用于检测生物样品中蜱传微生物的方法和固体支持物与流程

本发明涉及莱姆病和其他蜱传疾病的检测。本发明还涉及生物样品中抗体的检测。特别地，本发明提供了用于蜱传疾病(tbd)微生物的多重且多功能检测平台。

发明背景

蜱传微生物(tbm)被定义为通过蜱叮咬传播到宿主的肉眼可见的有毒实体。蜱虫是疾病传播的特殊载体，几乎遍布各大洲，全球物种数量超过850种。欧洲和北美最常见的蜱传疾病(tbd)是由螺旋体疏螺旋体属物种引起的莱姆病^1，2。在全球范围内，莱姆病在80个国家流行，包括27个欧盟国家和中亚地区^3,4。除了疏螺旋体外，还有许多共感染的其他细菌，甚至是病毒，如巴贝虫，立克次氏体，埃里希氏体，巴尔通体，蜱传脑炎病毒等^5,6。美国和欧洲的疾病控制中心分别报告了300,000例和85,000例年度tbd病例。然而，正如世界卫生组织所强调的那样，年度tbd病例总数被严重低估⁷。

对于患者的临床诊断可能具有挑战性，因为tbm感染最初表现为非特异性发热性疾病，伴有或不伴有特定器官系统受累，类似流感样症状^2,5,8。为了进一步使治疗方案复杂化，这些患者常常发生支原体，衣原体，爱泼斯坦-巴尔病毒或其他病毒的继发感染⁶。由于低估，误诊，合并感染和继发感染，治疗不当可能导致严重的临床病况，如疲劳，肌肉/关节疼痛，心血管/认知障碍等的发展⁹。由于诊断不当，患者会出现严重的临床病况，并且治疗会降低他们的生活质量；因此增加了医疗负担^9,10。由于临床症状多种多样且不明确，可靠的诊断方法对于及时准确地治疗患者至关重要^4,6,11,12。

蜱传感染诊断的挑战在于，由于患者活组织检查中存在的活病原体数量较少而难以实施直接的检测方法，例如培养和聚合酶链式反应(pcr)。这导致了阴性结果，并且不排除患者可能患有的活动性感染或疾病的不同阶段^2,5,13。诸如酶联免疫吸附测定(elisa)的间接方法是有限的抗体测试，其可能在感染或疾病的早期阶段微弱存在或不存在。由于不同细菌物种之间的交叉反应性问题，在这些基于抗体的测定中还出现相当多的假阳性结果。然而，在成功治疗感染后，阳性特异性抗体应答可持续数月或数年。这些现有的方法高达80％不能检测到蜱传疾病第一阶段，并且无法区分急性和慢性感染^4,11。进一步增加挑战的是，大多数基于elisa的诊断是针对动物而不是人类，并且通常针对一种tbm而不是多种tbm³。

正在使用的诊断工具并没有配备当前的研究结果。近年来，与疏螺旋体的圆形体相关的科学发展¹⁴，疏螺旋体物种形成的重要性^15,16，多种微生物感染¹²和tbd患者中的igm免疫功能障碍¹⁷对于我们对tbd的临床理解提出了挑战。疏螺旋体的圆形体是疏螺旋体的螺旋体多形性结构之一¹⁴。多年来，疏螺旋体的多形性形式被标记为细胞壁缺陷(cwd)，l-形式，原生质球，原生质体，繁殖体或囊肿^5,8,18-20。直到最近，等人(2015)通过电镜分析得出疏螺旋体为圆形体(rb)而解决了疏螺旋体多形性形态的差异。等人(2015)在人血清中诱导了疏螺旋体rb并且展示了具有完整且柔性细胞壁的球形rb，其代谢不活跃且具有独特生化特征。尽管有关疏螺旋体多形性形态的临床表现已被多次报道，但其在tbd中的致病作用一直存在争议和批评。正在使用的诊断工具无法检测tbd患者的疏螺旋体的圆形体^8,21-25。

目前的诊断工具可以单独或共同测试不同的疏螺旋体的螺旋体，因为它们在个体中呈现不同的临床表现¹⁶。最近，多重tbd诊断工具可以测试不同的重组疏螺旋体蛋白，但tbd已被公认为多种微生物感染疾病，并且正在使用的诊断工具无法诊断个体的继发性机会性感染，共感染以及与感染有关的自身免疫病症^5,13,22-25。

为了解决正在使用的tbd检测工具中的缺陷，本发明提供了一种新的固体支持物，其包含至少一种由疏螺旋体属(伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)，埃氏疏螺旋体(borreliaafzelii)和伽氏疏螺旋体(borreliagarinii))的多形性圆形体制备的固定化抗原。本发明的结果首次表明，个体的免疫系统可以只对疏螺旋体的圆形体特异性应答，并且这种免疫应答可能与莱姆病的持续阶段有关。

发明概述

本说明书的目的是提供一种新的检测平台，其概述了患者正在经历的tbd的急性，过去且特别是慢性或持续的阶段。另外，本说明书还可以解决与tbd相关的多种微生物和免疫功能障碍方面。

因此，在一方面，本说明书提供了用于检测生物样品中抗体的存在的固体支持物，所述固体支持物包含固定在所述固体支持物上的微生物抗原，其中所述微生物抗原包含至少一种由疏螺旋体的多形性圆形体制备的抗原。

另一方面，本说明书提供了检测生物样品中蜱传微生物的方法，所述方法包括：

(a)使生物样品与固体支持物接触，所述固体支持物包含固定在所述固体支持物上的微生物抗原，以形成包含固定在所述固体支持物上的微生物抗原和源自所述生物样品的抗体的复合物，所述抗体与所述微生物抗原结合，其中所述微生物抗原包含至少一种由疏螺旋体的多形性圆形体制备的抗原；和(c)检测步骤(a)中获得的复合物的存在，其中包含由疏螺旋体属至少一种物种的多形性圆形体制备的抗原的复合物的存在是所述生物样品中存在蜱传微生物的指示。

另一方面，本说明书提供了如上定义的固体支持物，其用于诊断莱姆病。

另一方面，本说明书提供了如上定义的固体支持物在制备用于检测生物样品中蜱传微生物的诊断测定法中的用途。

附图简要说明

图1.(a)对所有疏螺旋体抗原的总igm免疫应答，(b)仅对疏螺旋体的螺旋体的总igm免疫应答，和(c)仅对疏螺旋体的圆形体的总igm免疫应答。在1a和1b中，缩写bb，ba和bg分别是狭义伯氏疏螺旋体b31，埃氏疏螺旋体p12和伽氏疏螺旋体fujip1。

图2.(a)对所有疏螺旋体抗原的总igg免疫应答，(b)仅对疏螺旋体的螺旋体的总igg免疫应答，和(c)仅对疏螺旋体的圆形体的总igg免疫应答。在2a和2b中，缩写bb，ba和bg分别是狭义伯氏疏螺旋体b31，埃氏疏螺旋体p12和伽氏疏螺旋体fujip1。

图3.()()针对一种或多种微生物抗原的(a)igm和(b)igg免疫应答的评估。使用一定量的443份人血清来评估个体是否仅响应一种微生物抗原还是多种微生物抗原。另外，评估了对20种抗原没有免疫应答的个体。

图4.对个体微生物抗原的igg免疫应答。使用一定量的443份人血清来评估对本研究中使用的每种微生物抗原的免疫应答总数。另外，评估了对20种抗原没有免疫应答的个体。

图5.对个体微生物抗原的igm免疫应答。使用一定量的443种人血清来评估对本研究中使用的每种微生物抗原的免疫应答总数。另外，评估了对20种抗原没有免疫应答的个体。

图6：(a)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对其他微生物的总igm免疫应答比例，(b)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对多种其他微生物数量的igm免疫应答，和(c)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对特定其他微生物的igm免疫应答。使用一定量的443份人血清来比较对仅疏螺旋体的螺旋体、仅疏螺旋体的圆形体或者疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体之间，对多种其他微生物及其特定类型的igm免疫应答的频率。术语“其他微生物”包括共感染，继发性和自身免疫抗原，例如汉氏巴尔通体(b.henselae)，流产布鲁氏菌(b.abortus)，微小巴贝虫(b.microti)，查菲埃立克体(e.chaffeensis)，小株立克次体(r.akari)，蜱传脑炎病毒(tbev)，沙眼衣原体(c.trachomatis)，肺炎衣原体(c.pneumonia)，发酵支原体(m.fermentans)，肺炎支原体(m.pneumonia)，巨细胞病毒(cmv)，爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，柯萨奇病毒a16(cva16)和人类细小病毒b19(hb19v)。

图7：(a)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对其他微生物的总igg免疫应答比例，(b)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对多种其他微生物数量的igg免疫应答，和(c)在有和无疏螺旋体的情况下，个体对特定其他微生物的igg免疫应答。使用一定量的443份人血清来比较对仅疏螺旋体的螺旋体、疏螺旋体的圆形体或疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体之间，对多种其他微生物及其特定类型的igg免疫应答的频率。术语“其他微生物”包括共感染，继发性和自身免疫抗原，例如汉氏巴尔通体(b.henselae)，流产布鲁氏菌(b.abortus)，微小巴贝虫(b.microti)，查菲埃立克体(e.chaffeensis)，小株立克次体(r.akari)，蜱传脑炎病毒(tbev)，沙眼衣原体(c.trachomatis)，肺炎衣原体(c.pneumonia)，发酵支原体(m.fermentans)，肺炎支原体(m.pneumonia)，巨细胞病毒(cmv)，爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，柯萨奇病毒a16(cva16)和人类细小病毒b19(hb19v)。

实施方案描述

迄今为止，现有的tbd诊断工具依赖于筛查一种疾病的一种免疫应答(igg或igm)，并且通常需要对该检查结果进行二次确认试验。本说明书提供了通过检测针对疏螺旋体的多形性圆形体的免疫应答来检测莱姆病的慢性、潜伏或持续阶段的手段和方法。

已知至少18种疏螺旋体引起莱姆病或螺旋体症，并且其通过蜱虫传播⁴⁸。主要的莱姆病病原体是伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体。其他的病原体例如是宫本疏螺旋体(borreliamiyamotoi)，坦尼基疏螺旋体(borreliatanukii)，土德疏螺旋体(borreliaturdi)，法雷斯疏螺旋体(borreliavalaisiana)，borreliacarolinensis，美洲疏螺旋体(b.americana)，卢西塔尼亚疏螺旋体(borrelialusitaniae)，日本疏螺旋体(borreliajaponica)和西尼伽疏螺旋体(b.sinica)。

作为多重且多功能平台，本发明的方面可用于同时针对多种微生物和抗体类别诊断个体。有助于诊断tbd个体的原发性，持续性，继发性，共感染和自身免疫状况的微生物抗原列于下表1中。

本发明涉及用于检测生物样品中抗体的存在的固体支持物，所述固体支持物包含固定在所述固体支持物上的微生物抗原，其中所述微生物抗原包含至少一种由疏螺旋体属物种(如伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体)的多形性圆形体制备的抗原。

术语“多形性”在本文中是指多形现象，其在微生物学中定义为一些细菌响应环境条件而改变其形状或大小的能力。本说明书中定义的多形性圆形体可以如等人(2015)的披露或如下文实验部分的公开进行诱导。不希望受理论束缚，桶形螺旋体(即平均长度为20μm的长螺旋形细胞)将其形状改变为多形性圆形体(即平均直径为2.8±0.46μm的球形细胞)的基础是细菌受到来自环境的生理压力。因此，除了细菌培养基条件的变化外，诸如渗透压等应激条件也有助于诱导圆形体⁴⁷。

以前，伯氏疏螺旋体的圆形体(rb)以各种方式被模糊地命名。这些术语包括cwd和l-形式，原生质球，原生质体，繁殖体甚至是囊肿。尽管如此，所有这些标签都描述了相同的球形结构¹⁴。

在实施方案中，由疏螺旋体的多形性圆形体制备的至少一种抗原对疏螺旋体的多形性圆形体具有特异性。

在实施方案中，固体支持物上的固定化抗原是培养的疏螺旋体属(例如，伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体)的多形性圆形体的裂解物或裂解物的一部分。所述固定化抗原也可以是所述多形性圆形体的蛋白质或肽制备物。其他已知的制备物(包含来自例如通过使用ph变换，人血清，盐浓度变化制备的微生物细胞的抗原)，也可用于本发明。

为了同时检测莱姆病的急性和慢性或持续阶段，所述固体支持物还可以包含至少一种固定化抗原，其由天然螺旋体形式的疏螺旋体属如伯氏疏螺旋体埃氏疏螺旋体伽氏疏螺旋体或其裂解物制备。

在实施方案中，至少一种由天然螺旋体形式的疏螺旋体制备的固定化抗原对天然螺旋体形式的疏螺旋体具有特异性。

在实施方案中，该测定涉及检测一种特定的疏螺旋体，例如，其中1)所述固体支持物包含由伯氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原和由天然螺旋体形式的伯氏疏螺旋体制备的固定化抗原；2)所述固体支持物包含由埃氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原和由天然螺旋体形式的埃氏疏螺旋体制备的固定化抗原；或3)所述固体支持物包含由伽氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原和由天然螺旋体形式的伽氏疏螺旋体制备的固定化抗原。

在实施方案中，由伯氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原对伯氏疏螺旋体的多形性圆形体具有特异性，并且由天然螺旋体形式的伯氏疏螺旋体制备的固定化抗原对天然螺旋体形式的伯氏疏螺旋体具有特异性。

在实施方案中，由埃氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原对埃氏疏螺旋体的多形性圆形体具有特异性，并且由天然螺旋体形式的埃氏疏螺旋体制备的固定化抗原对天然螺旋体形式的埃氏疏螺旋体具有特异性。

在实施方案中，由伽氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原对伽氏疏螺旋体的多形性圆形体具有特异性，并且由天然螺旋体形式的伽氏疏螺旋体制备的固定化抗原对天然螺旋体形式的伽氏疏螺旋体具有特异性。

在实施方案中，产生用于多重测定的固体支持物，其中所述固体支持物包含由疏螺旋体，优选伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和/或伽氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原。在另一实施方案中，多重测定还包含由天然螺旋体形式的疏螺旋体，例如伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和/或伽氏疏螺旋体制备的固定化抗原。

在实施方案中，由伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体的多形性圆形体制备的固定化抗原分别对伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体的多形性圆形体具有特异性。

多重测定还可以包含至少一种由以下制备的固定化抗原：发酵支原体，肺炎支原体，汉氏巴尔通体，流产布鲁氏菌，微小巴贝虫，沙眼衣原体，肺炎衣原体，查菲埃立克体，柯萨奇病毒a16，爱泼斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒(cmv)，人类细小病毒b19apobod，蜱传脑炎病毒(tbev)和小株立克次体。

在实施方案中，至少一种由发酵支原体，肺炎支原体，汉氏巴尔通体，流产布鲁氏菌，微小巴贝虫，沙眼衣原体，肺炎衣原体，查菲埃立克体，柯萨奇病毒a16，爱泼斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒，人类细小病毒b19apobod，蜱传脑炎病毒和小株立克次体制备的固定化抗原分别对发酵支原体，肺炎支原体，汉氏巴尔通体，流产布鲁氏菌，微小巴贝虫，沙眼衣原体，肺炎衣原体，查菲埃立克体，柯萨奇病毒a16，爱泼斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒，人类细小病毒b19apobod，蜱传脑炎病毒和小株立克次体具有特异性。

所述固体支持物可以由玻璃或塑料，例如聚苯乙烯或聚丙烯制成。本说明书的固体支持物的实例是抗原微阵列或微孔板。抗原微阵列是蛋白质微阵列的形式，也称为蛋白质芯片。微阵列是固体支持物(通常是玻璃)，其上数千种不同的蛋白质(在这种情况下是抗原)固定在离散的空间位置，形成高密度蛋白质点阵。微孔板是具有多个“孔”的平板，其中每个孔用于一个特定样品。微孔板是临床诊断测试实验室中的标准工具。一种非常常见的用法是酶联免疫吸附测定(elisa)。

在实施方案中，本说明书涉及如本文所定义的固体支持物，其用于诊断莱姆病，例如慢性/持续性莱姆病。

在另一实施方案中，本说明书涉及如本文所定义的固体支持物在制备用于检测生物样品中蜱传微生物的诊断测定法中的用途。在实施方案中，所述诊断测定法用于检测患者的莱姆病，例如患者的慢性/持续性莱姆病。

“患者”，“个体”或“供体”可以是哺乳动物受试者，例如人受试者。

本说明书还涉及检测生物样品中的蜱传微生物的方法，该方法包括：

(a)使生物样品与固体支持物接触，所述固体支持物包含固定在所述固体支持物上的微生物抗原，以形成包含固定在固体支持物上的微生物抗原和源自所述生物样品的抗体的复合物，所述抗体与所述微生物抗原结合，其中所述微生物抗原包含至少一种由疏螺旋体的多形性圆形体制备的抗原；和

(b)检测步骤(a)中获得的复合物的存在，其中包含由疏螺旋体属的多形性圆形体制备的抗原的复合物的存在是所述生物样品中存在蜱传微生物的指示。

在实施方案中，步骤(a)中获得的复合物的存在通过以下来检测：使所述固体支持物与抗-抗体试剂接触以形成所述微生物抗原()、与所述微生物抗原结合的所述抗体和所述抗-抗体试剂的复合物-。

本说明书还提供了以单个试剂盒特异性和灵敏性地筛选针对多种微生物的个体的igg和igm或iga应答的机会。因此，所述抗-抗体试剂可以是抗igg抗体，抗igm抗体或抗iga抗体。例如，所述抗-抗体试剂可以是抗人igg抗体，抗人igm抗体或抗人iga抗体。

在实施方案中，所述生物样品是血液，血清，尿液，唾液或泪液样品，脑脊髓液样品或滑液样品，例如血清样品。

在实施方案中，本发明方法包括以下在先步骤：在产生多形性圆形体的条件下培养疏螺旋体(如伯氏疏螺旋体，埃氏疏螺旋体或伽氏疏螺旋体)，进行培养细胞的裂解，以及用裂解物或部分裂解物涂覆或印制固体支持物。所述产生多形性圆形体的条件如等人(2015)所公开或如下面的实验部分所公开，例如在蒸馏水中或在改变盐浓度下，或在人血清存在下或将培养物转移至酸性ph下孵育疏螺旋体的螺旋体细胞。在培养步骤之后，除了细胞裂解之外，在该方面也可以使用用于从微生物细胞产生抗原的其他已知技术。例如，可以从所述多形性圆形体制备抗原肽和蛋白质用于涂覆或印制步骤。

现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实验部分将更容易理解本发明，所述实验部分是以说明的方式提供的而不是限制性的。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。

实验部分

材料和方法

血清样品采集的伦理批准

从德国的borreliosecentrumaugsburg(bca)；丹麦国王基督教第十医院风湿病；欧洲多个诊所/专业实验室收集了总共532个人血清样品，分别经德国联邦药品和医疗器械研究(伦理批准号：95.10-5661-7066)；丹麦数据保护机构和南丹麦区域伦理委员会(伦理批准号：s-20110029)；和西方机构审查委员会(伦理批准号：usma201441)批准。在532个人血清样品中，51个阴性对照分配给igg，另外51个阴性对照分配给igm。阴性对照用于建立两种抗体类别的定性截止值。

制备用于elisa的抗原

对于igm和igg抗体应答，针对20种微生物抗原测试所有532个人血清样品。在表1中列出了全部20种抗原。在内部培养和分离疏螺旋体的螺旋体，疏螺旋体的圆形体和人类细小病毒b19apobod。按照其他报道的方法培养和分离人类细小病毒b19apobod^26,27。marcoquevendodiaz博士(斯洛伐克科学院)提供了小株立克次体纯化和去活化的裂解物。其余18种微生物从genecust以冻干微生物肽订购。制备直接用于elisa的1mg/ml的小株立克次体和所有微生物肽的原液。

螺旋体和多形性形式的疏螺旋体的培养和分离

疏螺旋体培养物获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。barbour-stoenner-kelly(bsk)培养基用于培养所有三种疏螺旋体培养物。bsk培养基根据先前报道的说明书制备³⁹。为了培养和分离天然螺旋体形式的疏螺旋体，每种疏螺旋体菌株在bsk培养基中于37℃下独立生长5-7天。孵育后，通过将培养管以5000g离心10分钟来分离疏螺旋体细胞。弃去上清液，细胞团在进一步使用前于-80℃保存¹⁴。

为了培养不同的疏螺旋体的圆形体菌株，将相应的疏螺旋体的螺旋体细胞团重悬于2ml蒸馏水(ddh2o)中。将疏螺旋体的螺旋体细胞在水中或在改变盐浓度，或转移至酸性ph或在人血清存在下于37℃孵育2小时。孵育后，将疏螺旋体细胞以5000g离心10分钟。弃去上清液，疏螺旋体的圆形体团在进一步使用前于-80℃保存¹⁴。

人类细小病毒b19apobod的培养和分离：

kivovich等人，(2010)和thammasri等人，(2013)报道了人类细小病毒b19(b19v)诱导的凋亡小体的产生和这些凋亡小体(本文称为b19vapobod)的分离。简言之，将b19v非结构蛋白(ns1)与增强型绿色荧光蛋白(egfp)一起克隆到经修饰的pfastbac1载体中。经修饰的pfastbac1载体用于在苜蓿银纹夜蛾(autographacalifornica)病毒载体中产生重组杆状病毒。得到的结构被称为accmv-egfp-ns1。通过使用bac-to-杆状病毒表达系统，制备重组杆状病毒原种。将昆虫细胞草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(sf9细胞atcccrl-1711，manassas，va)的单层培养物用于病毒原种扩增。病毒原种含有重组杆粒dna。感染后(pi)，收集3代病毒原种，每次在pi48或72小时时。将细胞离心并过滤后，通过hepg2细胞生长过夜并用重组acegfp或acegfp-ns1转导来测定它们的转导效率。利用bdfacscalibur流式细胞仪(becton-dickinson，nj，usa)来验证病毒是否具有70％转导效率，以进一步用于凋亡小体(apobod)诱导。此外，用第三代acegfp-ns1病毒转导hepg2细胞，转导效率为70％。最后，在转导后72小时，将培养物中的上清液离心，沉淀，并在进一步使用前于-80℃保存。

处理分离的微生物团以用于elisa

将疏螺旋体的螺旋体，疏螺旋体的圆形体和b19vapobod团在冰上解冻并重悬于100μl磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs，ph7.4)中。为了解离裂解物，使内容物均匀溶解在pbs中，将所有的溶液先后超声处理15分钟(bransonic220)，在99.9℃加热15分钟并再次超声处理15分钟。最后，将所有抗原的1mg/ml储备浓度于+4℃保存。

elisa程序

将抗原原液(1mg/ml)以1：100稀释于0.1m碳酸盐缓冲液(0.1mna2co3+0.1mnahco3，ph9.5)中。对于利用两个肽序列的微生物而言，将稀释体积在原液之间均等分开。在该研究中使用两种阳性对照，人igg(sigma)和人igm(sigma)。另外，人igg(sigma)和人igm(sigma#i8260)可互换地用作彼此的阴性对照。将对照原液(1mg/ml)以1：100稀释在0.1m碳酸盐缓冲液中。利用阳性和阴性对照来在450nm处保持一致的光密度(od)值。

将100μl抗原和对照一式两份涂布在平底96孔聚苯乙烯elisa板(nunc)上，并在+4℃孵育过夜。孵育后，将板用300μlpbs-tween(pbs+0.05％tween20)洗涤三次，然后用100μl含2％bsa(sigma#a7030)的pbs包被。在+4℃孵育过夜后，弃去含2％bsa的pbs。此外，加入在1％bsa/pbs中以1：200稀释的100μl患者血清。然后将板在室温(rt)下孵育2小时。孵育后，将板用300μlpbs-tween洗涤五次。将与小鼠抗人igg(abcam)或兔抗人igm(antibodiesonline)缀合的100μl量的辣根过氧化物酶(hrp)分别以1：10000或1：1000的稀释系数引入板中。在室温下孵育1.5小时后，将板用300μlpbs-tween洗涤五次，然后补充100μl3,3',5,5'四甲基联苯胺底物(tmb，1-stepultratmb-elisa底物，thermo-piercenet#34028)。将预先补充有与小鼠抗人igg或igm缀合的hrp的板分别在室温下孵育5分钟或1小时。通过加入100μl的2mh2so4终止二抗和tmb底物之间的反应。此外，使用victor^tmx⁴多标记酶标仪(perkinelmer2030manger)以0.1秒测量450nm处的od值。

数据处理

出于质量保证目的，评估每个重复在彼此的30％范围内。不是评估重复在其平均值的30％内，而是评估重复在彼此的30％范围内。由于彼此30％范围内的重复与其平均值无关，因此与其平均值的30％内的重复相比，读数之间的差异非常有限。在igg中使用一组51个阴性对照，在igm中使用另一组51个阴性对照以建立20种抗原的定性截止值。对于抗原，通过将所有平均od值的平均值加上所有平均od值的标准差的三倍来确定截止值⁴¹。在建立20种抗原的截止值时，将所有平均od值除以它们各自的抗原截止值以标准化数据集。通过标准化所有od值，建立两种抗体类型的光密度指数(odi)数据集。最后，将odi值转换为二进制数据集，其包含分别表示正数或负数的1或0。

通过计算测定内和测定间变化来评估变化⁴²。通过来自同一板上的一个高滴度和一个低滴度样品的重复测量来确定测定内变化。对于测定间变化，通过测量来自由不同操作者在不同日期进行的不同板的六个高滴度样品和六个低滴度样品来确定变化。

使用的设备

nd1000分光光度计(finnzymes)用于测量280nm处细胞裂解物的蛋白质浓度。使用victor^tmx⁴多标记酶标仪(perkinelmer2030manger)以0.1秒测量450nm处的od值。微孔板清洗机dnx-9620g(南京佩洛韦医疗设备有限公司)用于洗涤elisa微孔板。

结果

图1和图2显示了443个个体对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合，仅对疏螺旋体的螺旋体，以及仅对疏螺旋体的圆形体的免疫应答。与仅对疏螺旋体的螺旋体的igm和igg免疫应答的总数相比，仅对疏螺旋体的圆形体的igm和igg(图1a和图2a)免疫应答的总数始终更高。此外，与仅对疏螺旋体的螺旋体和仅对疏螺旋体的圆形体的igm和igg免疫应答的总数相比，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的不同组合的igm和igg(图1a和2a)免疫应答的总数更高。此外，在图1b和图2b中，与针对疏螺旋体的螺旋体的不同组合记录的免疫应答的总数相比，不同种类的疏螺旋体的螺旋体证实了更高数量的免疫应答。类似地，在图1c和图2c中，记录了与疏螺旋体的圆形体的不同组合相比，不同种类的疏螺旋体的圆形体的更高数量的免疫应答。图1和图2表明，除了不同种类的疏螺旋体的螺旋体之外，不同种类的疏螺旋体的圆形体也可以帮助极大地提高用于检测个体中的疏螺旋体感染的诊断工具的效率。

在图1a中，95个(21％)，15个(3％)和65个(15％)具有igm的个体分别对疏螺旋体的螺旋体和圆形体，仅对疏螺旋体的螺旋体以及仅对疏螺旋体的圆形体应答。与仅对疏螺旋体的螺旋体的免疫应答的总数相比，仅对疏螺旋体的圆形体的免疫应答的总数大约高5倍。其余268个(61％)个体对任何疏螺旋体抗原均无应答。疏螺旋体的圆形体代表天然疏螺旋体的螺旋体结构的休眠或潜伏形式^5,9,14。具有igm的患者响应疏螺旋体的圆形体比响应其自身的螺旋体结构更多，表明igm免疫功能障碍¹⁷。类似地，在图2a中，171个(38％)，47个(11％)和71个(16％)具有igg的个体分别对疏螺旋体的螺旋体和圆形体，仅对疏螺旋体的螺旋体以及仅对疏螺旋体的圆形体应答。与仅对疏螺旋体的螺旋体的免疫应答的总数相比，仅对疏螺旋体的圆形体的免疫应答的总数大约高2倍。其余154个(35％)个体对任何疏螺旋体抗原均无应答。对疏螺旋体的圆形体的更高数量的免疫应答表明，仅含有疏螺旋体的螺旋体的诊断试剂盒不能为个体提供完整和可靠的疏螺旋体感染诊断。因此，实施疏螺旋体的圆形体和疏螺旋体的螺旋体用于诊断tbd患者是本研究的绝对新颖之处。

感染疏螺旋体不同菌株的个体需要不同的治疗性处理¹⁶。因此，个体必须针对不同的疏螺旋体菌株进行诊断。对仅对疏螺旋体的螺旋体和仅对疏螺旋体的圆形体的免疫应答(图1a和图2a)进行了进一步的鉴定(图1b，图1c，图2b和图2c)，以评估对个体疏螺旋体菌株的免疫应答总数是否超过对疏螺旋体菌株不同组合的免疫应答的总数。与对疏螺旋体菌株不同组合的免疫应答的总数相比，对个体疏螺旋体菌株的免疫应答的总数始终更高(图1b，图1c，图2b和图2c)。

在图1a中，仅对疏螺旋体的螺旋体应答的15个(3％)个体在图1b中进行进一步鉴定并评估。在15个(3％)个体中，1个(7％)，5个(33％)和5个(33％)个体分别对伯氏疏螺旋体(bb)，埃氏疏螺旋体(ba)和伽氏疏螺旋体(bg)的螺旋体有应答。此外，3个(20％)和1个(7％)个体分别对ba+bg和bb+ba+bg螺旋体的组合应答。在15个个体中，4个(27％)个体对不同的疏螺旋体菌株的组合应答，而11个(73％)个体对不同的疏螺旋体菌株应答。类似地，在图2b中进行进一步鉴定和评估了在图2a中仅对疏螺旋体的螺旋体应答的47个(11％)个体。在47个(11％)个体中，3个(6％)，10个(21％)和13个(28％)个体分别对bb，ba和bg螺旋体应答。此外，4个(9％)，7个(15％)和10个(21％)个体分别对bb+bg，ba+bg和bb+ba+bg螺旋体的组合应答。在47个(11％)个体中，21个(45％)个体对不同疏螺旋体菌株的组合应答，而26个(55％)个体对不同的疏螺旋体菌株应答。在igm(图1b)和igg(图2b)中均未记录到针对bb+ba组合的免疫应答。而且，在图1b中，没有记录到针对bb+bg组合的免疫应答。

在图1c中进行进一步鉴定和评估了在图1a中仅对疏螺旋体的圆形体应答的65个(15％)个体。在65个(15％)个体中，16个(25％)，12个(18％)和13个(20％)个体分别对bb，ba和bg圆形体应答。此外，9个(14％)，8个(12％)和7个(11％)个体分别对bb+ba，bb+bg和bb+ba+bg圆形体的组合应答。在65个(15％)个体中，24个(37％)个体对不同疏螺旋体菌株的组合应答，而41个(63％)个体对不同的疏螺旋体菌株应答。类似地，在图2c中进行进一步鉴定和评估了在图2a中仅对疏螺旋体的圆形体应答的71个(16％)个体。在71个个体中，4个(6％)，5个(7％)和30个(42％)个体分别对bb，ba和bg圆形体应答。此外，2个(3％)，16个(22％)，2个(3％)和12个(17％)个体分别对bb+ba，bb+bg，ba+bg和bb+ba+bg圆形体的组合应答。在71个个体中，32个(45％)个体对不同的疏螺旋体菌株的组合应答，而39个(55％)个体对不同的疏螺旋体菌株应答。在igm(图1c)和igg(图2c)中没有记录到针对ba+bg组合的免疫应答。显然，对个体疏螺旋体菌株的免疫应答的总数超过了对组合的疏螺旋体菌株的免疫应答的总数(在图1b，图1c，图2b和图2c中)。对个体疏螺旋体菌株的更高数量的免疫应答表明不同的疏螺旋体菌株之间不同表位的流行⁴³。从诊断工具中排除不同的疏螺旋体菌株可能会限制其敏感性⁴⁴。

图3显示了443个个体对一种或多种微生物抗原的igm(图3a)和igg(图3b)免疫应答，并评估了tbd中多种微生物状况的相关性。在全球范围内，医学界和诊断行业已经认识到多种疾病中的多种微生物感染，如麻疹，肺结核，肝炎，获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)等^12,55。然而，关于多种微生物感染的tbd诊断形式并没有改变⁴⁶。在图3a中，237个(53％)个体对多种微生物抗原应答，而53个(12％)个体对任何单一微生物抗原应答。同样，图3b确定344个(78％)个体对多种微生物抗原应答，而63个(14％)个体对任何单一微生物抗原应答。来自图3的关于tbd中多种微生物感染的实验证据，提出了tbd诊断领域必然的范式转变。当分别测试igm和igg时，其余153个(35％)和36个(8％)个体未对微生物抗原产生免疫。与应答单一微生物的个体相比，具有igm的个体对多种微生物应答(图3a)大约高5倍。类似地，在图3b中，与应答单一微生物的个体相比，对多种微生物应答的个体大约高6倍。对多种抗原(53％)的igm(图3a)应答表明免疫功能障碍可能是tbd个体中的常见现象¹⁷。此外，图3a和图3b表明，多种微生物感染可能是igg比igm更常见的现象。

图4和图5分别显示对个体微生物抗原的igm和igg免疫应答。与igm相比，igg中对每种个体抗原的免疫应答总数始终较高。与其各自的螺旋体菌株相比，对疏螺旋体的圆形体的免疫应答更高或相似。与疏螺旋体的螺旋体相比，对疏螺旋体的圆形体相当的免疫数量表明，疏螺旋体的圆形体有助于使疏螺旋体诊断工具的灵敏度最大化。数量为130个(29％)和64个(14％)的个体分别对狭义伯氏疏螺旋体b31进行igg和igm应答；162个(37％)和79个(18％)个体分别对埃氏疏螺旋体p12进行igg和igm应答；161个(36％)和94个(21％)个体分别对伽氏疏螺旋体fujip1进行igg和igm应答；158个(35％)和120个(27％)个体分别对狭义伯氏疏螺旋体b31圆形体进行igg和igm应答；164个(37％)和98个(22％)个体分别对埃氏疏螺旋体p12圆形体进行igg和igm应答；以及180个(41％)和83个(19％)个体分别对伽氏疏螺旋体fujip12圆形体进行igg和igm应答。

在图4和图5中，对除了疏螺旋体的螺旋体/圆形体之外的抗原的免疫应答表明，必须测试个体的继发性，共感染和自身免疫状况。针对igg和igm的免疫应答如下：125个(28％)和59个(13％)个体分别对汉氏巴尔通体应答；126个(28％)和74个(16％)个体分别对微小巴贝虫应答；115个(26％)和65个(15％)个体分别对沙眼衣原体应答；115个(26％)个体分别对肺炎衣原体应答；167个(38％)和122个(28％)个体分别对发酵支原体应答；137个(31％)和58个(13％)个体分别对肺炎支原体应答；115个(26％)和76个(17％)个体分别对柯萨奇病毒a16应答；150个(34％)和127个(29％)个体分别对巨细胞病毒应答；203个(46％)和68个(15％)个体分别对爱泼斯坦-巴尔病毒应答；122个(28％)和64个(14％)个体分别对流产布鲁氏菌应答；134个(30％)和104个(23％)个体分别对细小病毒b19apobod应答；142个(32％)和77个(17％)个体分别对查菲埃立克体应答；149个(34％)和71个(16％)个体分别对蜱传脑炎病毒应答；184个(47％)和146个(33％)个体分别对小株立克次体应答；以及36个(8％)和153个(35％)个体分别对20种抗原中的任何一种都不应答。

图6和图7显示了443个个体对其他微生物结合以下微生物的免疫应答的差异：疏螺旋体的螺旋体，疏螺旋体的圆形体，或疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合以及没有疏螺旋体。基本上，图6和图7示出了在有和无疏螺旋体的圆形体的情况下，对多种其他微生物的数量以及特异性对每种其他微生物的免疫应答频率的差异。据观察，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体倾向于不仅对多种其他微生物的数量，而且对特定的其他微生物应答更多。图6和图7表明，利用疏螺旋体的螺旋体，疏螺旋体的圆形体，共感染，继发感染和自身免疫抗原的诊断工具将为个体提供对tbd的完整且可靠的诊断。术语“其他微生物”包括共感染，继发性和自身免疫抗原，例如但不限于汉氏巴尔通体(b.henselae)，流产布鲁氏菌(b.abortus)，微小巴贝虫(b.microti)，查菲埃立克体(e.chaffeensis)，小株立克次体(r.akari)，蜱传脑炎病毒(tbev)，沙眼衣原体(c.trachomatis)，肺炎衣原体(c.pneumonia)，发酵支原体(m.fermentans)，肺炎支原体(m.pneumonia)，巨细胞病毒(cmv)，爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，柯萨奇病毒a16(cva16)和人类细小病毒b19(hb19v)。

在图6a和图7a中，443个个体中大约四分之一(26％)对非疏螺旋体的其他微生物应答。来自115个(26％)和118个(26％)个体的对非疏螺旋体的其他微生物的igm和igg免疫应答表明，也应当针对除疏螺旋体以外的微生物对个体进行筛选。此外，图6a和图7a显示个体仅对疏螺旋体以及其他微生物与疏螺旋体的免疫应答。据观察，与仅对疏螺旋体抗原应答的个体数量相比，对其他微生物与疏螺旋体应答的个体数量相当高。在图6a中，来自443个个体的10个(2％)，2个(1％)和5个(1％)个体分别对疏螺旋体的圆形体，疏螺旋体的螺旋体以及疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答。然而，在443个个体中，55个(12％)，13个(3％)和90个(20％)个体分别对疏螺旋体的圆形体，疏螺旋体的螺旋体以及疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合加上其他微生物应答。类似地，在图7a中，443个个体中的23个(5％)，2个(1％)和13个(3％)个体分别对疏螺旋体的圆形体，疏螺旋体的螺旋体以及疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答。但是，在443个个体中，48个(11％)，45个(10％)和158个(36％)个体分别对疏螺旋体的圆形体，疏螺旋体的螺旋体，以及疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合加上其他微生物应答。

在图6a和图7a中，与对疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的圆形体应答的个体更倾向于对其他微生物应答。然而，与对疏螺旋体的圆形体或疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体倾向于对其他微生物应答高约3倍。对于igm(图6a)，与对其他微生物和疏螺旋体的螺旋体应答的个体数量相比，对其他微生物和疏螺旋体的圆形体应答的个体数量大约高4倍。但是，对于igg(图7a)，对其他微生物和疏螺旋体的圆形体应答的个体数量与对其他微生物和疏螺旋体的螺旋体应答的个体数量略相似。在igm中，443个个体中的55个(12％)个体对其他微生物和疏螺旋体的圆形体应答，而13个(3％)个体对其他微生物和疏螺旋体的螺旋体应答(图6a)。类似地，48个(11％)个体对其他微生物和疏螺旋体的圆形体应答，而45个(10％)个体对其他微生物和疏螺旋体的螺旋体应答。

图6b和图7b显示了在有和无疏螺旋体的情况下，对其他微生物应答的个体的微生物负荷的差异。在两种抗体类别中，一开始，对其他微生物应答的个体(图6a和图7a)对超过八种微生物都无应答(图6b和7b)。然而，超过75％的对其他微生物应答的个体对三种以上的微生物无应答。在对其他微生物有igm应答的115个(26％)个体中(图6a)，92个(80％)个体对三种以上的微生物无应答。类似地，在对其他微生物有igg应答的118个(26％)个体中(图7a)，89个(75％)个体对三种以上的微生物无应答。有趣的是，与对疏螺旋体无任何应答的个体相比，对疏螺旋体应答的个体更倾向于对多种其他微生物应答(图6b和图7b)。

与对疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的圆形体有igm应答的个体更倾向于对多种其他微生物应答(图6b)。相反，与对疏螺旋体的圆形体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体有igg应答的个体更倾向于对多种其他微生物应答(图7b)。但是，与对疏螺旋体的圆形体或疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体总是更倾向于对多种微生物应答。超过50％的对其他微生物与疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体，对8到14种多种其他微生物应答。对其他微生物与疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合应答的个体的浓度在两种抗体类别的14种多种微生物中最高(图6b和图7b)。对其他微生物与疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合有igm应答的90个(20％)个体中(图6a)，14个(16％)个体对14种其他微生物应答(图6b)。类似地，对其他微生物与疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合有igg应答的158个(36％)个体中(图7a)，23个(15％)个体对14种其他微生物应答(图7b)。

图6c和图7c显示了在有和无疏螺旋体的情况下，443个体对单个其他微生物的免疫应答差异。在图6b和图7b中表现出最大量微生物负荷的疏螺旋体抗原也在图6c和图7c中也呈现出对单个其他微生物的最高免疫应答频率。从图6b和图7b中，疏螺旋体的圆形体和疏螺旋体的螺旋体分别在具有igm和igg的个体中表现出最大的微生物负荷。因此，与对疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的圆形体有igm应答的个体对所有其他微生物的应答平均高5倍(图6c)。此外，与对疏螺旋体的圆形体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体有igg应答的个体对所有其他微生物的应答平均高2倍(图7c)。然而，疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合在两种抗体类别中表现出最大量的微生物负荷(图6b和图7b)。因此，与对疏螺旋体的圆形体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合有igm应答的个体对所有其他微生物的应答高约3倍(图6c)。此外，与对疏螺旋体的螺旋体应答的个体相比，对疏螺旋体的螺旋体和圆形体的组合有igg应答的个体对所有其他微生物的应答高约5倍(图7c)。

测定内和测定间变化

本发明方法的测定内和测定间变化分别计算为4.6％和15.6％。

表1：本方法中使用的20种蜱传微生物抗原的列表

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序列表

<110>泰兹特有限公司

<120>用于检测生物样品中蜱传微生物的方法和固体支持物

<130>jyu3ep

<160>18

<170>bissap1.3

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>沙眼衣原体（chlamydiatrachomatis）

<400>1

metilepheaspthrthrleuasnprothrilealaglyalaglyasp

151015

val

<210>2

<211>22

<212>prt

<213>沙眼衣原体（chlamydiatrachomatis）

<400>2

metleualaglualaileleuaspvalthrleuasnprothrilegly

151015

lysalavalvalserlys

20

<210>3

<211>14

<212>prt

<213>肺炎衣原体（chlamydiapneumoniae）

<400>3

cyspheglyvallysglythrthrvalasnalaasngluleu

1510

<210>4

<211>12

<212>prt

<213>肺炎衣原体（chlamydiapneumoniae）

<400>4

cysglnileasnlysphelysserarglysalacys

1510

<210>5

<211>26

<212>prt

<213>发酵支原体（mycoplasmafermentans）

<400>5

metasnlyslyspheleulysleuglyserilealaglyileleuser

151015

phealaprovalalaileseralaglycys

2025

<210>6

<211>26

<212>prt

<213>发酵支原体（mycoplasmafermentans）

<400>6

phelysleualalysphegluasnasnlysprovalleuaspasppro

151015

ilevaltyrasnalagluvalserleuala

2025

<210>7

<211>8

<212>prt

<213>肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae）

<400>7

trpileglyasnglytyrargtyr

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae）

<400>8

phethraspphevallysproarg

15

<210>9

<211>18

<212>prt

<213>汉氏巴尔通体（bartonellahenselae）

<400>9

gluaspleuglnlysglnleulysglulysleuglulysseraspval

151015

argleu

<210>10

<211>7

<212>prt

<213>流产布鲁氏菌（brucellaabortus）

<400>10

thrthrserleulysthrphe

15

<210>11

<211>25

<212>prt

<213>微小巴贝虫（babesiamicroti）

<400>11

ilevalglupheasnalailepheserasnileaspleuasnasnser

151015

serthrvallysasngluileilelys

2025

<210>12

<211>30

<212>prt

<213>查菲埃立克体（ehrlichiachaffeensis）

<400>12

seralavalserasnarglysleuproleuglyglyvalleumetala

151015

leuvalalaalavalalaproilehisseralaleuleuala

202530

<210>13

<211>15

<212>prt

<213>人类柯萨奇病毒a16（humancoxsackievirusa16）

<400>13

tyrleuphelysthrasnproasntyrlysglyasnaspilelys

151015

<210>14

<211>24

<212>prt

<213>人类疱疹病毒4（humanherpesvirus4）

<400>14

alavalaspthrglyserglyglyglyglyglnprohisaspthrala

151015

proargglyalaarglyslysgln

20

<210>15

<211>30

<212>prt

<213>人类疱疹病毒4（humanherpesvirus4）

<400>15

serthralavalalaglnseralathrproservalserserserile

151015

serserleuargalaalathrserglyalathralaalaala

202530

<210>16

<211>38

<212>prt

<213>巨细胞病毒（cytomegalovirus）

<400>16

lysserglythrglyproglnproglyseralaglymetglyglyala

151015

lysthrproseraspalavalglnasnileleuglnlysileglulys

202530

ilelysasnthrgluglu

35

<210>17

<211>22

<212>prt

<213>蜱传脑炎病毒（tick-borneencephalitisvirus）

<400>17

serargcysthrhisleugluasnargaspphevalthrglythrgln

151015

glythrthrargvalthr

20

<210>18

<211>21

<212>prt

<213>蜱传脑炎病毒（tick-borneencephalitisvirus）

<400>18

asnaspleualaleuprotrplyshisgluglyalaglnasntrpasn

151015

asnalagluargcys

20