、未指定的特征。如本文所用，术语“包含”的使用还公开了其中不存在除特别提及的特征之外的特征(即“由......组成”)的实施方案。此外，不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”不排除多个/多种。在不同实施方案中描述某些特征的仅有事实不表示不能使用这些特征的组合。γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的检测使用特异于ggel的单克隆抗体检测ggel或测量ggel水平。“抗体”可以是天然或常规抗体，其中二硫键将两条重链彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。轻链包含两个结构域或区域，可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包含四个结构域，可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3，统称为ch)。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或“互补决定区”(cdr)的残基组成。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个cdr，分别称为cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3和cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个cdr，其包含来自重链和轻链v区中的每一个的cdr集合。“框架区”(fr)是指插入cdr之间的氨基酸序列，即指免疫球蛋白轻链和重链可变区的在单一物种中的不同免疫球蛋白中相对保守的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有四个fr，分别命名为fr-l1、fr-l2、fr-l3、fr-l4和fr-h1、fr-h2、fr-h3、fr-h4。在本发明的上下文中，免疫球蛋白轻链或重链中的cdr/fr定义基于imgt定义来确定(lefranc等人dev.comp.immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)。如本文所用，术语“抗体”表示常规抗体及其抗原结合片段，以及嵌合、人源化、双特异性或多特异性抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“mab”是指针对特定抗原的单一一级结构的抗体分子，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。单克隆抗体可以由b细胞或杂交瘤的单个克隆产生，但也可以是重组的，即通过蛋白质工程产生。(常规)抗体的“片段”包含完整抗体的一部分，特别是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fv、fab、f(ab')2、fab'、dsfv、(dsfv)2、scfv、sc(fv)2、双抗体、由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。本发明提供了一种特异于ggel的分离的单克隆抗体，其包含序列gytftsy(seqidno：3)的cdr-h1、序列npsngg(seqidno：4)的cdr-h2、序列sglllwspwfay(seqidno：5)的cdr-h3、序列raseniysyla(seqidno：6)的cdr-l1、序列naktlae(seqidno：7)的cdr-l2和序列qhhygtpft(seqidno：8)的cdr-l3。在实施方案中，所述分离的抗体包含由序列qvqlqqpgtelvkpgasvklsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninpsnggtnynekfkskatltvdkssstaymqlssltsedsavyycarsglllwspwfaywgqgtlvtvs(seqidno：1)或与seqidno：1至少85％相同的序列组成的重链可变结构域(vh)。在另一个实施方案中，所述分离的抗体包含由序列diqmtqspaslsasvgetvtitcraseniysylawyqqkqgkspqllvynaktlaegvpsrfsgsgsgtqfslkinslqpedfgsyycqhhygtpftfgsgtkleikr(seqidno：2)或与seqidno：2至少85％相同的序列组成的轻链可变结构域(vl)。在又一个实施方案中，所述分离的抗体包含由序列seqidno：1或与其至少85％相同的序列组成的vh，和由序列seqidno：2或与其至少85％相同的序列组成的vl。特异于ggel的分离的抗体特别是所谓的1g1h1抗体，其包含由序列seqidno：1组成的vh和由序列seqidno：2组成的vl。与参考序列“至少85％相同”的序列是在其整个长度上与参考序列的整个长度具有85％或更多，特别是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。可以通过比较在比较窗口上最佳比对的两个序列来确定“序列同一性”的百分比，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含与添加或缺失(即，缺口)以用于两个序列的最佳比对。百分比通过以下过程计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。用于比较的序列的最佳比对通过整体成对比对进行，例如，使用needleman和wunschj.mol.biol.48:443(1970)的算法。例如，使用程序needle、blosum62矩阵和以下参数gap-open＝10，gap-extend＝0.5，可以容易地确定序列同一性的百分比。根据本发明的分离的抗体以游离的n-ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽的形式结合ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸。特别地，抗体与表2中公开的一种或多种优选所有ggel样蛋白结合。优选地，抗体对ggel具有特异性，即它不与以下的一种或多种优选所有显著交叉反应：(i)乙酰化赖氨酸(例如存在于乙酰化牛血清白蛋白(bsa)中)，(ii)多胺交联(例如存在于与聚谷氨酸偶联的亚精胺(spd)中，或(iii)泛素化/sumolytation交联(例如存在于boc-gly-bsa中)(参见表3)。当对于两种抗原的ic50在相似范围内时，与抗原1(ag1)结合的单克隆抗体与抗原2(ag2)“交叉反应”。在本申请中，当ag2的亲和力与ag1的亲和力的比率等于或小于10时，结合ag1的单克隆抗体与ag2交叉反应，其中亲和力对于两种抗原用相同的方法测量。当两种抗原的亲和力非常不同时，与ag1结合的单克隆抗体与ag2“不显著交叉反应”。如果结合反应太低，ag2的亲和力可能无法测量。在本申请中，当ag2的亲和力与ag1的亲和力的比率等于或大于10时，与ag1结合的单克隆抗体与ag2不显著交叉反应。理论上，“亲和力”由抗体和抗原之间的平衡缔合来定义。它可以通过各种已知方法进行实验评估，例如用表面等离子体共振测量缔合和解离速率或在免疫化学测定(elisa、facs)中测量ec50/ic50。在这些测定中，ec50/ic50是这样的抗体的浓度，其在对确定浓度的抗原(通过elisa(酶联免疫吸附测定法))或表达该抗原的细胞(通过facs(荧光激活细胞分选))暴露某一特定时间后诱导基线和最大值之间一半的反应。针对ggel的小鼠单克隆抗体ab424可从abcam(cambridge，uk；目录号ab424)获得，其与和ab424对立的异肽n1,n8双(γ-谷氨酰基)亚精胺显著交叉反应。ab424如thomas等人2004,j.immunol.methods292,83-95所述分离。在实施方案中，通过免疫测定、结合测定或色谱法测量ggel的水平。用于ggel测量的免疫测定通常通过使用抗体测量ggel的浓度。抗体可以固定在固体支持物上。特异于ggel的抗体可用于一系列免疫测定，包括使用诸如蛋白质印迹的技术的竞争性和非竞争性测定系统，放射免疫测定例如ria(放射性连接免疫测定)，elisa(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，“间接”免疫测定，“竞争性”免疫测定，免疫沉淀测定，免疫扩散测定，凝集测定，补体固定测定，免疫放射测定，荧光免疫测定，例如fia(荧光连接免疫测定)，化学发光免疫测定，色谱免疫测定，电化学发光免疫测定(eclia)和蛋白a免疫测定。在实施方案中，ggel水平通过elisa以间接、竞争或夹心形式测量。例如，竞争性elisa可以通过在微量滴定板上吸收抗ggel抗体(例如在ph9.50的50mm碳酸氢盐溶液中)、孵育板(例如在实验室温度下过夜)、然后饱和固体支持物(例如，使用补充0.5％bsa和5％蔗糖的0.1m磷酸盐缓冲液)来实施。待分析的样品(任选经稀释的)在标记的ggel存在下(例如与ggel-hrp溶液)加入，在37℃保持1小时。为了用作标准品，具有精确数量的“涂覆的”ggel的bzgo(与bsa偶联的n-α-羰基苄氧基-谷氨酸甲酯(z-gluome))，可以二乘二稀释。洗涤(例如用pbst洗涤三次)后，进行显色(例如使用tmb进行5分钟，并使用2nh2so4终止反应)。吸光度值在450nm测定，使用例如spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)。可以使用grappadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiego，usa)在4参数线上绘制的标准曲线进行ggel定量。考虑加至3.33标准偏差的空白的平均值，确定结果的阳性阈值。或者，可以通过在微量滴定板上吸收bsa-ggel(例如在ph9.50的50mm碳酸氢盐溶液中的10μg/ml的浓度)来实施竞争性elisa。将板在实验室温度下孵育例如过夜，然后例如用补充0.5％bsa和5％蔗糖的0.1m磷酸盐缓冲液进行饱和。待分析的样品(任选经稀释的)在抗ggel抗体溶液的存在下加入，例如，在37℃保持1小时。为了用作标准品，具有精确数量的“涂覆的”ggel的bzgo可以二乘二稀释。洗涤(例如用pbst洗涤三次)后，将第二抗体(例如在pbst中1:2000稀释)例如在37℃孵育30分钟。进行显色(例如使用tmb进行5分钟，并使用2nh2so4终止反应)。吸光度值在450nm测定，使用例如spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)。可以使用grappadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiego，usa)在4参数线上绘制的标准曲线进行ggel定量。考虑加至3.33标准偏差的空白的平均值，确定结果的阳性阈值。在另一个实施方案中，通过侧向流免疫测定(lfia)测量ggel的水平。lfia是一种色谱免疫测定。在另一个实施方案中，ggel水平通过粒子凝胶免疫测定(pagia)或coomb测定测量。在这些测定中，通过尺寸排阻凝胶柱离心获得结合的和未结合的抗ggel配体之间的分离。在间接竞争性coomb测定中，将样品(血清)与抗ggel抗体预孵育几分钟，然后加入用ggel(例如bsa-ggel)致敏的红细胞(rbc)。在第二次孵育后，进行通常在微管中的通过尺寸排阻凝胶柱的离心，以区分结合和未结合的抗体。在样品中不存在ggel的情况下，抗体与致敏的rbc结合并形成高分子复合物。离心后，该复合物将保留在柱顶部。当ggel在样品中存在的量高于较低的可检测浓度水平时，抗体将与样品中存在的ggel结合，而不是结合用ggel致敏的rbc。离心后，未观察到凝集。测定结果的解释取决于抗ggel抗体和用ggel致敏的rbc之间的相互作用形成的高分子复合物的存在与否。强阴性反应(-)对应于完全凝集，在凝胶顶部或刚好在凝胶表面下方看到红线，或者仅在凝胶的上部分布的凝集物。当一些rbc到达微管的底部时，可以区分弱阳性反应(+)，凝胶上部或整个凝胶中仍然可见凝集物。阳性反应(+)对应于作为微管底部的沉淀物的红细胞的完全沉降，并且在凝胶内没有可见的凝集颗粒。细胞凋亡的监测提供了用于监测受试者中的细胞凋亡的离体方法，其包括：a)用根据本发明的针对ggel的单克隆抗体测量受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)将所述测量的游离ggel的水平与对照进行比较；和c)基于与对照的比较监测所述受试者中的细胞凋亡。对照可以是单个值或一系列值，其基于来自受试者或健康受试者群体或来自患有与失调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体的血浆样品中的游离ggel水平来确定。通常，可以基于测量的游离ggel水平将分析的群体分成分位数。对照可以定义为中位数，或第二个三分位数，或第二个或第三个四分位数，或第三个或第四个五分位数等。对照也可以定义为来自受试者或健康受试者群体或来自患有与失调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体的血浆样品中的平均游离ggel水平。还可以通过在较早的时间点(例如在与失调的细胞凋亡相关的疾病发作之前)分析来自相同受试者的血浆样品来确定对照。与对照的比较还可以通过将测量的游离ggel水平与由标准样品中测量的游离ggel水平进行比较来进行，所述标准样品由从患有与失调的细胞凋亡相关的疾病的患者或从健康受试者群体获得的血浆库构成。在所述方法的实施方案中，基于与对照的比较监测所述患者中的细胞凋亡通过以下方式进行：(i)如果对照来源于健康受试者或健康受试者群体，则如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平高于对照中游离ggel的水平，则确定受试者中的细胞凋亡被上调，或者如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平低于对照中游离ggel的水平，则确定受试者中的细胞凋亡被下调；或(ii)如果对照来源于患有与上调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体，则如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平等于或大于对照中游离ggel的水平，则确定受试者中的细胞凋亡被上调；或(iii)如果对照来源于患有与下调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体，则如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平等于或低于对照中游离ggel的水平，则确定受试者中的细胞凋亡被下调。本发明还涉及根据本发明的特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体用于监测细胞凋亡、特别是离体监测体内细胞凋亡的用途。如前所述，通过免疫测定、结合测定或色谱法测量ggel的水平。可以进行细胞凋亡的监测以用于或使得能够用于：a)诊断与失调的细胞凋亡相关的疾病，即与健康受试者相比，上调(增强)或下调(减少)的细胞凋亡；和b)监测细胞凋亡调节剂治疗(即细胞凋亡诱导治疗或细胞凋亡抑制治疗)的有效性。特别地，提供了诊断与上调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)用本发明的针对ggel的单克隆抗体测量受试者血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)将所述测量的游离ggel水平与对照进行比较；和c)基于与对照的比较，诊断所述受试者患有与上调的细胞凋亡相关的疾病。对于诊断，如果对照来源于：(i)健康受试者或健康受试者群体，则如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平高于对照中的游离ggel水平，则诊断所述受试者患有与上调的细胞凋亡相关的疾病；或(ii)患有与上调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体，则如果受试者的血浆样品中游离ggel的水平等于或大于对照中游离ggel的水平，则诊断所述受试者患有与上调的细胞凋亡相关的疾病。“与上调的细胞凋亡相关的疾病”包括但不限于：-神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，肌萎缩侧索硬化症，creutzfeld–jakob病，亨廷顿病，帕金森病，色素性视网膜炎，脊髓性肌萎缩症，小脑变性；-血液系统疾病，如再生障碍性贫血，范可尼贫血，霍奇金病，骨髓增生异常综合征，真性红细胞增多症；-自身免疫性疾病，如暴发性肝炎，移植物抗宿主病，桥本氏甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，多发性硬化症，类风湿性关节炎，硬皮病，干燥综合征；-缺血性损伤，如缺血和再灌注损伤，肾梗塞，心肌梗塞，中风；-毒素引起的疾病，如酒精引起的肝炎，肺纤维化脓毒症；-细菌或病毒感染，例如hiv(aids)、乙型或丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)的感染；-或创伤性脊髓损伤，肿瘤反击(免疫豁免)。在实施方案中，与上调的细胞凋亡相关的疾病是脓毒症。实际上，淋巴细胞的细胞凋亡是脓毒症的记录标志，并导致b细胞、cd4+t细胞和滤泡树突细胞的减少(hotchkissrs等人；jimmunol2001；166；6952-6963)。作为这种免疫抑制的结果，抗体产生、巨噬细胞激活和抗原呈递都降低并伴随着对感染原的耐受性的诱导。还提供了诊断与下调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)用本发明的针对ggel的单克隆抗体测量受试者血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)将所述测量的游离ggel水平与对照进行比较；和c)基于与对照的比较，诊断所述受试者是否患有与下调的细胞凋亡有关的疾病。对于诊断，如果对照来源于：(i)健康受试者或健康受试者群体，则如果受试者的血浆样品中的游离ggel水平低于对照中的游离ggel水平，则诊断所述受试者患有与下调的细胞凋亡相关的疾病；或(ii)患有与下调的细胞凋亡相关的疾病的受试者或受试者群体，则如果受试者的血浆样品中的游离ggel水平等于或低于对照中游离ggel的水平，则诊断所述受试者患有与下调的细胞凋亡相关的疾病。“与下调的细胞凋亡相关的疾病”包括但不限于：-癌症(cancer)，如母细胞瘤，癌(carcinoma)，白血病，淋巴瘤，恶性胶质瘤，肉瘤，精原细胞瘤，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌；-恶化前的疾病，如共济失调性毛细血管扩张症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，骨髓增生异常综合征，色素性干皮病；-自身免疫性疾病，例如自身免疫性淋巴组织增生综合征(i型和ii型)，系统性红斑狼疮，免疫介导的肾小球肾炎；-动脉粥样硬化；-代谢紊乱，如niemann–pick病，骨质疏松症，威尔逊氏病；-病毒感染，如腺病毒、杆状病毒、eb病毒、疱疹病毒、痘病毒的感染；-过早衰老，例如唐氏综合征，早衰和色素性干皮病。此外，本发明的方法提供了ggel异肽水平(其与细胞凋亡的水平直接相关)的准确定量。因此，通过测试ggel异肽的出现(如果治疗是细胞凋亡诱导治疗)或ggel异肽的消失(如果治疗是细胞凋亡抑制治疗)，可以随时间测量特定疗法的效果或疾病进展。在治疗期间，随时间监测血浆中ggel异肽的水平，以确定细胞凋亡水平是否响应于治疗性治疗而增加或减少。因此，提供了一种用于监测受试者中细胞凋亡诱导治疗的有效性的方法，其包括：a)用根据本发明的方法、特别是用根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体的免疫测定，测量经历细胞凋亡诱导治疗的受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)适时重复步骤a)的测量；和c)如果游离ggel的水平随时间增加，则推断细胞凋亡诱导治疗是有效的，或者如果游离ggel的水平不变或随时间降低，则推断细胞凋亡诱导治疗是无效的。细胞凋亡诱导治疗包括例如：-抑制抗凋亡蛋白如bcl-2的药剂，例如奥利默森钠(bcl-2反义核酸)，丁酸钠，epispeptide，芬维a胺，flavipirodo，棉酚，abt-737(cas852808-04-9)，靶向bcl-2的sirna或反义核酸；-基于p53的基因治疗；-基于p53的药物疗法，例如使用phikan083(cas880813-36-5)，cp-31398二盐酸盐(cas1217195-61-3)，nutlin例如nutlin-3(cas548472-68-0)；-抑制iaps(细胞凋亡蛋白抑制剂：蛋白质birc1-8，存活蛋白)的药剂，例如靶向xiap(birc4)的sirna或反义核酸；-基于胱天蛋白酶的药物疗法，例如凋亡素。细胞凋亡诱导剂尤其包括放线菌素，apicidin，盐酸苯达莫司汀，桦木酸，卡铂，顺铂，环磷酰胺，克拉屈滨，盐酸多柔比星，氟达拉滨，藤黄酸，山萘酚，2-甲氧基雌二醇，丝裂霉素c，荜茇酰胺和白花丹素。因此，提供了用于监测受试者中细胞凋亡抑制治疗的有效性的方法，其包括：a)用根据本发明的方法、特别是用根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体的免疫测定，测量经历细胞凋亡抑制治疗的受试者的血浆样品中的游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)适时重复步骤a)的测量；和c)如果游离ggel的水平随时间降低，则推断细胞凋亡抑制治疗是有效的，或者如果游离ggel的水平不变或随时间增加，则推断细胞凋亡抑制治疗是无效的。细胞凋亡抑制治疗包括例如c-myc抑制剂，bax介导的细胞凋亡抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，米酵菌酸，ctp抑制剂，钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)(rho激酶抑制剂)，氯法拉滨(嘌呤核苷抗代谢物)，考布他汀a4，fasentin(使细胞对fas诱导的细胞敏感的葡萄糖摄取抑制剂)。脓毒症的诊断和/或监测方法脓毒症是一种与严重感染(通常是肺炎或胃肠道或泌尿道感染)相关的综合征，其成功治疗仍然是一个非常重要的未满足的临床需求。脓毒症是发达国家死亡的主要原因，占重症监护病房(icu)和住院患者死亡的大多数。在欧洲，其每年影响约750,000名患者(美国统计数据相似)，死亡率约为40％。卫生服务的费用估计在15,000至20,000欧元/患者之间，导致平均每年花费100亿欧元。icu患者发烧、心率加快、呼吸频率升高或白细胞计数异常。这些症状可能预示着脓毒症的发作，这是一种危及生命的针对感染的全身炎症反应，或者它们可能是创伤的结果或其他病况的宿主。血液培养物结果的假阴性率很高-在一项研究中达到40％(vincentj.l.等人critcaremed.2006feb；34(2):344-53)-并且直到72小时才能获得。时间在流逝，延迟治疗的每一小时都会增加死亡的可能性(kumara.等人critcaremed.2006；34(6):1593)。不适当的抗生素使用能够对患者造成不良副作用，并促进耐药细菌的发展。快速准确诊断脓毒症(甚至在其早期阶段)的能力仍然是临床团队面临的最大挑战之一。疑似的脓毒症的早期诊断和治疗对于预防危及生命的并发症至关重要。脓毒症诊断目前很难确定，因为感染的表现非常异质化。由于这一事实，在1992年，国际脓毒症大会，包括accp(americancollegeofchestphysicians)和sccm(societyofcriticalcaremedicine)，将脓毒症定义为“针对感染的全身炎症反应综合征(sirs)”(bonerc.；jama.1992dec23-30；268(24):3452-5；levymm等人；sccm/esicm/accp/ats/sis.；critcaremed.2003apr；31(4):1250)。为了进一步促进患者评估，将病理学区分为几个阶段：-sirs，对应于炎症反应；-脓毒症，定义为由宿主针对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍；-脓毒症休克，定义为脓毒症的一个亚组，其中特别严重的循环、细胞和代谢异常与比单独的脓毒症更高的死亡风险相关。脓毒症诊断的金标准传统上已经是使用微生物培养物来鉴定疾病的来源。但是，使用培养物的主要限制是将培养物发展为可鉴定数量所需的时间长度。还报道培养物在几种条件下是不敏感的，包括生长缓慢且无可培养的微生物和以非常低的浓度存在的微生物。鉴于这些缺点，已经开发了使用基于分子的测试的替代诊断方法，使得能够快速和/或自动诊断脓毒症。这些测试包括elisa试剂盒，流式细胞术，免疫荧光测定，pcr测试，自动微生物系统和fish技术，这些都旨在检测脓毒症的主要负责细菌。预后评分系统能够通过允许将其整体表现与大规模代表性数据库进行比较来促进icu的质量评估。3种常用的评分系统是急性生理学和慢性健康评价(apache)，简化急性生理学评分(saps)和死亡率概率模型(mpm)。最近的一项研究表明，apache-iv和saps-ii评分系统的预测死亡率与严重脓毒症和脓毒症休克患者的观察到的死亡率无关(dabhias,khedekarss,mehalingamv；jclindiagnres.2014oct；8(10):mc09-13)。在开发更快和更灵敏的感染性微生物检测方法的同时，开发了监测特定血清蛋白质生物标记物浓度的异常变化的系统。生物标记物的最佳定义为作为正常生物或致病过程的指标的客观测量和评估的特征。已经研究了数百种生物标记物以试图鉴定能够满足更快、更特异和更准确的脓毒症诊断需求的可靠标记物。对脓毒症机制的研究鉴定了178种潜在的生物标记物(pierrakosc，vincentjl；criticalcare；2010；14：r15)。这些生物标记物分为四类：感染的生物标记物，炎症的生物标记物，止血的生物标记物和细胞凋亡的生物标记物。这些生物标记物能够帮助区分患有sirs的患者和患有脓毒症的患者(例如降钙素原(procalcitonin)、cd64或s-trem-1)。然而，即使这些标记物也不允许对患者进行确切分类，并且必须与降钙素原阳性患者的现有方案(kimhs等人；annclinlabsci.2012winter；42(1)：57-64)或c-反应蛋白一起使用。一项关于炎症标记物的研究表明，最初的促炎反应之后是免疫抑制期，为脓毒症进化过程中免疫反应的几个缺陷提供证据(weschede等人；jleukocbiol.；2005aug；78(2):325-37)。实际上，宿主的炎症反应是促炎(sirs)和抗炎介质(cars)之间的平衡。在sirs的介质中有肿瘤坏死因子(tnf)和促炎细胞因子，而cars的介质中有il1受体的拮抗剂和il10。在脓毒症休克的发展过程中，sirs和cars的介质的受控表达受到干扰，从而导致过度的促炎反应。尽管这些标记物可用于监测脓毒症的发展，但它们的特异性或灵敏度不足以可靠辨别早期脓毒症和晚期脓毒症以及严重脓毒症的发生。本发明旨在提供用于脓毒症检测、特别是用于早期脓毒症检测的方法、工具和试剂盒，使得能够快速并且可靠检测用于分类患者、还用于监测脓毒症向严重脓毒症的发展的生物标记物。本发明人已经显示游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)是脓毒症并且特别是早期脓毒症的有效生物标记物。在疑似脓毒症的情况下，尽快做出诊断非常重要，以便能够给予适当的治疗。这能够帮助终止脓毒症的进展并降低对身体长期损害或死亡的风险，就目前而言，一旦鉴定脓毒症后开始治疗，平均寿命估计最多28天。“脓毒症”是针对局部但严重的感染(其通常是细菌来源但可以是真菌、病毒或寄生虫来源)的全身反应。金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)是最常见的革兰氏阳性分离株，而大肠杆菌(escherichiacoli)、克雷伯氏菌物种(klebsiellaspecies)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)在革兰氏阴性分离株中是主要的。内毒素从血流中的复制或垂死的革兰氏阴性细菌释放，并因此引发脓毒症的炎症级联反应。脓毒症和脓毒症休克如表1所示定义。表1.脓毒症和脓毒症休克的第三国际共识定义的概述表2.序贯(脓毒症相关)器官衰竭评估评分(sofa)如本文所用，“早期脓毒症”表示从脓毒症发病的第0天至第3天并且在优选实施方案中从脓毒症发病的第0天至第1天的脓毒症阶段。根据实施方案，本发明涉及用于诊断受试者中的脓毒症的离体方法，其包括：a)测量受试者血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；b)将所述测量的游离ggel水平与对照进行比较；和c)基于与对照的比较确定所述受试者是否患有脓毒症。所述方法依赖于在脓毒症早期诱导的细胞的凋亡后检测循环中释放的游离ggel。特别地，该方法有利地使得可以诊断早期脓毒症。对照可以是单个值或一系列值，其基于来自受试者或健康受试者群体或来自患有脓毒症的受试者或受试者群体的血浆样品中的游离ggel水平来确定。通常，可以基于测量的游离ggel水平将分析的群体分成分位数。对照可以定义为中位数，或第二个三分位数，或第二个或第三个四分位数，或第三个或第四个五分位数等。对照也可以定义为来自受试者或健康受试者群体或来自患有脓毒症优选早期脓毒症的受试者或受试者群体的血浆样品中的平均游离ggel水平。还可以通过在较早时间点(例如在脓毒症发作之前或在怀疑脓毒症之前)分析来自相同受试者的血浆样品来确定对照。与对照的比较还可以通过将测量的游离ggel水平与由标准样品中测量的游离ggel水平进行比较来进行，所述标准样品由从患有脓毒症的患者或从健康受试者群体获得的血浆库构成。在实施方案中，基于与对照的比较确定所述患者患有脓毒症是通过以下方式进行的：(i)如果对照来源于健康受试者或健康受试者群体，则如果受试者的血浆样品中的游离ggel水平高于对照中的游离ggel水平，则确定受试者患有脓毒症；或(ii)如果对照来源于患有脓毒症的受试者或受试者群体，则如果受试者的血浆样品中的游离ggel水平等于或大于对照中游离ggel水平，则确定受试者患有脓毒症。优选地，当对照来源于患有脓毒症的受试者或受试者群体时，对照来源于患有早期脓毒症的受试者或群体，并且优选来自发病后第一天内的脓毒症。通过根据本发明的方法测量游离ggel异肽水平诊断出患有脓毒症的受试者能够通过如下文所述的用于监测脓毒症向严重脓毒症的发展的离体方法进一步监测可能向严重脓毒症的发展。标记物诊断性能可以通过灵敏度(其表示其检测脓毒症群体的能力)和特异性(其表示其检测对照群体的能力)来表征。诊断测试的评价结果可以总结在比较这两个明确定义的群体的2×2列联表中。通过固定截断值，可以根据测试结果将两个群体分类，分类为阳性或阴性。给定一个特定的标记物，可以在“病例”群体中鉴定许多受试者具有阳性测试结果(“真阳性”：tp)和在“对照”群体中鉴定b个受试者具有阳性测试结果(“真阴性”：tn)。以相同的方式，观察到病例中具有阴性测试结果的c个受试者(“假阳性”：fp)和对照中具有阴性测试结果的d个受试者(“假阴性”：fn)。灵敏度定义为tp/(tp+fn)；本文中称为“真阳性率”。特异性定义为tn/(tn+fp)；本文中称为“真阴性率”。如以下实施例4的表6所报告的，游离ggel定量的特异性评价为从发病后第1天对于脓毒症诊断为91％，从发病后第3天对于脓毒症诊断为100％，从发病开始的第1天到第3天对于脓毒症诊断为95.45％。还使用接收操作特征(roc)分析评估了游离ggel的准确性及其辨别能力(参见图5和表7)。roc曲线是对各种值的测试的灵敏度(se)和特异性(sp)之间的倒数关系的图形可视化。mroc是由kramar等人(computmethodsprogramsbiomed，2001,66：199-207)开发的程序，其致力于鉴定使roc曲线的auc(曲线下面积)最大化的线性组合。例如在staack等人bmcurol2006；6:19中描述了该程序的使用。该程序实现了用于最大化秩相关性估计(其也是roc曲线下面积的估计)的算法(suandliu.journaloftheamericanstatisticalassociation1993；88:1350-1355；wang,computationalstatisticsanddataanalysis2007；51:2803-2812)。roc曲线是基于标记物的测试的灵敏度(或真阳性率)针对假阳性率(即[1-特异性]，特异性是真阴性率)的图形表示。roc空间由灵敏度和(1-特异性)分别定义为x和y轴。最佳可能的预测方法将在左上角或roc空间的坐标(0,1)处产生一个点，表示100％灵敏度(无假阴性)和100％特异性(无假阳性)。完全随机的猜测会从左下角到右上角沿对角线(所谓的无歧视线)给出一个点。对角线划分roc空间。对角线以上的点代表好的分类结果(比随机更好)，线以下的点代表差的结果(比随机更差)。可以计算roc曲线的曲线下面积(auc)。auc越高，诊断标记物的诊断准确度越高。本发明还涉及针对ggel或特异于ggel的配体用于诊断和/或监测脓毒症的用途。在实施方案中，所述配体用于诊断早期脓毒症。在所述用途中，使用配体以测量游离ggel。侧流免疫测定装置本发明还涉及侧流免疫测定装置，其包含根据本发明的特异于ggel的单克隆抗体，其包含序列gytftsy(seqidno：3)的cdr-h1、序列npsngg(seqidno：4)的cdr-h2、序列sglllwspwfay(seqidno：5)的cdr-h3、序列raseniysyla(seqidno：6)的cdr-l1、序列naktlae(seqidno：7)的cdr-l2和序列qhhygtpft(seqidno：8)的cdr-l3。侧流免疫测定装置包含测试条1，其包含检测区2，其中检测区包含测试区3，所述测试区3包含固定在其上的特异于ggel的所述单克隆抗体，和对照区4。测试条支持流体沿侧流动方向的侧流，一个或多个测试区和一个或多个对照区包括暴露用于光学或视觉检查的区域。测试条通常是膜，特别是多孔膜。侧流免疫测定装置通常还包括吸收垫5(位于测试条(或膜)的顶部以增加流动液体的体积)、样品端口7和样品垫6(以确保待测定液体样品和测试条(或膜)之间的接触)和刚性背衬(壳体8)。在实施方案中，侧流免疫测定装置被设计为间接竞争性lfia。已经充分描述了利用金标记抗体的间接竞争性lfia。在该实施方案中，侧流免疫测定装置还包括缀合垫9，其包含金标记的抗ggel特异性抗体和金标记的非特异性免疫球蛋白(特别是igg)。金标记的抗ggel特异性抗体悬浮在液体样品中并流过膜，在那里它首先遇到涂覆在“测试线”10中的ggel抗原(例如作为bsa-ggel)。在待测定样品中没有ggel目标化合物的情况下，金标记的抗ggel特异性抗体与涂覆的ggel抗原结合并聚焦在“测试线”上，以便形成可见条带。随后是第二个“对照线”11，它由第二抗物种抗体(非特异性γ-球蛋白)构成，它捕获任何过量的抗ggel特异性抗体。“对照线”的出现可以被认为是液体通过膜的良好迁移的确认。当存在于待测定样品中的ggel目标化合物的量高于较低的可检测浓度水平时，由于抗ggel特异性抗体与样品中存在的ggel的初始相互作用，金标记的抗ggel特异性抗体与测试线中涂覆的ggel抗原的结合受到抑制，产生不可见的“测试线”。测定结果的解释取决于测试和对照线的存在和强度：两条强线表示测试有效，并且样品为阴性(即样品中的ggel低于该方法的检测限)；强的对照线和褪色的测试线表明测试有效，样品中ggel的量接近检测限；强的对照线表示测试有效且样品为阳性(样品中ggel的量高于检测限)；强或褪色的测试线表明测试无效。治疗方法本发明还涉及在有此需要的受试者中治疗与失调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)对治疗患有与失调的细胞凋亡相关的疾病的受试者施用细胞凋亡调节治疗，b)通过实施根据本发明的监测细胞凋亡的方法，监测所述治疗是否调节受试者的细胞凋亡；和c)基于步骤b)的监测结果继续或修改细胞凋亡调节治疗。在实施方案中，本发明还涉及在有此需要的受试者中治疗与上调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)对治疗患有与上调的细胞凋亡相关的疾病的受试者施用细胞凋亡抑制治疗，b)通过实施根据本发明的监测细胞凋亡的方法，监测所述治疗是否抑制受试者的细胞凋亡；和c)如果步骤b)的监测结果表明治疗抑制受试者的细胞凋亡，则继续细胞凋亡抑制治疗，或者如果步骤b)的监测结果表明治疗不抑制受试者的细胞凋亡，则修改细胞凋亡抑制治疗。在实施方案中，本发明还涉及在有此需要的受试者中治疗与下调的细胞凋亡相关的疾病的方法，其包括：a)对治疗患有与下调的细胞凋亡相关的疾病的受试者施用细胞凋亡诱导治疗，b)通过实施根据本发明的监测细胞凋亡的方法，监测所述治疗是否在受试者中诱导细胞凋亡；和c)如果步骤b)的监测结果表明治疗诱导受试者的细胞凋亡，则继续细胞凋亡诱导治疗，或者如果步骤b)的监测结果表明治疗不诱导受试者的细胞凋亡，则修改细胞凋亡诱导治疗。本发明进一步涉及治疗有此需要的受试者的脓毒症的方法，其包括：a)通过本发明的诊断脓毒症的方法诊断疑似患有脓毒症的受试者的脓毒症，该方法即包括以下的方法：i.测量受试者血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的水平；ii.将所述测量的ggel的水平与对照进行比较；和iii.基于与对照的比较确定所述受试者是否患有脓毒症；和b)对被诊断患有脓毒症的受试者施用针对脓毒症的治疗性治疗。本发明还涉及在有此需要的受试者中治疗脓毒症的方法，其包括基于所述受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的测量，向已知患有脓毒症的受试者施用针对脓毒症的治疗性治疗。本发明还涉及针对脓毒症的治疗性治疗用于治疗受试者的脓毒症的用途，其中基于所述受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的测量知晓受试者患有脓毒症。在实施方案中，基于所述受试者的血浆样品中游离γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)异肽的测量知晓患有脓毒症的受试者先前已通过根据本发明的诊断脓毒症的离体方法进行了诊断。因此，本发明还涉及针对脓毒症的治疗性治疗用于治疗受试者的脓毒症的用途，包括通过本发明的方法诊断脓毒症。针对脓毒症的治疗性治疗包括施用广谱抗生素(即具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌活性的抗生素)，优选一旦诊断出脓毒症，尽可能快地施用。广谱抗生素包括例如链霉素，氨苄西林，四环素，氯霉素类(phenicols)，氟喹诺酮，“第三代”和“第四代”头孢菌素。抗生素的选择通常取决于可能的感染源、当地政策，并且可能涉及在微生物分析后选择合适的抗生素。可以每天检查抗生素治疗以减少毒性和抗药性风险。如果确定脓毒症演变为严重脓毒症，则如果怀疑对治疗有抗性，通过改变抗生素来修改脓毒症治疗，和/或将受试者置于更具有侵入性的监测和治疗之下。试剂盒本发明还涉及用于监测细胞凋亡的试剂盒，其包含：a)根据本发明的特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体；和b)对照。本发明特别涉及用于诊断和/或监测脓毒症的试剂盒，其包含：a)根据本发明的特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体；和b)对照。如果该试剂盒用于诊断脓毒症，则该试剂盒至少包含游离ggel水平的对照。对照可以是单个值或一系列值，其基于来自受试者或健康受试者群体或来自患有脓毒症的受试者或受试者群体的血浆样品中的游离ggel水平来确定。通常，可以基于测量的游离ggel水平将分析的群体分成分位数。对照可以定义为中位数，或第二个三分位数，或第二个或第三个四分位数，或第三个或第四个五分位数等。对照也可以定义为来自受试者或健康受试者群体或来自患有脓毒症优选早期脓毒症的受试者或受试者群体的血浆样品中的平均游离ggel水平。对照也可以是从患有脓毒症、优选早期脓毒症的患者或者从一群患者获得的血浆库。根据实施方案，试剂盒的成分吸附在侧流免疫测定装置上。根据另一个实施方案，试剂盒还包含红细胞(rbc)和ggel。优选地，所述试剂盒包含涂覆在rbc上的ggel和根据本发明的特异于ggel的所述单克隆抗体。这样的试剂盒适合于以coomb测定形式实施ggel免疫测定。将考虑以下附图和实施例进一步说明本发明。附图图1.通过转谷氨酰胺酶反应形成n-ε-(γ-谷氨酰基)-l-赖氨酸异肽键。图2.使用标准曲线定量ggel浓度。具有已知量的ggel的标准化bzgo用作ggel定量的标准品。使用softmaxpro6.5利用4-参数线计算标准曲线。图3.在hl60细胞中通过1μmol/l星形孢菌素(sts)诱导细胞凋亡后的ggel定量。细胞凋亡诱导细胞组的ggel浓度与未诱导细胞凋亡的细胞组的ggel浓度具有显著差异。(p值<0.05)。图4.脓毒症血浆中ggel定量的结果(pbs-t20：具有吐温20的磷酸盐缓冲盐水＝阴性对照，空白血浆＝对照血浆，脓毒症血浆d1＝来自脓毒症患者在第+1天的血浆，脓毒症血浆d3＝来自脓毒症患者在第+3天的血浆)。图5.使用空白血浆以确定测试的阈值(v＝μ×3sd)。获得特异性和灵敏度数据，得到d1组的特异性为91％，d+3组的特异性为100％，合并组(d1+d+3)的特异性为95.45％。获得测试的roc曲线。所有血浆均已经以1/20稀释。图6.示例性侧流免疫测定装置。图7.不同病理学之间的ggel定量。图8.不同病理学中时间点t1和t2之间的ggel血浆浓度。实施例实施例1：特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的单克隆抗体的开发材料与方法mab的开发、免疫原的制备和免疫方案。用通过戊二醛偶联在匙孔血蓝蛋白(klh)上然后针对磷酸盐缓冲盐水1x(pbs)透析的γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)免疫小鼠。将25μg抗原溶液溶解在100μlpbs中。6周龄balb/c和sjl雌性白鼠以1周的间隔给予4次结节内注射免疫原，并在融合前3天给予单次腹膜内注射。杂交瘤的产生和筛选。通过在其他地方galfre和milstein(1981)中描述的方法产生杂交瘤细胞。通过酶联免疫吸附测定(elisa)针对与固定在maxisorp微量滴定板的孔中的偶联至牛血清白蛋白(bsa)的ggel筛选上清液。将含有固定化抗原的孔与杂交瘤上清液一起孵育1小时，然后用在含有0.05％吐温20的pbs(pbst)中以1：2000稀释的山羊抗小鼠(h+l)过氧化物酶缀合物孵育1小时。通过将孔用四甲基联苯胺底物(tmb)孵育5分钟使结合的抗体可视化，并用2n的h2so4终止反应。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)在450nm测定吸光度值。在每次孵育之间，对孔用pbst进行4次漂洗。每孔的工作体积为100μl，并将对照孔用培养基孵育。所有孵育均在37℃进行。从阴性对照平均值确定elisa中检测抗体的阈值。ig亚类的测定和克隆程序。根据制造商的说明书(sigma)，用商业小鼠mab同种型分型试剂盒(iso-1)测定mab的ig类别。为该项目开发的所有抗体都是igm。通过有限稀释克隆杂交瘤细胞系，并将细胞系在非选择性培养基中大量生长，通过在胎牛血清/二甲基亚砜(92:8[体积比])中缓慢冷冻保存，并储存在液氮中。抗体沉淀。选择的杂交瘤在补充有10％胎小牛血清(fcs)的rpmi-1640中培养。在37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中培养2周后，将上清液针对水透析三次以使igm沉淀。在+4℃2000g离心30分钟后，将沉淀重悬于补充有1mnacl的20mmph8.00的磷酸盐缓冲液中。然后针对pbs透析三次。使用自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)，使用280nm处的吸光度计算沉淀抗体的浓度。抗体特异性测定。抗原蛋白的合成。为了对每种选择的杂交瘤进行特异性验证，合成了模拟异肽(ggel)的抗原蛋白：-使用戊二醛作为交联剂将ggel偶联在牛血清白蛋白(bsa)上(ggel-bsa)。为此，将1m0.36mg/mlggel/naoh，151nmbsa和2.5％戊二醛(10mg/ml)的溶液混合并孵育过夜。针对pbs进行三次透析。-使用(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为交联剂将n-α-cbz-l-赖氨酸甲酯(z-gluome)与bsa(bzgo)偶联(lysome-bsa)。n-α-cbz-谷氨酸甲酯与bsa(bzgo)偶联；使用n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和nhs在z-gluome和bsa赖氨酸之间产生ggel异肽结合。将490μmol/ledc/524μmol/lnhs和295mmol/lz-gluome在二甲基甲酰胺(dmf)中稀释，并在室温孵育15分钟。加入在ph8.00的0.1m磷酸盐缓冲液中稀释的2mg/mlbsa并孵育过夜。针对pbs进行三次透析。-与bsa偶联的n-α-cbz-谷氨酸-叔丁基酯(gluoter-bsa)；使用n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和nhs在z-gluoter和bsa赖氨酸之间产生ggel异肽结合。将490μmol/ledc/524μmol/lnhs和295mmol/lz-gluoter在二甲基甲酰胺(dmf)中稀释，并在室温孵育15分钟。加入在ph8.00的0.1m磷酸盐缓冲液中稀释的2mg/mlbsa并孵育过夜。针对pbs进行三次透析。合成了模拟不想要的异肽(α-甘氨酸-l-ε-赖氨酸、泛素异肽)、赖氨酸乙酰化或多胺交联的抗原蛋白质：-使用edc和nhs作为偶联剂将n-α-boc-甘氨酸与bsa偶联(boc-gly-bsa)，-使用edc/nhs将亚精胺与聚-l-谷氨酸偶联(spd-pglu)，-用乙酸酐对bsa进行处理，以对蛋白质的伯胺(赖氨酸)进行乙酰化(bsa-ac)。为了评价在bsa上产生的ggel异肽的量，进行了用2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)测试的伯胺定量。将蛋白质以100μg/ml稀释于补充有0.01％tnbs的0.1mol/l碳酸氢盐溶液中。在37℃孵育2小时后，用1n盐酸(hcl)终止反应。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)在335nm读取光密度。抗体特异性测定。竞争elisa。使用竞争性elisa测试来测试选择的克隆以确定克隆的特异性。因此，bsa-ggel在ph9.50的碳酸氢盐缓冲液中以10μg/ml的浓度吸附在微量滴定板上。将一定浓度的纯化的抗体(2μg/ml的1g1h1或0.5μg/ml的ab424)与表2和3的每种竞争抗原蛋白一起孵育，以二乘二的级联稀释，起始浓度为5μg/ml。在37℃孵育1小时后，洗涤微量滴定板并在37℃加入山羊抗小鼠(h+l)过氧化物酶缀合物保持30分钟。使用tmb显色5分钟并使用2n的h2so4终止反应。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)在450nm测定吸光度值。在每次孵育之间对孔用pbst进行四次漂洗。每孔的工作体积为100μl，并将对照孔用培养基孵育。通过计算初始信号(没有任何竞争者)的50％抑制浓度进行每种抗原蛋白的比较。结果分离了所谓的1g1h1抗ggel单克隆抗体，其包含序列qvqlqqpgtelvkpgasvklsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninpsnggtnynekfkskatltvdkssstaymqlssltsedsavyycarsglllwspwfaywgqgtlvtvs(seqidno:1)的重链可变结构域，和序列diqmtqspaslsasvgetvtitcraseniysylawyqqkqgkspqllvynaktlaegvpsrfsgsgsgtqfslkinslqpedfgsyycqhhygtpftfgsgtkleikr(seqidno:2)的轻链可变结构域。根据imgt定义鉴定的cdr用粗体和下划线字符表示。测定分离的1g1h1抗体的特异性，并与先前表征的商业化ab424抗体(thomas等人，2004，j.immunol.methods292,83-95)进行比较。确定1g1h1和ab424抗体二者均检测d-二聚体，其效价无显著差异(1g1h1为2.5μg/ml，ab424为0.6μg/ml)。使用表2和3中描述的抗原蛋白在针对ggel的竞争性elisa中进一步测定1g1h1和ab424抗体的特异性。结果如表4所示。当在两个ic50之间观察到一个对数的差异时，ic50被认为与另一个ic50显著不同。表4.抗ggel抗体1g1h1和ab424的特异性评价每种抗原蛋白的ic50，并且对于1g1h1，在ggel样蛋白(表2)和阴性对照蛋白(表3)之间观察到一个对数的减少。结论是1g1h1抗体对ggel-bsa、zgluoter-bsa和zlysome-bsa抗原蛋白具有特异性，因此该抗体对ggel异肽相对于其他交联或修饰的赖氨酸是特异性的。相反，ab424抗体与异肽n1,n8双(γ-谷氨酰基)亚精胺交叉反应，但不结合ggel竞争抗原zgluoter-bsa。因此，与商业化ab424抗体相比，该1g1h1抗体对ggel具有增强的特异性。实施例2：用1g1h1单克隆抗体定量γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)材料与方法通过竞争性elisa进行ggel定量。竞争性elisa。bsa-ggel在ph9.50的50mm碳酸氢盐溶液中以10μg/ml的浓度吸附在微量滴定板上。将板在实验室温度孵育过夜。用补充有0.5％bsa和5％蔗糖的0.1m磷酸盐缓冲液进行饱和(图3，步骤1)。将稀释的样品在抗体溶液存在下于37℃加入保持1小时，将具有精确数量的“涂覆”其上的ggel的bzgo二乘二稀释并用作标准品(图3，步骤2和3)。用pbst洗涤三次后，将在pbst中1:2000稀释的二抗在37℃孵育30分钟。使用tmb显色5分钟，并使用2n的h2so4终止反应(图3，步骤4)。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)在450nm测定吸光度值。使用grappadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiego，usa)利用在4参数线上绘制的标准曲线进行ggel定量。考虑加至3.33标准偏差的空白的平均值，确定结果的阳性阈值。结果将1g1h1抗体用于通过竞争性elisa的ggel定量。使用具有已知量的ggel与bsa(bzgo)偶联的标准化n-α-cbz-谷氨酸甲酯(z-gluome)作为标准品用于定量ggel。图2显示了ggel浓度定量的标准曲线，其使用softmaxpro6.5使用4-参数线计算。使用4-参数线的曲线拟合如下：表5.ggel标准曲线参数该抗ggel1g1h1单克隆抗体进一步用于以下实验。实施例3：凋亡细胞释放的游离ggel的体外检测材料与方法细胞系。用于细胞凋亡诱导的细胞系是人早幼粒细胞白血病细胞hl-60。hl-60在补充有10％胎牛血清(fcs)、1％链霉素/青霉素和200mml-谷氨酰胺的rpmi培养基中培养。诱导细胞凋亡。将细胞以1×10e6个细胞/ml接种在前述的细胞培养基中。使用浓度为1μmol/l的星形孢菌素在8小时期间诱导细胞凋亡。星形孢菌素是从streptomycesstaurosporesa的培养液中分离的生物碱。它是一种有效的、可透过细胞的蛋白激酶c抑制剂和其他激酶，如pka，pkg，camkii和肌球蛋白轻链激酶(mlck)。0.2-1μm的星形孢菌素诱导细胞凋亡。处理后，然后将细胞以800g离心10分钟，并将上清液用于ggel定量。ggel定量通过竞争性elisa进行ggel定量。竞争性elisa。将bsa-ggel以10μg/ml的浓度在ph9.50的50mm碳酸氢盐溶液中吸附在微量滴定板上。将板在实验室温度孵育过夜。用补充有0.5％bsa和5％蔗糖的0.1m磷酸盐缓冲液进行饱和(图3，步骤1)。将细胞上清液在抗体溶液存在下于37℃加入保持1小时，将具有精确数量的“涂覆”其上的ggel的bzgo二乘二稀释并用作标准品(图3，步骤2和3)。用pbst洗涤三次后，将在pbst中1:2000稀释的二抗在37℃孵育30分钟。使用tmb显色5分钟，并使用2n的h2so4终止反应(图3，步骤4)。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，usa)在450nm测定吸光度值。使用grappadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiego，usa)利用在4参数线上绘制的标准曲线进行ggel定量。统计分析。值表示为平均值±sd或频率和比例。在适当的情况下，通过非配对t检验、卡方检验、fisher精确检验或anova确定组间差异。p<0.05被认为具有统计学显著性。使用graphpadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiegocaliforniausa)进行分析。结果图3显示了通过星形孢菌素诱导细胞凋亡后或在没有星形孢菌素处理的情况下，hl-60细胞中1g1h1抗体的ggel定量结果。被诱导细胞凋亡的hl-60细胞中的ggel浓度与未诱导细胞凋亡的hl-60细胞显著不同。实施例4：鉴定γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)作为早期脓毒症的生物标记物材料与方法本发明人已经试图确定血浆中的ggel是否能够在酶免疫测定(eia)中测量。该方案基于ggel定量竞争性eia(参见实施例2和3)，其中血浆样品以1/20稀释。来自10名健康个体的对照血浆样品用于确定正常血浆中ggel的背景水平。对于在11名患者的第1天和第3天获得的22个脓毒症样品进行测试。第1天是患者住院并检测到发烧和sirs的症状特征的日子(见表1)。为了辨别阳性和阴性测试，从10个对照血浆样品计算截断值。使用anova1-way评价每组的比较。使用graphpadprismversion5.0(graphpadsoftware，sandiegocaliforniausa)进行roc曲线分析。空白血浆被指定为对照和脓毒症血浆被指定为患者。结果使用该测试，证明了脓毒症血浆可与空白血浆区分开，因为与空白样品相比，观察到d+1和d+3组的ggel浓度的显著增强(图4)。因此，ggel的存在是早期脓毒症的有效生物标记物。但是，第1天血浆可能不会与第3天样品区分开来。然而，通过分析每位患者的结果，已经检测到从第1天到第3天的ggel生物标记物的增加，并且在11名患者中有8名患者观察到此现象。标记物诊断性能可以通过灵敏度(其表示其检测脓毒症群体的能力)和特异性(其表示其检测对照群体的能力)来表征。使用空白血浆以确定测试的阈值(v＝μ×3sd)。获得特异性和灵敏度数据，得到d+1组的特异性为91％，d+3组的特异性为100％，合并组(d+1+d+3)的特异性为95.45％(表6)。进一步获得测试的roc曲线(图5和表7)。表6.用于脓毒症诊断的ggel定量的特异性组真阳性(tp)假阳性(fp)真阴性(tn)假阴性(fn)特异性d11000191％d311000100％d1+d32100195.45％表7.用于脓毒症诊断的ggel的诊断潜力(mroc方法)roc曲线下面积0.9773标准误差0.0273099％置信区间0.9069至1.048p值0.002851实施例5：不同病理学中γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸(ggel)的剂量材料和方法样品血浆获自lariboisière,paris,france的centrederessourcesbiologiques。在两种不同时间点(在入院时收集的t1，以及从出院时收集的t2)获得364个血浆样品，代表4种不同的临床病理学：心脏/呼吸衰竭(hrf)(n＝106)、创伤(n＝90)、脓毒症休克(n＝130)或严重脓毒症(n＝38)。通过竞争性elisa进行ggel定量。竞争性elisa将抗原bsa-ggel用ph9.50的50mm碳酸氢盐溶液吸附在微量滴定板上。将板在室温孵育过夜。用补充有0.5％bsa和5％蔗糖的0.1m磷酸盐缓冲液进行饱和。在抗ggel抗体溶液存在下，在37℃加入稀释的样品保持1小时，将具有精确数量的“涂覆”其上的ggel的bzgo二乘二稀释并用作标准品。用pbst洗涤三次后，使用tmb进行显色10分钟，并使用2n的h2so4终止反应。用spectramax自动酶标仪(moleculardevices，sunnydale，california，usa)在450nm测定吸光度值。使用softmaxpro6.5.1(moleculardevices，sunnydale，usa)在半对数线上绘制的标准曲线进行ggel定量。统计分析通过描述性统计学分析变量以评价病例的临床特征。所有均报告为平均值±s.d，并使用单因素方差分析进行分析，以估计所研究样品之间任何统计学差异的存在。表中列出了双尾概率值，并且在p<0.05时建立了统计显著性水平。所有统计分析均使用graphpadprism5.0版(graphpad软件，sandiego，california，usa)或jmp软件版本12(sasinstituteinc.cary，northcarolina，usa)进行。结果不同病理学之间ggel浓度的比较创伤组血浆ggel浓度水平显著高于其他组(p<0.01)。在脓毒症休克(39.29μmol.l-1)和严重脓毒症样本(28.47μmol.l-1)中观察到比正常样品(22μmol.l-1)更高水平的ggel浓度，但结果不显著(图7)。通过病理学比较不同时间点的ggel浓度在创伤组中ggel的水平在t1到t2从t1-平均值45.61±19.72μmol.l-1显著增加到111.14±24μmol.l-1(图8)。对于其他病理学组，观察到血浆中ggel浓度的非显著增加。通过病理学比较每位患者的δggel浓度对于每个患者血浆，ggel浓度的改变计算如下：δggel＝[ggel]t2–[ggel]t1。分析每种病理学的δggel平均值，其中创伤和脓毒症休克的结果分别为38.75±22.78μmol.l-1和21.58±10.2μmol.l-1，高于hrf和严重脓毒症(表8)。然而，在不同病理学之间注意到非显著结果。表8.通过病理学研究的每名患者的δggel浓度病理学平均值(μmol.l-1)标准偏差(μmol.l-1)hrf3.53256.451脓毒症休克21.582710.021严重脓毒症9.74317.899创伤38.750422.782序列表<110>高级生物设计公司<120>用于监测细胞凋亡的特异于γ-谷氨酰基-l-ε-赖氨酸（ggel）的单克隆抗体<130>bet17p1320<150>ep16305724.3<151>2016-06-14<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>120<212>prt<213>小家鼠（musmusculus）<400>1glnvalglnleuglnglnproglythrgluleuvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530trpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glyasnileasnproserasnglyglythrasntyrasnglulysphe505560lysserlysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserglyleuleuleutrpserprotrpphealatyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalser115120<210>2<211>108<212>prt<213>小家鼠<400>2aspileglnmetthrglnserproalaserleuseralaservalgly151015gluthrvalthrilethrcysargalasergluasniletyrsertyr202530leualatrptyrglnglnlysglnglylysserproglnleuleuval354045tyrasnalalysthrleualagluglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrglnpheserleulysileasnserleuglnpro65707580gluasppheglysertyrtyrcysglnhishistyrglythrprophe859095thrpheglyserglythrlysleugluilelysarg100105<210>3<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-h1<400>3glytyrthrphethrsertyr15<210>4<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-h2<400>4asnproserasnglygly15<210>5<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-h3<400>5serglyleuleuleutrpserprotrpphealatyr1510<210>6<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-l1<400>6argalasergluasniletyrsertyrleuala1510<210>7<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-l2<400>7asnalalysthrleualaglu15<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>cdr-l3<400>8glnhishistyrglythrprophethr15当前第1页12