本发明涉及用于检测至少一种生物因子，特别是细菌的存在和/或测量至少一种生物因子，特别是细菌的浓度的生物传感器，以及用于在使用所述生物传感器的环境中分析至少一种生物因子的污染的方法。
背景技术：
在医院部门，有一些装置能够检测细菌的存在，基于在培养和抗菌谱中搜索患者样品中的细菌，还可以基于pcr和api条带等方法。因此可以提及由merck销售的
然而，这些装置需要样品的孵育和培养时间为24小时至48小时，这延迟了感染的检测，因此推迟了对患者的有效治疗，后果对他们来说可能是严重的。此外，这些装置在使用前必须储存在2℃和8℃之间，并且通常只能检测单一种类的细菌。
在农业食品领域，有一些装置用于检测食品包装中细菌的存在，实现动态条形码，即能够在细菌代谢物的存在下改变。
然而，这些装置仅能够间接检测细菌的存在，而不能立即检测。
此外，文献us2002/0072079和us2004/018641公开了能够识别污染的污染检测器，其包括：用于识别产品的第一编码索引，用于识别指示污染的条件的第二编码索引，与第一和第二条形码相关的污染指示器和用于在存在污染条件时改变指示器外观的装置，其中用于改变指示器外观的装置改变第一和第二编码索引的外观。
然而，这些文献没有报告通过与适体连接的着色分子的存在引起的颜色产生或比色变化。
另外，现有技术的装置不能提供关于样品中生物因子浓度的即时信息；特别是它们不能确定是否已经超过感染剂量，即是否已经超过引起疾病的足够量的病原体。
因此需要一种能够克服现有技术的细菌检测装置的缺陷的装置。
因此，本发明旨在提供一种用于检测至少一种生物因子的存在和/或测量至少一种生物因子的浓度的装置，其不具有现有装置的局限。
特别地，本发明旨在提供一种装置，该装置能够比现有技术的装置更快或甚至立即检测至少一种生物因子，优选几种不同生物因子的存在。
本发明还旨在提供一种装置，该装置能够比现有技术的装置更快或甚至立即提供关于样品中至少一种生物因子，优选几种不同生物因子的浓度的信息。
附图
图1说明了根据本发明的生物传感器的生产。生物传感器-动态2d条形码能够检测出5种病原体。
图2说明了来自体液的生物传感器的使用。通过专用移动应用程序接收的信息可以允许：1.鉴定样品中存在的病原体，2.估算相应量，3.每种病原体的特定抗菌谱，4.确定感染剂量和5.定位。
图3示出了通过根据本发明的生物传感器揭示目标细菌之前和之后改变色调的2d条形码的视觉演变(实施例4.1)。
图4示出了通过根据本发明的生物传感器揭示目标细菌之前和之后改变色调的1d条形码的视觉演变(实施例4.2)。
生物传感器
根据第一个主题，本发明涉及一种用于检测至少一种生物因子的存在和/或测量至少一种生物因子的浓度的生物传感器，其包括支撑物，所述支撑物上放置条形码，所述条形码的至少一个区域被能够选择性地固定所述生物因子的至少一种适体官能化，所述适体本身直接或间接与着色分子连接，所述着色分子能够在通过所述适体固定所述生物因子后产生颜色或改变颜色，任选地通过闪光灯激活，如下面的描述中详细描述的。
根据具体实施方案，所述着色分子通过不稳定键直接或间接连接。
工作原理
根据本发明的装置的操作原理是基于比色现象，这使得能够以简单、直接和立即的方式用信号指示目标生物因子的检测。
本发明的装置特异于至少一种生物因子，也就是说它仅检测它要检测的(多种)生物因子，即(多种)目标生物因子。
根据具体实施方案，根据本发明的装置的表面包括条形码，在所述条形码的至少一个区域与目标生物因子接触之后并且在所述生物因子被适体固定之后，所述区域能够产生颜色或改变颜色。
如下面详细描述的，颜色产生或颜色变化可能与由生物因子-适体键合引起的生物因子释放特定酶有关。
根据第一变体，特定酶的这种攻击可能导致着色分子和适体之间存在的不稳定键断裂。
根据第二变体，特定酶的这种攻击可以引起着色分子的颜色产生或颜色变化。
根据第三变体，特定酶的这种攻击可能同时是这两种现象的来源，即着色分子和适体之间存在的不稳定键的断裂和着色分子的颜色产生或颜色变化。
因此，如实施例中所示，发明人已经证明，在两种细菌固定(参见实施例3中的实施方式)在适体上之后，由于β-内酰胺酶的释放，包含β-内酰胺单元的着色分子-适体键被分解，引起着色分子的释放并因此允许颜色产生并形成指示相应细菌的存在的2d条形码。
因此，根据该特定变体，根据本发明的装置的表面包括条形码，当所述条形码的至少一个区域与目标生物因子接触时并且当所述生物因子被适体固定时，所述区域能够释放着色分子。
基于相同的原理，另一种变体能够用能够被不同酶攻击的另一种分子替代抗生素分子。例如，可以提及乳糖/β-半乳糖苷酶对，其中β-半乳糖苷酶可以特别是被大肠杆菌分泌的。还可以提及使用α-淀粉酶，一种真菌酶，特别是由疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)产生的，能够攻击多糖，特别是为了使它们可发酵。
本发明人还在实施例中说明了一种变体，根据该变体，在细菌固定在适体上之后，着色分子不会被释放，但能够产生所述着色分子的颜色或颜色变化(实施例4和5)。
着色分子-适体键
根据上述本发明的第一变体，着色分子可以例如在生物因子被适体固定后释放。在这种情况下，着色分子与适体例如通过第二间隔物连接，如下面将详细描述的，并且着色分子可以通过不稳定键的方式与该第二间隔物连接。
根据上述本发明的第二变体，在生物因子被适体固定后，着色分子可以不被释放，但是在生物因子被适体固定后可以改变颜色。
有利地，再次根据该第二变体，着色分子和适体之间的键可以不包含不稳定键或间隔物。根据特别有利的实施方案，着色分子属于抗生素家族。
本发明的检测原理基于由诱导型链式反应产生的颜色变化。实际上，在用于检测医院内疾病的健康应用的情况下，并且如果待检测的生物样品包含一种或多种目标细菌，则适体识别生物因子并将其固定。
然后使细菌与键合于适体3’末端的抗生素分子接触。在这种接触之后，如果细菌对所用的抗生素(例如头孢菌素、青霉素家族)具有抗性，则所述细菌产生能够攻击抗生素的酶，例如β-内酰胺酶。
作为可能属于这些抗生素且可能被β-内酰胺酶攻击的单元，可以提及β-内酰胺环。
所有β-内酰胺抗生素，即含有β-内酰胺环的那些，都适用于实施本发明。在这方面，尤其可以提及青霉素衍生物(青霉烷类)、头孢菌素衍生物(头孢烯类)、氧青霉烷类、单内酰环类(monobactams)和碳青霉烯类。
取决于抗生素的性质/家族并且取决于检测模式，发生比色反应。
根据本发明的一个具体实施方案，比色反应可以特别引起发光，例如荧光。
因此，根据第一特定实施方案，本发明涉及一种用于检测至少一种生物因子的存在和/或测量至少一种生物因子的浓度的生物传感器，其包括支撑物，所述支撑物上放置条形码，所述条形码的至少一个区域被能够选择性地固定所述生物因子的至少一种适体官能化，所述适体本身通过不稳定的化学键直接或间接与着色分子连接，所述不稳定的化学键能够在通过所述适体固定生物因子后断裂，并且所述着色分子处于与适体连接的形式时是不发光的并且处于不与适体连接的形式时是发光的，优选发荧光。
根据另一个具体实施方案，还涉及如上定义的生物传感器，其中着色分子通过第二间隔物与适体共价键合，所述第二间隔物通过不稳定的化学键与着色分子连接，所述不稳定的化学键能够在通过适体固定生物因子之后断裂，例如在β-内酰胺酶的存在下能够断裂的不稳定化学键。
根据另一个具体实施方案，还涉及如上定义的生物传感器，其中着色分子是与适体共价键合的抗生素，所述着色分子能够在通过适体固定生物因子之后产生颜色或改变颜色，例如包含显色抗生素的所述化学分子。
适体/生物因子
在本发明的上下文中，术语“适体”意指合成的寡核苷酸，其能够选择性地结合目标生物因子中包含的配体(通常存在于目标生物因子的表面上)或由所述因子，即希望使用本发明的生物传感器检测的生物因子，分泌或排泄的配体。
适体通常是合成化合物，通过称为selex的迭代选择方法在体外从大量随机测序的化合物的组合文库中分离。
本发明的装置的一个优点是，只要存在特异于所述生物因子的适体，就能够检测任意生物因子。
实际上，改变适体以靶向特定生物因子就足够了。换句话说，该装置基于生物因子/适体对的特异性。
生物因子通常选自由细菌、朊病毒、病毒、真菌毒素和肽组成的组。
根据优选的实施方案，生物因子是细菌，并且适体能够选择性地结合所述细菌的至少一种膜蛋白，例如选自脂多糖(lps)和肽聚糖(ppg)。
本发明的装置特别适用于检测医院环境中的医院内感染，或者用于检测农业食品领域中的细菌污染，检测饮用水分配网络、河流、湖泊或甚至游泳池中的水中的病原体。
优选地，生物因子(biologicalagent)是选自由以下组成的组的细菌：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、肉毒杆菌、肺炎链球菌、苍白密螺旋体、胃肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和军团菌。
当生物因子是细菌时，并且如上所述，本发明可以有利地利用装置中抗生素分子的存在，导致细菌分泌酶，所述酶的分泌能够直接或间接地通过着色分子产生颜色或颜色变化。
根据上述第一变体，抗生素分子被包含在适体和着色分子之间的间隔物中或在本发明的上下文中的“第二间隔物”中。
仍然根据该第一变体，不稳定的化学键被包含在间隔物和着色分子之间。换句话说，适体和着色分子之间的化学键所分泌的酶的攻击导致着色分子的释放，从而产生颜色或者引起颜色变化。
根据上述第二变体，着色分子包含在酶的攻击后能够改变颜色的抗生素分子或显色抗生素或由其组成，所述酶源自本发明的生物传感器所捕获的目标细菌。
本发明的装置中使用的适体可以是任意种类，只要它们能够选择性地固定希望检测的生物因子，只要它们可以例如通过第一间隔物与装置的支撑物连接，并且只要它们可以例如通过第二间隔物与着色分子连接。
如上所述，不稳定键可以在着色分子和适体之间，特别是在第二间隔物(其本身包含抗生素分子)和着色分子之间。或者，在着色分子属于抗生素家族并且能够产生颜色或引起颜色变化或是显色抗生素的情况下，着色分子和适体之间可以不存在这种不稳定的键。在后一种情况下，着色分子可以直接与适体连接，而不需要存在第二间隔物。
从文献和数据库中描述的适体开始，使用表面官能化和共价偶联的常规技术，本领域技术人员将能够对它们进行改性，以使其能够连接到装置的支撑物上，并使其能够与着色分子特别是通过第二间隔物键合。
优选地，适体是rna或dna链。它也可以是肽。
根据一个具体实施方案，适体在其3’末端被修饰，特别是具有-cooh官能。
根据另一个具体实施方案，适体在其5’末端被修饰，特别是具有-nh2官能。
这种修饰使得可以容易地将适体固定到装置的支撑物上，也就是说用接枝到支撑物上的常规技术。
因此，适体可以通过第一间隔物与条形码区域共价键合。
根据一个具体实施方案，所述第一间隔物可具有式-s-(ch2)n-c(o)-，其中n为2至6的整数，并且其中硫原子与支撑物共价键合并且c(o)基团的碳原子与适体的氮原子共价键合。
根据其他特定实施方案，适体-支撑物键可以通过硅烷(oh-硅烷-nh2)例如tpm、通过异双功能接头(sh-异双功能-nh2)例如smcc或通过uv制备。在这方面，在m.zain等人，“effectofsurfacetreatmentsonthedurabilityofgreenpolyurethaneadhesivebondedaluminiumalloy”internationaljournalofadhesion&adhesives55(2014)43–55中描述了在具有oh键的支撑物上生产硅烷膜，该文献可以在本发明的上下文中使用。还提到了y.guo等人的文章“potentantigen-specificimmuneresponseinducedbyinfusionofspleencellscoupledwithsuccinimidyl-4-(n-maleimidomethylcyclohexane)-1-carboxylate(smcc)conjugatedantigens”’internationalimmunopharmacology31(2016)158–168，其公开了一个实施例，该实施例说明了细胞通过sh键合和蛋白通过nh2键合。
属于硅烷族的分子的使用基于这些分子通过吸附在表面上的自发自组装，从而将它们自身组织成有序的分子单层。分子的这种组装产生强大且稳定的分子组织。在本发明的上下文中，所选择的(多个)分子必须含有与基体的羟基末端具有高亲和力的头部基团，从而能够将分子锚定在其表面上，以及与适体的5’nh2末端相互作用的末端基团。
存在不同的分子族，其性质对应于上述那些，例如有机硅烷、硫醇和膦酸酯。作为有机硅烷的实例，可以提及3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(tpm)(pubchemid：17318)。
然后，tpm的头部基团“ro-si”与基体的羟基末端(oh)反应。该反应被称为异源缩合反应，导致形成o-si-r’型共价键，其中r’代表又与适体的5’nh2末端相互作用的末端基团。
试剂的另一种类型是异双功能接头类型。这些是最值得注意且最有用的蛋白质缀合试剂，因为它们具有两个不同的反应基团。它们具有在末端具有不同反应基团的特定特征。
例如，n-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯(spdp)或琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)(pubchemid：125175)。smcc通过其马来酰亚胺基团(它是反应性巯基(硫醇；-sh)基团)及其nhs末端(它是胺反应性的(nh2))反应，从而形成稳定的共价键。
根据本领域技术人员熟知的技术，可以使用属于该“接头(linker)”家族的其他分子，条件是它们在末端具有相同的基团。
这种类型的接枝可以使用本领域技术人员已知的技术进行，如下面详述的实施例中所述。
因此，本发明的装置可以特别地根据本领域技术人员熟知的数据库实施适体/生物因子对。作为非限制性说明，可以提及以下特定对，总结在下表中：
着色分子
在本发明的装置中，着色分子用信号指示目标生物因子的检测，例如通过释放所述着色分子，如上文结合本发明的一个具体实施方案所述。
在本发明的上下文中，术语“着色分子”旨在表示在其环境中的刺激后能够产生颜色或引起颜色变化的任意分子。在本发明的上下文中，所述刺激有利地由适体固定生物因子来表示。然而，如上所述，颜色产生或颜色变化可以通过这种固定间接引起。换句话说，本发明还包括如下情况：其中由该固定发生链反应，其中的至少一个通过着色分子引起这种颜色产生或颜色变化。着色分子的性质在下面详细描述。
在本发明的上下文中，术语“颜色产生”旨在表示相对于在使生物因子与根据本发明的生物传感器接触之前存在于相同区域中的颜色的颜色出现，相对于给定的比色系统而确定。
在本发明的上下文中，术语“颜色变化”旨在表示相对于在使生物因子与根据本发明的生物传感器接触之前存在于相同区域中的颜色的颜色变化，相对于给定的比色系统而确定。这种颜色变化还包括对比度变化。因此，应该选择着色分子，使得在生物因子固定在适体上之后，所述变化引起最小的比色位移或比色移位，以便通过合适的读取装置对其进行检测。
术语“颜色变化”包括发光的产生，如下所述。
作为可以在本发明的上下文中使用的比色系统，尤其可以提及rgb模型。rgb模型基于三种基色，通过混合它们形成所有其他颜色(每个通道上256个级别)。还可以提及hsl模型(色调、饱和度、亮度)，或者hsv模型(色调、饱和度、值)，其是rgb的衍生。后两者能够更好地理解或控制亮度。
根据本领域技术人员公知的技术，可以使用设计用于检测这些颜色产生和/或颜色变化的任意类型的装置。
还应注意，在本发明的上下文中，比色系统不仅意指三色空间，因为本发明还涉及通过单色或双色色调变化(包括从白色到黑色的色度)的检测。该实施方案可以特别地对应于其中条形码是1d或2d条形码的应用。
以下描述说明了根据其中着色分子是发光的，更特别是发荧光的实施方案，在本发明的上下文中使用的“闪光灯活化”。该步骤在读取结果时发生。
根据该实施方案，第二间隔物与适体的3’键合并且还与发光染料更特别是可光活化的发光染料键合。该染料在根据特定波长激发后能够读取检测结果。实际上，在用于检测医院内疾病的健康应用的情况下，并且如果待检测的生物样品包含一种或多种目标细菌，则适体识别生物因子并将其固定。使细菌与键合于适体的3’末端的抗生素分子接触。
在这种接触之后，如果细菌对所用的抗生素，例如头孢菌素或青霉素家族具有抗性，则所述细菌产生酶，例如β-内酰胺酶，其攻击抗生素，例如β-内酰胺环。这引起抗生素末端和染料末端之间的不稳定键裂解，从而引起染料的释放。该染料通过手机闪光灯在特定波长下被激发，从而使初始无色的染料出现发光。在该实施方案中，优选使用非显色抗生素。
根据一个具体实施方案，着色分子是化学分子而不是抗体。
作为非发光着色分子，尤其可以提及头孢菌素家族的显色抗生素，例如头孢硝噻吩和青霉素。
根据本发明的一个具体实施方案，着色分子处于与适体连接的形式时是不发光的并且处于不与适体连接的形式时是发光的，优选发荧光。
作为发光着色分子，特别是荧光着色分子，尤其可以提及5-fam、6-fam、atto-型染料，尤其是atto532或atto550、atto647、dy-510xl、dy-530、hex、calfluororange560，特别是atto，如实施例中所实施的。
仍然根据着色分子是发光的甚至更特别发荧光的该具体实施方案，当着色分子仍然与适体连接时它不发光，这意味着如果不存在目标生物因子，则用适体官能化的装置的区域不产生任何比色现象。
另一方面，当它在生物因子固定后被激活，或者更特别地在生物因子固定后被释放时，它变得发光并产生可以通过合适的读取装置可视化的比色现象。
该操作确保直接和即时检测目标生物因子。
优选地，这种发光着色分子具有600nm至700nm，优选640nm至670nm的光吸收带，以及600nm至700nm，优选665nm至675nm的光发射带或者用于检测的最小比色偏移。
作为读取装置，尤其可以提及胶片相机或相机或者ccd或cmos类型的光敏传感器。最后一种类型的传感器组合了三基色rgb来通过加法合成创建彩色图像。
如上所述的着色分子可以通过如前所述的不同类型的间隔物与适体连接，或者当着色分子包含抗生素时直接与适体连接。
因此，着色分子可以通过第二间隔物与适体连接。
此外，如前所述，该第二间隔物可以包含至少一个不稳定键，以便能够释放着色分子，着色分子游离后因此可以引起颜色产生或颜色变化。
着色分子的释放可以通过各种机制触发。
根据一个实施方案，其中生物因子是产生β-内酰胺酶类型的酶的细菌，并且着色分子包含对该酶的产生敏感的环，如上所述，不稳定键位于着色分子和抗生素之间。
根据本发明的一个具体实施方案，当生物因子是细菌时，第二间隔物通过不稳定键与着色分子键合。它有利地至少部分地由抗生素分子形成，所述抗生素分子导致形成能够精确攻击所述抗生素分子，特别是β-内酰胺环的酶。实施例中说明了通过实施包含头孢菌素的第二间隔物的该具体实施方案。因此，形成了适体-[头孢菌素]-[atto]复合物，其可以接枝到支撑物上以得到所需的生物传感器，能够检测特定的细菌。
作为这种适体-[头孢菌素]-[atto]复合物的说明，下面的图1示出了适体-头孢菌素-atto647序列。
图1
出于本发明的目的，不稳定键有利地包括在着色分子和第二间隔物之间。在本发明的上下文中将其定义为能够在间隔物臂受到生物因子尤其是细菌分泌的酶的攻击后断裂的键，更具体地，包括在抗生素分子中的β-内酰胺环包括在第二间隔物臂中。
如上所述，在该具体实施方案的上下文中，在将所述细菌固定在适体上的过程中，使生物因子，例如目标细菌与第二间隔物接触，提供与着色分子的连接，所述着色分子例如与适体的3’或5’连接。
在这种接触之后，如果细菌对所用的抗生素分子具有抗性，则所述细菌产生能够攻击适体和着色分子之间的至少一个键的酶。当如实施例中那样，这是通过对抗生素作用反应产生β-内酰胺酶的细菌时，所述细菌攻击第二间隔物中所包含的头孢菌素中存在的β-内酰胺单元。
取决于抗生素的性质，可检测的变化可以通过颜色产生或颜色变化来表现。这种表现可能是由于不稳定键的断裂。以这种方式释放的着色分子使得能够读取结果。
无论染料或抗生素的性质如何，链式反应都会导致颜色变化，这可以例如在动态条形码上进行转换。
因此，在检测引起医院内感染的细菌的情况下，本发明优选的释放方式是基于细菌的抗生素抗性，特别是基于对β-内酰胺类抗生素的抗性。
对β-内酰胺类抗生素具有抗性的细菌在存在所述抗生素时具有释放β-内酰胺酶的能力，这改变了这些抗生素的结构并使它们无效。
优选地，第二间隔物是包含β-内酰胺单元例如头孢菌素单元的二价基团。
根据本发明的一个具体实施方案，在链式反应后，生物因子尤其是细菌固定在适体上导致将适体与着色分子连接的不稳定键断裂。该着色分子处于与适体连接的形式时是不发光，但当其被释放时，变得发光，优选发荧光，正是该着色分子的释放引起比色现象，其仅出现在与被适体官能化的区域相对应的区域中。
因此，这种发光的出现修改由条形码编码的信息并使用合适的读取装置读取如此修改的条形码，然后能够读取相对于由初始条形码编码的信息被修改的信息，反映生物因子的检测。
检测/应用
可以设想任意类型的检测。
作为应用类型，可以提及细菌的鉴定、感染灶的定位、对应于每种细菌类型的抗菌谱或者存在量的估算(高于或低于感染剂量)。
根据一个实施方案，还能够使用合适的读取装置，通过与预定参考值比较，来测量由着色分子产生的颜色产生或颜色变化例如发光的强度，能够确定监测样品中生物因子的浓度是否大于对应于特定感染剂量的量。
本发明的另一个优点是可以在将生物因子固定在生物传感器上之前或之后两者之间保持相同的读取方法。
因此，本发明的装置或生物传感器能够实时检测至少一种生物因子的存在和/或测量至少一种生物因子的浓度，也就是说，无需事先孵育待监测的样品并且无需事先处理，如在细菌的情况下的裂解。
利用快速检测装置，可以在孵育和/或增殖之前鉴定生物因子例如细菌，并且可以用合适的处理进行处理。
此外，本发明的装置或生物传感器具有不需要在温度方面特定储存的优点。换句话说，本发明的装置在-20℃至80℃之间，优选在0℃至40℃之间的温度下是热稳定的。
支撑物
本发明的装置具有能够在各种支撑物上实施的优点，无论是刚性的还是柔性的。
支撑物可以是放置条形码的柔性或刚性支撑物。
根据一个实施方案，支撑物是柔性支撑物，优选涂有氧化铝的纸或塑料类型的支撑物、纸的支撑物或塑料的支撑物。
作为塑料材料，尤其可以提及由ppgindustries以teslin的名称销售的聚丙烯或微孔聚乙烯。
由teslin制成的这种支撑物的厚度可以特别地在150μm和450μm之间。
聚丙烯可以是硬的或半刚性的。
根据另一实施方案，支撑物是刚性支撑物，例如由玻璃制成。
优选地，支撑物涂覆有氧化铝层，条形码放置在该氧化铝层上。
可以通过本领域技术人员已知的任意技术放置氧化铝层，例如下面实施例中所述的技术。
氧化铝层的厚度通常在500nm至10μm之间变化，并且例如为1μm。
氧化铝层的使用有几个优点：
-首先，由于根据应用类型而调整孔径，交换表面增加，
-但是化学官能化对配体(适体)附着的附着力也更好。这是由于在该表面存在游离氢氧键(-oh)，这将有助于适体的固定。因此，对于生物传感器，可用氢氧化物键的含量可达到约80％。
氧化铝层的使用还具有以下优点：
-氧化铝层具有热稳定性，使得在制造后不需要任何特定的储存，
-它具有生物相容性，也就是说它不会降解使用它的生物材料，最后，
-氧化铝层的制造成本相对较低。
条形码
本发明的装置具有能够用各种条形码实施的优点，无论是1维还是2维。
另外，条形码的一个或多个区域可以用单个适体或几个不同的适体官能化，以便能够检测一种或多种不同的生物因子。
图3和4说明了在着色分子为显色抗生素类型头孢硝噻吩的情况下，如实施例4中所述的1d和2d条形码的用途，头孢硝噻吩从不存在β-内酰胺酶时的黄色变为存在β-内酰胺酶时的红色。如该实例中所示，条纹或像素之间的对比度的存在使得可以携带条形码所承载的信息并得出关于目标细菌的存在或不存在的结论。
根据一个实施方案，条形码是由一组平行的黑色条带和白色条带组成的一维条形码，其中至少一个白色条带或黑色条带的至少一个区域被至少一种适体官能化。
优选地，所有至少一个白色条带都被至少一种适体官能化。
根据该实施方案的变体，可以用不同的适体官能化两个、三个、四个或甚至五个或更多个白色条带，以便检测两种、三种、四种或甚至五种或更多种不同的生物因子。
根据另一实施方案，条形码是由一组黑色像素和白色像素组成的二维条形码，其中至少一个白色像素或至少一个黑色像素被至少一种适体官能化。
这种类型的条形码具有包含更多信息的优点，例如细菌的鉴定、感染灶的位置、对应于每种细菌类型的抗菌谱和存在量的估算(高于或低于感染剂量)。
根据该实施方案的变体，可以用不同的适体官能化两个、三个、四个或甚至五个或更多个白色像素，以便检测两种、三种、四种或甚至五种或更多种不同的生物因子。
制造生物传感器的方法
本发明的装置可以通过降低生产成本的技术制造。
本发明的装置可以容易地小型化，并且可以制造成一次性使用，因此在使用后会被破坏。
适用于制造根据本发明的生物传感器的支撑物官能化方法描述于下文详述的实施例中。
该方法包括以下步骤：制备支撑物，例如包括涂覆一层氧化铝，然后任选活化氧化铝层以能够接枝适体，然后将适体-着色分子复合物接枝到支撑物(例如活化的氧化铝)上，或将适体接枝到支撑物(例如活化的氧化铝)上，然后将着色分子接枝到如此接枝的适体上。
这些表面改性步骤(涂覆、活化、官能化、接枝，偶联等)使用本领域技术人员已知的技术。
可以实施该过程以官能化条形码的预定区域，如下面详述的实施例中所示，以制备根据本发明的生物传感器。
分析污染的过程
根据另一个主题，本发明涉及一种用于分析环境中至少一种生物因子的污染的方法，其至少包括以下步骤：
-提供根据本发明的生物传感器，
-在有助于生物传感器的适体固定待分析的环境中可能存在的(多种)生物因子的条件下，将生物传感器置于所述环境中，
-例如在有助于处于不与适体连接的形式的着色分子发光的照射条件下，读取如此涂覆的生物传感器，从而获得由如此涂覆的生物传感器的条形码所编码的信息，和
-从所获取的信息中产生关于环境中可能存在至少一种生物因子的信息。
“待分析的环境”旨在表示期望检测目标生物因子的存在的培养基。
在检测患者中的细菌污染的情况下，本发明的装置通常由体液例如主要是汗液、尿液、唾液或血液实施。因此，本发明的装置不一定是侵入性的，因为它可以在血液以外的样品上实施。
因此，待分析的环境可以是患者的体液样品，例如血液、汗液、尿液或唾液。
在检测农业食品中的细菌污染的情况下，这可以是包含在食品包装中的气态气氛，或者是从食品的表面或从食品内部取出的样品，例如葡萄酒或啤酒。
当将生物传感器放入待分析的环境中时，确保条件有助于生物传感器的适体固定所述环境中可能存在的(多种)生物因子。
生物传感器可以在室温下使用。通常在不到15到20分钟内获得响应。
当将生物传感器放入待分析的环境中时，如果所述环境含有被所述生物传感器靶向的生物因子，则所述因子被固定在特异于这些生物因子的适体上，这导致在对应于被适体官能化的区域的区域中颜色产生或颜色变化，例如由于导致着色分子释放的链式反应。
因此，下一步骤在于在比色反应的情况下直接通过读取反应后的条形码，或者通过在适合于发光分子的波长下激发着色分子来获取由条形码编码的信息。
因此，在发光着色分子的特定情况下，下面的步骤因此在于在有助于处于不与适体连接的形式的着色分子发光的照射条件下读取如此涂覆的生物传感器，从而获得如此涂覆的生物传感器的条形码所编码的信息。
本领域技术人员将能够调整照射条件以激活着色分子的发光。
根据优选的实施方案，着色分子的发光仅在比日光或人造室内照明更强的照射下可检测到。
根据该模式，着色分子的发光通常借助于闪光灯通常是照相机闪光灯或手机闪光灯被激活。本领域技术人员将能够将着色分子调整为闪光波长的函数以利用其发光。
除了发光条件之外，还需要收集条形码的图像，通常借助于胶片相机或相机，通常来自手机(智能手机)的相机。
因此，本发明的装置易于实施，也就是说它不需要任何特定的分析技术：使用闪光灯和胶片相机或照相机的简单控制足以分析生物传感器的响应。
使用发光并且优选荧光读取本发明的生物传感器的模式具有以下优点：由于只有提供了合适的光源和读取装置(通常是配备有闪光灯和专用应用程序的智能手机)的用户才能够解密生物传感器的条形码中编码的信息，因此是谨慎且保密的。
在医学领域中，例如在检测患者中的细菌污染的情况下，该读取模式允许医务人员在感染的情况下不会使患者惊恐。
如上所述，条形码图像的分析使得能够访问多种信息项，例如是否存在目标生物因子以及是否已达到感染剂量，作为所测量的发光强度的函数，以及条形码中集成的任意其他信息，例如检测到的感染的位置、病原体的鉴定、估算病原体的数量以确定是否已超过感染剂量或将抗菌谱编程为识别的细菌类型的函数。
因此，根据本发明的实施方案，可以设想读取条形码的若干模式：
-读取步骤，其中修改的条形码本身编码有关目标生物因子的存在的信息，
-读取步骤，然后与初始条形码进行比较，以确定显示被修改的条形码区域，从而能够得出有关目标生物因子是否存在的结论，或者
-读取步骤，然后测量显示被修改的条形码区域的对比度，并与校准值进行比较，从而能够得出关于目标生物因子的浓度的结论。
根据另一个主题，本发明涉及根据本发明的生物传感器用于分析环境中至少一种生物因子的污染的用途。
本发明的生物传感器适用于检测医院环境中的患者、食品、农业或园艺领域或水处理领域中的至少一种生物因子的污染。
本发明的生物传感器特别适用于通过分析其体液如血液、汗液、尿液或唾液来检测患者的细菌污染。
本发明的生物传感器还特别适用于确定是否已超过感染剂量。
根据另一主题，本发明涉及一种用于分析环境中至少一种生物因子的污染的装置，其包括至少一种根据本发明的生物传感器。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不限于此。
实施例
实施例1-用于连接适体和染料的一般方案
设备
-搅拌器和板(涡旋)
-精密天平
-加热板
-电晕(corona)表面处理机
试剂
-3-巯基丙酸(mpa)，sigmaaldrich
-n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，sigmaaldrich
-1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)，sigmaaldrich
-去离子水和蒸馏水，ies
-[头孢菌素]-[atto]，sigmaaldrich(参考：c0682000-97875)
第1步-制备支撑物
·真空下热蒸发铝
将填充有铝金属的坩埚加热直至铝蒸发。面对坩埚，放置纸基体，以便将铝蒸气冷凝在所述基体上。
获得约1μm厚的铝层。
·阳极氧化
在填充有15％磷酸的罐中，在0℃-5℃的温度下，将在前一步骤中获得的涂覆有铝层的基体放置在直流发电机的阳极处，系统的阴极由铂制成(中间是惰性的)。
施加80v-120v之间的电压，并将基体浸入600秒至900秒的时间，以在铝沉积物的表面上形成一层氧化铝。持续600秒：厚度＝425nm-450nm，并且孔径＝81nm-96nm。持续900秒：厚度＝800nm-950nm，并且孔径＝81nm-96nm。
·清洁支撑物
然后通过将其浸入70℃的去离子水中1分钟，然后浸入20℃的去离子水中1分钟来清洁支撑物。
·表面处理(电晕效应)
然后通过电晕效应处理清洁后的支撑物的氧化铝表面30秒。该处理能够改善氧化铝表面的润湿性和表面张力(粘附性)，并且还能够保护其免受腐蚀。
步骤2：活化支撑物的表面
需要活化支撑物的氧化铝层的外表面以制备适体的接枝。
使用分子自组装(自组装单层)的常规方法，尤其wu等人(plosone2012,7(11),1-9)或braiek等人(biosensors2012,2,417-426)描述的方法来用-o-琥珀酰亚胺不稳定基团涂覆支撑物的氧化铝层的外表面。
为此，首先在氧化铝表面上沉积mpa(30μl的100mm溶液)，然后将如此涂覆的支撑物在室温下搅拌(板式涡旋搅拌器)1小时。
最初用-oh基团接枝的氧化铝层因此用–s-ch2ch2-c(o)-oh基团接枝。
在用蒸馏水洗涤如此官能化的表面后，将30μl的edc/nhs(含有100mmedc和50mmnhs的溶液，预先制备并搅拌1小时)的混合物沉积在表面上，然后将以这种方式涂覆的支撑物在室温下搅拌(板式涡旋搅拌器)1小时。
因此，氧化铝层用-s-ch2ch2-c(o)-o-琥珀酰亚胺基团接枝，-s-ch2ch2-c(o)-链对应于第一间隔物。
第3步
第一种变体：适体和染料的连续连接
根据称为“线性”的第一变体，首先将适体连接到支撑物上，然后将染料接枝到适体上。
制备适体的水溶液(浓度为1μmol/ml适体)。
根据希望检测的细菌类型，使用相关的适体。
下表显示了相关的适体(单链dna)：
所用适体的3’末端优选通过本领域技术人员已知的技术预先进行-cooh基团修饰。
或者，所用适体的5’末端可以通过本领域技术人员熟知的技术进行nh2基团修饰。
为了官能化支撑物表面的特定区域，可以使用适合于支撑物尺寸的掩模，并且该掩模具有至少一个开口，当掩模叠加在支撑物上时，该开口与希望官能化的支撑物的区域一致。该掩模可以具有对应于不同区域的多个开口，这些不同区域待被相同的适体或优选地待被不同的适体官能化，以便能够固定不同的感染因子(infectiousagents)。
因此，当需要用一种或多种适体官能化一个或多个区域时，叠加适合于支撑物尺寸并具有与待官能化的区域一样多的开口的掩模，然后通过本领域技术人员已知的任意方法，并在同一步骤中，将(多种)适体溶液沉积在(多个)相应的开口中。
除了使用掩模之外，还可以使用本领域技术人员已知的其他技术，例如喷墨印刷。为此，提供适体溶液作为喷墨打印机的墨水，并且连续喷涂待官能化的支撑物的区域。
无论使用何种技术，在沉积一种或多种适体后，将如此涂覆的支撑物在室温下搅拌(板式涡旋搅拌器)30分钟，然后停止搅拌并将支撑物置于通风橱下30分钟。
因此，适体分子(单链dna)通过其碱基之一(腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶)携带的-nh2基团与-s-ch2ch2-c(o)-o-琥珀酰亚胺基团连接。形成酰胺键-c(o)-nh-，并且n-羟基琥珀酰亚胺分子离去。
适体溶液的沉积可重复1或2次以优化接枝程度，然后将支撑物在室温下放置过夜，最后用蒸馏水冲洗。
在将适体连接到支撑物上之后，然后将染料接枝到适体上。
染料优选以前体的形式提供，含有对应于染料的第一单元和对应于第二间隔物的第二单元，这两个单元共价键合。
作为染料前体，优选使用化合物[头孢菌素]-[atto](sigmaaldrich)，其中[头孢菌素]单元表示第二间隔物并且包含游离-nh2基团，并且[atto]单元表示染料。
化合物[头孢菌素]-[atto]的连接通过如下进行：首先在预先用适体官能化的支撑物的特定区域上沉积偶联剂edc(10μl)，这使得能够活化适体的3’末端的游离-cooh基团。将支撑物在涡旋板上轻轻搅拌约30分钟，并在所述区域上沉积20μl的[头孢菌素]-[atto]复合物。
因此，通过在[头孢菌素]单元的游离-nh2基团和适体的3’末端的游离-cooh基团之间产生肽键，将染料如此连接到适体上。
第二种变体：适体和染料的一步连接
根据被称为“会聚性”的第二变体，首先将染料接枝到适体上，然后将该复合物连接到支撑物上。
该变体可以从第一变体改编，通过首先在远离支撑物的地方使适体和染料偶联。
作为适体，优选使用上述适体，其3’末端优选通过本领域技术人员已知的技术预先进行-cooh基团修饰。
作为染料，优选使用如上所述的化合物[头孢菌素]-[atto]。
适体和[头孢菌素]-[atto]染料之间的偶联可以根据本领域技术人员已知的方法通过肽偶联进行。
随后可以通过类似于第一变体中所用的方法将适体-[头孢菌素]-[atto]复合物接枝到预先用-s-ch2ch2-c(o)-o-琥珀酰亚胺基团官能化的支撑物的表面上。
实施例2—制备2d条形码生物传感器
使用实施例1的方案制备2d条形码生物传感器。
首先，制备氧化铝支撑物。
然后，打印条形码像素，留白待被适体和染料官能化的区域。
最后，将适体接枝到预定的特定区域上。
使用上述适体和[头孢菌素]-[atto]染料特别制备能够检测大肠杆菌atcc8739和金黄色葡萄球菌的生物传感器。
实施例3—实施2d条形码生物传感器
通过应用每个2d条形码来测试四个相同的2d条形码生物传感器，其在实施例2中制造并且能够检测大肠杆菌atcc8739和金黄色葡萄球菌：
-对照样品，其仅包含生理盐水，
-样品1，其包含生理盐水中浓度为106cfu的大肠杆菌atcc8739，
-样品2，其包括生理盐水中浓度为104cfu的金黄色葡萄球菌，或者
-样品3，其包含生理盐水中浓度为106cfu的大肠杆菌atcc8739和浓度为104cfu的金黄色葡萄球菌。
在施加样品后，肉眼无法检测到代码差异。
用配备有闪光灯(波长640nm至670nm)的智能手机拍摄三个生物传感器的2d条形码。
在对照样品的条形码图片中，没有识别出与初始代码的差异。
另一方面，在样品1的条形码照片中，与初始代码相比，代码显示被修改；被特异于大肠杆菌atcc8739的适体官能化的区域呈色。
同样，在样品2的条形码照片中，与初始代码相比，代码显示被修改；被特异于金黄色葡萄球菌的适体官能化的区域呈色。
至于样品3的条形码照片中，与初始代码相比，代码也显示被修改；被特异于大肠杆菌atcc8739的适体和被特异于金黄色葡萄球菌的适体官能化的区域均呈色。
比较由智能手机拍摄的代码与优选存储在智能手机中的参考代码，因此使得能够确定样品中是否存在细菌，以及细菌的类型。
与先前存储的校准值相比，测量代码照片上出现的颜色对比度也使得能够确定样品1、2和3中每个样品中的细菌浓度。
实施例4—使用显色抗生素作为着色分子的1d和2d条形码的实施方案实施例
在该实施例中，使用如下实施例5中制备的生物传感器。
4.1.制备2d条形码
图3示出了通过根据本发明的生物传感器揭示目标细菌之前和之后由色调变化产生的2d条形码的视觉变化。
进行以下观察：
-在(a)中，2d条形码的基本矩阵。它由小方块形成。
-在(b)中，2d条形码包含信息；例如，在这种情况下，“neg”(表示阴性)。这是可能的，因为小黄色方块(深色)和白色方块(浅色)之间存在对比度。
一些小方块(白色或黄色)已通过上述方法被官能化。与液体生物样品，如唾液、尿液、血液、汗液或使用此类样品的任意制剂接触。
-在(c)中，2d条形码被官能化以检测一种或多种目标细菌，并如上所述使用。在目前的情况下，该2d条形码检测不存在目标细菌。
-在(d)中，如上所述使用被官能化以检测一种或多种目标细菌的2d条形码。在目前的情况下，2d条形码检测存在目标细菌；即，小的官能化的方块改变色调(黑色方块可以变亮，反之亦然)。
在目前的情况下，小的黄色或白色方块变为红色。结果，小的黄色和白色方块变成“浅色”方块，小的红色方块变成“深色”方块。因此，2d条形码所携带的消息已经改变。由此产生的对比度使得能够将“pos”读作阳性。
4.2.制备1d条形码
图4示出了通过根据本发明的生物传感器揭示目标细菌之前和之后由色调变化产生的1d条形码的视觉变化。
进行以下观察：
-在(a)中，即在使细菌与生物传感器接触之前，1d条形码的基础矩阵由深色或浅色矩形形成。
-在(b)中，1d条形码包含信息；例如，在这种情况下，“neg”(表示阴性)。这是可能的，因为黄色矩形(深色)和白色矩形(浅色)之间存在对比度。
一些矩形(白色或黄色)已通过上述方法被官能化。
-在(c)中，生物传感器被官能化以检测一种或多种目标细菌，并如上所述使用。在目前的情况下，1d条形码仅检测存在目标细菌。矩形保持黄色。因此，该1d条形码检测不存在目标细菌。
-在(d)中，使用被官能化的生物传感器并作出积极反应；即，被官能化的矩形已经改变了色调(深色矩形可以变亮，反之亦然)。
在目前的情况下，黄色或白色矩形变为红色。结果，黄色和白色矩形变成“浅色”矩形，红色矩形变成“深色”矩形。因此，1d条形码所携带的消息已经改变。由此产生的对比度使得能够将“pos”读作阳性。
实施例5—实施柔性塑料生物传感器
该实施例中描述的生物传感器说明了本发明的变体，其中着色分子包含显色抗生素，在本实施例中来自头孢菌素类：头孢硝噻吩，该变体不需要存在第二间隔物。在抗生素的内酰胺环上β-内酰胺酶攻击后没有发生不稳定键断裂。
设备
-搅拌器和板(涡旋)
-精密天平
-加热板
-电晕表面处理机
试剂
-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(tpm)，sigmaaldrich
-氢氧化钠(naoh)，sigmaaldrich
-去离子水和蒸馏水，ies
-头孢硝噻吩，sigmaaldrich
-适体：大肠杆菌o157：h7，在其5’末端用nh2修饰
-二甲基亚砜(dmso)，sigmaaldrich
-lactamator：β-内酰胺酶溶液，cpcbiotech
步骤1—制备支撑物
在一个实施例中，被官能化的支撑物是柔性塑料支撑物，teslin，一种疏水性的合成基体，其具有非常坚固同时非常薄的优点。
如上(实施例1)，进行电晕预处理5分钟。
随后使用低浓度(<20％)的氢氧化钠浴将oh基团加入到基体的表面，然后用蒸馏水冲洗。
步骤2：使用接头接枝适体
如上所述(实施例1)，该固定化技术基于自组装单层的原理，在此由有机硅烷tpm形成。
该步骤需要数小时的孵育(1小时至6小时)，并测试10至50mm的浓度。孵育在通风橱下，伴随搅拌并在室温下进行。为了除去未接枝的分子，用蒸馏水进行冲洗。
随后将适体连接到tpm。通过本领域技术人员已知的技术用胺基(nh2)修饰适体的5’末端。随后根据实施例1中所述的方案将适体加入到样品中。
随后用蒸馏水冲洗样品以除去未特异性结合tpm的适体。
步骤3：连接染料
测试的适体(seqidno：4)以鸟嘌呤碱基结束，其末端天然具有游离的nh2基团(因为适体是单链的，nh2基团不参与与胞嘧啶的氢键合，如在双链配置中的情况)。
该nh2基团用于连接着色分子。在该实施例中，着色分子表示头孢菌素类的显色抗生素：头孢硝噻吩。使用显色抗生素是这里测试的变体，因为它能够除去除额外的步骤并简化颜色检测(肉眼可见)。
迄今已测试了不同浓度的头孢硝噻吩(5至30mm)。
孵育(30分钟至3小时)后，用dmso冲洗样品。在此步骤结束时，支撑物上出现黄色。
步骤4：比色测试和特异性
进行第一次测试以确保在被官能化的基体的表面(沉积几十微升的β-内酰胺酶溶液)上存在头孢硝噻吩。然后在基体表面上观察到红色，表明头孢硝噻吩确实与接枝在基体上的分子构建体结合。
进行第二次测试以验证，在没有上述分子构建体的情况下，在用dmso冲洗期间除去了头孢硝噻吩。在两个不同步骤(步骤1和步骤2)之后进行了该测试。在两种情况下，β-内酰胺酶的添加不会引起比色反应。
序列表
<110>国家科学研究中心(cnrs)
蒙彼利埃大学
艾克拉萨特朗格多克鲁西荣公司
<120>用于检测细菌的存在的生物传感器
<130>pr78433
<150>fr1656702
<151>2016-07-12
<160>4
<170>bissap1.3.2
<210>1
<211>33
<212>dna
<213>大肠杆菌atcc8739
<223>"适体"
<223>"适体"
<220>
<223>适体
<220>
<223>适体
<400>1
cgcgtcccccgccgggcgcgcgccaggatcgac33
<210>2
<211>87
<212>dna
<213>大肠杆菌o157:h7
<223>"适体"
<223>"适体"
<220>
<223>适体
<220>
<223>适体
<400>2
cttctgcccgcctccttcctagccggatcgcgctggccagatgatataaaggggtcagcc60
ccccaggagacgagataggcggacact87
<210>3
<211>39
<212>dna
<213>金黄色葡萄球菌
<223>"适体"
<223>"适体"
<220>
<223>适体
<220>
<223>适体
<400>3
tccctacggcgctaacgccaccgtgctacaactcggatt39
<210>4
<211>36
<212>dna
<213>大肠杆菌o157:h7
<223>"适体"
<220>
<223>适体
<400>4
gtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatgcg36