检测分析物的制作方法
本发明涉及用于检测分析物的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及通过使所述分析物与纳米粒子(例如二氧化硅纳米粒子)接触来检测分析物的方法和试剂盒。另外，本发明涉及包含纳米粒子的组合物以及含有所述组合物的产品。特别地，本发明涉及包含含量子点的纳米粒子的组合物，以及包含所述组合物的产品，所述产品例如电子显示器，太阳能电池和led灯。
背景技术：
免疫测定是用于检测大分子或小分子的存在或浓度的生化方法。在其最简单的形式中，免疫测定方法经由附着于标签或标记的抗原或抗体，通过将可检测的标签或标记与期望要检测的分析物缀合而起作用。通过使用抗体或抗原促进与分析物的结合，可以实现对特定分析物的高特异性。一旦标记的抗体或抗原与分析物结合，然后就可以通过许多机制检测它。可检测的标记或标签在性质上不同并且可以直接检测或可以产生再次可检测的信号或物种。标记/标签类型包括酶、放射性同位素、dna报告子、荧光报告子、电化学发光标签和其他物种。
酶联免疫吸附测定(elisa)由于其高可靠性和灵敏度，是实验室和临床分析中的主要分析方法之一。1它使用抗体和颜色变化来识别分析物并测量浓度。在常规的elisa中，分析物被一种第一抗体特异性捕获，然后结合到一种第二抗体，该第二抗体缀合有一种检测试剂，例如酶辣根过氧化物酶(hrp)，其伴随着加入底物(如3,3'，5,5'-四甲基联苯胺，tmb)最终产生一个单位的颜色变化，其强度用于定量。1然而，对于疾病早期阶段的疾病的诊断和仅以痕量存在的生物标志物的检测，通过这种检测方法的颜色变化可能低于检测限(lod)。因此，提高检测方法(如elisa)的灵敏度以在低于lod的超低浓度检测分析物对许多应用具有重要意义。
信号放大是提高各种检测方法灵敏度的关键。举例来说，近年来已经进行协同努力来扩增elisa信号。在各种策略中，使用酶负载的粒子来增加用于信号增强的酶量已成为一种有前途的方法。在先前的研究中，脂质体2，金纳米粒子，3,4聚合物5,6和二氧化硅纳米粒子7,8用作酶负载的基质。报道了通过将酶固定在聚合物涂覆的二氧化硅中灵敏度提高267倍，这比使用相似尺寸的二氧化硅纳米粒子的类似免疫测定系统更高。5
这些策略中的许多依赖于设计用于容纳多种标记的粒子，所述的标记例如是在单个粒子上的在elisa测定中使用的辣根过氧化物酶(hrp)酶或量子点。当这些单个粒子与抗体或抗原缀合时，分析物对接因此将分析物与多种标记物种相连，产生更强的可检测信号，从而降低检测限。
这些策略中的一些使用固体粒子，其表面上装载有许多标记物种。通过增加主体粒子的尺寸来增强信号放大，因为较大的粒子表面积为标记附着提供了更多的区域。然而，该策略具有显著的局限性，因为较大的粒子可能引入空间位阻问题，其中大尺寸的缀合物可能降低其与固体支持物对接的能力，从而降低其可检测性。
在elisa中使用富含酶的纳米粒子具有优点和潜在的缺点。虽然增加的酶浓度有利于信号放大，但酶活性也在elisa的增强中起重要作用，其通过固定化酶的内在生物活性和酶与底物分子之间的显色反应效力来确定。9许多努力已经致力于增强通过各种方法固定的酶的内在活性。5,7例如，物理吸附10,11用于负载对其活性影响很小的酶，但负载能力相对较低，并且可能在测试期间引起酶释放。此外，化学结合用于实现稳定的酶固定化，同时导致酶活性的轻微降低。5然而，很少报道纳米粒子结构对酶-底物反应的影响。底物需要扩散到负载酶的粒子中以反应并产生信号。在这方面，底物容易进入负载酶的纳米粒子可能有利于提高检测灵敏度。
介孔二氧化硅纳米粒子(msn)由于其大的表面积，高的孔容积，可协调的孔径大小和可调整的表面化学性质，在蛋白质/药物递送中引起了极大的关注。12,13已经使用几种msn通过化学结合来固定酶以进行信号放大，但是由于小的孔径大小，酶被负载到粒子的外表面上，这限制了负载量并导致酶活性的部分丧失。7,14在一些其他研究中，hrp通过物理吸附负载msn，并且随着扩大的孔径大小观察到增加的负载量。10,11尽管进行了这些尝试，但所得到的信号放大效果相当不大。
在使用荧光标记的基于标记的免疫测定方法的情况下，使用多密度或高密度标记方法时由于猝灭效应可能出现另外的挑战。在纳米粒子或其他宿主上的其空间定位未得到良好控制的单个荧光标记可以容易地彼此猝灭，导致产生人为的低信号。
因此，仍然需要通过使用显著增强其信号放大的纳米粒子来检测分析物的改进方法。
量子点增强型液晶显示器(lcd)使用量子点(qd)来促进电子信息的显示。在这方面，单层qd通常由来自一系列蓝色led的光照射，以便为显示图像的lcd面板产生高质量/亮度白光。概括地说，qd层包含两种类型的qd，一种类型发射红光，而另一种类型在蓝光照射下发射绿光。然后，通常由来自led的蓝光提供用于lcd的蓝光，其简单地穿过层，使得红色、绿色和蓝色(rgb)一起存在以产生白光。
这种显示器的一个常见问题是在传统设计中只能使用单层qd，因为如果qd太紧密地封装在一起，它们会相互猝灭，从而导致向lcd发射质量差的光。另外，单层qd在捕获来自蓝色发光二极管(led)的光时通常不是非常有效，因此led必须随后输出相对强的光以提供足够的光以通过qd层照亮lcd面板。例如，这可能产生过多的热量，增加显示器的功耗并缩短显示器的寿命。
qd的这个问题对于诸如移动电话和便携式电脑的电池供电设备尤其相关。在这些设备中，显示器消耗电池中的高比例能量，因此较低功耗的显示器可以显著延长电池寿命。对于使用qd的led灯，可以进行类似的论证。
因此，仍然需要通过捕获更大比例的由led发射的光并将其转换为用于lcd的发射光来提高这种qd层的效率，从而允许更低的功率，更节能和/或寿命更长的显示器。
技术实现要素：
本发明涉及用于检测分析物的方法和试剂盒。另外，本发明涉及包含含量子点的纳米粒子的组合物和含有该组合物的产品。
在第一方面，本发明提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，包括使所述分析物与纳米粒子接触以促进与其结合的步骤，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；
(iii)用于结合分析物的结合剂；和
(iv)固定在所述孔内的检测试剂；
从而检测所述分析物。
适当地，本方面的方法还包括从检测试剂产生报告信号的步骤。在特定实施方案中，产生报告信号的步骤包括使检测试剂与底物接触，以便于从中产生所述报告信号。在其他实施方案中，产生报告信号的步骤包括使检测试剂与电磁辐射接触，以便于从中产生所述报告信号。在一个实施方案中，本方面的方法还包括检测报告信号的步骤。
在第二方面，本发明提供诊断试剂盒，其包含：(i)用于检测分析物的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；
(iii)用于结合分析物的结合剂；
(iv)固定在所述孔内的检测试剂；以及
(v)使用说明书。
在一个实施方案中，第一和第二方面的纳米粒子是金属或准金属纳米粒子。
合适地，金属或准金属纳米粒子是金属或准金属氧化物纳米粒子。
在实施方案中，纳米粒子的金属或准金属选自由下述形成的组：锌，锆，二氧化硅，钛，锡，铝，铈，铜，铟，镁，镍和铁。
这些金属和准金属可以在第一和第二方面的纳米粒子中以其任何一种或多种已知的氧化物形式存在。
优选地，第一和第二方面的纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。
关于第一和第二方面的发明，孔适当地基本上是圆锥形的或适当地由存在于从粒子核芯向外辐射出的树枝状尖锥阵列之间的孔隙组成。
适合地，对于第一和第二方面的发明，孔的平均孔径大小为约5nm至约50nm。优选地，孔的平均孔径大小约10nm至约20nm。
在第一和第二方面的本发明的一个实施方案中，纳米粒子的平均粒度为约50nm至约250nm。
关于前述方面的发明，结合剂合适地是抗体或其功能片段。
关于第一和第二方面的发明，检测试剂合适地是或包含生物发光剂，化学发光剂和/或荧光剂。在一个实施方案中，检测试剂是或包含量子点。在另一个实施方案中，检测试剂是或包含辣根过氧化物酶。
在第三方面，本发明提供了一种产生显示锚定基团的纳米粒子的方法，包括以下步骤：
(i)提供金属或准金属源；
(ii)在液体环境中使金属或准金属源与碱和任选的表面活性剂接触；
(iii)使步骤(ii)的产物与显示锚定基团的化合物接触；
从而产生显示锚定基团的纳米粒子。
优选地，纳米粒子选自对第一和第二方面所述的那些，因此相应地选择金属或准金属源。
在一个实施方案中，金属或准金属源是二氧化硅，显示锚定基团的化合物是显示锚定基团的硅酸酯。
在一个实施方案中，在步骤(ii)和(iii)之间提供至少5分钟的延迟时间，以便在引入锚定基团之前允许一定程度上形成二氧化硅纳米粒子。
在一个实施方案中，该方法还包括处理显示锚定基团的纳米粒子以除去剩余的表面活性剂模板的步骤。
除去表面活性剂可以通过酸处理。
在实施方案中，锚定基团选自由下述组成的组：硫醇、胺、羧基、聚乙二醇基团、碳链及其任何组合。
优选地，锚定基团是硫醇，且显示锚定基团的硅酸酯(silicate)是含硫醇的烷氧基硅烷。
在一个实施方案中，表面活性剂可以是季铵表面活性剂。
当源是二氧化硅源时，它可以是任何可水解的二氧化硅源，尽管优选烷基原硅酸酯，仅举例来说，包括teos和tmos。
在第四方面，本发明提供了一种组合物，其包含分散在基底中和/或基底上的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；和
(iii)固定在所述孔内的多个量子点。
合适地，纳米粒子是金属或准金属纳米粒子，例如金属或准金属氧化物纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子的金属或准金属选自如下组成的组：锌，锆，二氧化硅，钛，锡，铝，铈，铜，铟，镁，镍和铁。这些金属和准金属可以在本方面的纳米粒子中以其任何一种或多种已知的氧化物形式存在。
优选地，纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。
在一个实施方案中，孔适当地基本上是圆锥形或适当地由存在于从粒子核芯辐射出的树枝状尖锥阵列之间的孔隙组成。
合适地，孔的平均孔径大小为约5nm至约50nm。优选地，孔的平均孔径大小为约10nm至约20nm。
在一个实施方案中，纳米粒子的平均粒度为约100nm至约250nm。
适当地，多个量子点包括第一组量子点和第二组量子点，第一和第二组量子点适于吸收来自光源的第一光的第一部分以分别发射第二颜色的第二光和第三颜色的第三光，并且还被配置为透射第一光的第二部分。优选地，第一组量子点适于发射红光，且第二组量子点适于在被蓝光源激发时发射绿光。
在一个实施方案中，该组合物是或包括膜。
在一个实施方案中，将组合物密封在基本上透明的容器中。
适当地，基底基本上是透明的。
基底适当地选自由下述组成的组：聚合物，单体，树脂，粘合剂，玻璃，金属氧化物及其组合。
第五方面，本发明提供一种显示装置，包括：
(i)光源；
(ii)发光层，其包含第四方面的组合物,并光学上连接到光源；和
(iii)显示器，用于至少部分地接收从发光层发射的光。
适当地，光源是蓝色光源或包括蓝色光源。优选地，光源是蓝色led或包括蓝色led。
在一个实施方案中，显示器是或包括液晶模块。
第六方面，本发明提供一种发光二极管装置，包括：
(i)阴极；
(ii)阴极上的电子传输层；
(iii)在电子传输层上形成的发光层，其中发光层包含第四方面的组合物；
(iv)发光层上的空穴传输层；和
(v)在空穴传输层上形成的阳极。
第七方面，本发明提供一种太阳能电池，包括：
(i)电子导体层；和
(ii)电子发射层，其包含第四方面的组合物，并与电子导体层连接。
第八方面，本发明提供一种发光方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含第四方面的任一组合物的发光层；和
(ii)用能够被其中的一个或多个量子点吸收的频率的电磁辐射激发发光层；
从而发光。
在一个实施方案中，该方面的方法还包括通过显示器接收发射光的步骤。
在第九方面，本发明提供一种发射电子的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含第四方面的任一的组合物的电子发射层；和
(ii)用适合于被其中的一个或多个量子点吸收的频率的电磁辐射激发电子发射层；
从而发射电子。
在一个实施方案中，该方面的方法还包括通过太阳能电池的电子导体层接收发射的电子的步骤。
在第十方面，本发明提供了一种用于产生其上固定有多个量子点的纳米粒子的方法，包括以下步骤：
(i)提供金属或准金属源；
(ii)在液体环境中使金属或准金属源与碱和任选的表面活性剂接触；
(iii)使步骤(ii)的产物与显示锚定基团的化合物接触；
(iv)使步骤(iii)的产物与所述量子点接触；
从而产生其上固定有多个量子点的纳米粒子。
在一个实施方案中，金属或准金属源是二氧化硅源，且显示锚定基团的化合物是显示锚定基团的硅酸酯。
合适地，锚定基团选自硫醇、胺、羧基、聚乙二醇基团、碳链及其任何组合。优选地，锚定基团是硫醇，且显示锚定基团的硅酸酯是含硫醇的烷氧基硅烷。
在一个实施方案中，该方面的方法还包括将步骤(iv)的产物分散在基底中和/或基底上的步骤。
如本文所使用的，除非上下文另有要求，否则术语“包括”和术语的变体，例如“包括(comprising)”，“包括(comprises)”和“包含(comprised)”，并不旨在排除其他元件，组件，整数或步骤，但是可以包括一个或多个未说明的其他元素，组件，整数或步骤。
应当理解，不定冠词“一(a)”和“一个(an)”不应理解为单数不定冠词或以其他方式排除大于一个或多个不定冠词所涉及的单个主题。例如，“一个(a)”孔包括一个孔，一个或多个孔和多个孔。
附图的简单说明
图1.(a)传统夹层样elisa与(b)elisa+的比较，所述
(b)elisa+使用具有高hrp负载和可接近的树突通道的设计的介孔二氧化硅纳米粒子(dmsn)来实现超灵敏检测。
图2.(a)透射电子显微镜(tem)和(b)dmsn-2的扫描电子显微镜(sem)图像。箭头显示开放的孔通道。
图3.使用tmb/h2o2作为底物，通过终点法测定固定化hrp相对于游离hrp的活性。将结果标准化为hrp浓度。
图4.基于不同胰岛素浓度的dmsn的商业elisa和elisa+的od值。x轴上的数字(1,1/10,1/100,1/1000和1/2000)代表lodc的胰岛素稀释倍数(商业elisa试剂盒的检测限)。包括仅含有dmsns-h-a且不添加胰岛素的对照组，并且在1个lod浓度组中dmsn-1-h-a，dmsn-2-h-a和dmsn-3-h-a的值分别显示为粉红色，绿色和紫色条。
图5.标准曲线显示elisa+的定量范围。
图6.显示hrp固定机制的图示。
图7.(a)dmsn-1，(c)dmsn-2，(e)dmsn-3的tem图像；以及氨基改性的(b)dmsn-1-nh2，(d)dmsn-2-nh2，(f)dmsn-3-nh2。比例尺：100纳米。
图8.(a)dmsn-1，(b)dmsn-2，(c)dmsn-3和氨基改性的(d)dmsn-1-nh2，(e)dmsn-2-nh2，(f)dmsn-3-nh2的氮吸附-解吸等温线和孔径大小分布。
图9.tem显微照片显示掺入硫醇锚定基团的二氧化硅纳米粒子，其中二氧化硅纳米粒子具有径向树枝状结构，二氧化硅尖锥从核芯辐射出来。
图10.本发明的显示装置的实施例。
图11.实施例4的单分散介孔二氧化硅纳米粒子的tem图像(a-b)，sem图像(c)，n2吸附/解吸等温线(d)和相应的孔径大小分布(插图)。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：具有易于接近的径向孔通道的特别设计的介孔二氧化硅纳米粒子在分析物检测测定中导致显著的信号放大。不受任何理论的束缚，提出大而开放的径向通道允许超高检测试剂负载并且进一步提供易于进入的空间，用于底物分子与这种检测试剂反应，其中这些反应是分析物检测过程的一部分。在检测试剂是或包含荧光团的其他情况下，大且开放的孔结构可能有助于将荧光团容易地负载到粒子中并且在孔壁上适当地不受限制地布置，从而使猝灭最小化。
另外，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：具有固定在易于接近的径向孔通道内的量子点的特别设计的介孔二氧化硅纳米粒子可导致产品所述产品例如电子显示器中的显著信号放大，led和太阳能电池。不受任何理论的束缚，提出大的和开放的孔结构可能有助于容易地将量子点负载到粒子中并且在孔的壁上适当地不受限制地布置，从而使猝灭最小化。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，包括使所述分析物与纳米粒子接触以促进与其结合的步骤，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；
(iii)用于结合分析物的结合剂；和
(iv)固定在所述孔内的检测试剂；
从而检测所述分析物。
如本文通常使用的，“分析物”是指分子，通常是小分子或大分子，例如多核苷酸或多肽，其存在，量和/或特性将被检测或确定。分析物被纳米粒子的特定结合剂识别，从而形成分析物/纳米粒子对。可以使用本发明的方法检测可以使用免疫测定方法检测的任何分析物。
在各种实施方案中，分析物是或包括但不限于蛋白质，多肽，抗体，寡核苷酸，多糖，无机磷酸盐，atp，gtp，utp，ctp，adp，gdp，cgmp，camp，coa，fad，fmn，fadp，nadh，nadph，硫醇，谷胱甘肽，肌酸酐，肌酸，过氧化氢，活性氧或一氧化氮。
应理解，术语“纳米粒子”是指亚微米尺寸的粒子。本发明的纳米粒子可包含任何合适的材料或组合物，其提供用于装载检测试剂的刚性、稳定的粒子，并且在免疫测定的环境中是稳定的，如本领域中已知的。
在一个实施方案中，第一和第二方面的纳米粒子是金属或准金属纳米粒子，例如锌，锆，二氧化硅，钛，锡，铝，铈，铜，铟，镁，镍，铁及其任何组合。合适地，金属或准金属纳米粒子是金属或准金属氧化物纳米粒子。这些金属和准金属可以以其任何一种或多种已知的氧化物形式存在于本发明的纳米粒子内。
可以使用的示例性组合物包括但不限于硅氧化物，例如二氧化硅，钛氧化物，例如二氧化钛，铝氧化物，例如氧化铝，氧化铟锡(ito)，氟掺杂的氧化锡(fto)，锆氧化物，例如氧化锆和氧化铈，例如二氧化铈，以及它们的组合。
在优选的实施方案中，本发明的纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。“二氧化硅纳米粒子”是指包含二氧化硅或二氧化硅(即sio2)的纳米粒子。这包括基本上或完全由二氧化硅构成的纳米粒子，以及包含其他无机(例如金属氧化物)或有机组分的那些二氧化硅纳米粒子。
合适地，纳米粒子的孔(例如一个或多个孔)基本上为圆锥形或锥形，或者基本上由孔隙组成，孔隙由从粒子核芯向外辐射出的树枝状尖锥阵列之间的空间产生。在这方面，本领域技术人员将理解孔可以由从核芯辐射出的树枝状尖锥阵列之间的空间限定。
显而易见的是，本文所用的术语“锥形”包括圆锥形，截头圆锥形或任何其他类似的轴对称形式。在其他实施方案中，纳米粒子的孔(包括一个或多个孔)基本上是圆柱形的。显而易见的是，本发明包括上述形状的不规则或非完美形式。
在特定实施方案中，本文描述的纳米粒子是介孔纳米粒子。介孔材料通常定义为平均孔径大小或直径为2nm至50nm的天然或合成材料(即，在限定微孔和大孔材料的那些孔径大小之间)。
孔径大小可通过本领域已知的任何方法测量。优选地，孔径大小的值是整个目标纳米粒子中存在的各个孔径大小的混合值或平均值。这可以例如通过氮吸附方法和应用本领域公知的barrett-joyner-halenda(bjh)模型来确定。
因此，本发明的纳米粒子可具有约2nm至约50nm的平均孔径大小，或其中的任何范围，例如但不限于约5nm至约40nm，或约10nm至约30nm。在本发明的特定实施方案中，纳米粒子的平均孔径大小为约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm或其中的任何范围。在本发明的某些实施方案中，纳米粒子的平均孔径大小为约5nm至约50nm。在一个优选的实施方案中，纳米粒子的平均孔径大小为约10nm至约20nm。
关于本文所述的上述纳米粒子的孔径大小和形状，推测这种设计不仅提供了可用于检测试剂负载在其上的显著大的表面积，而且还提供将检测试剂容易负载进入多孔结构中并且容易进入孔通道，以用于底物分子与这些检测试剂反应。因此，提出在本文中证明的分析物检测测定中的显著信号放大至少部分地是这种孔设计的功能。
本领域技术人员将理解，孔径大小在某种程度上可以通过固定在其中的特定检测试剂来确定。举例来说，较大的检测试剂和/或底物通常需要较大的孔径大小。另外，较大的孔径大小可以允许通过其底物更容易地接近检测试剂。因此，纳米粒子的平均孔径大小可以随着固定在其中的特定检测试剂(例如，量子点，放射性试剂，辣根过氧化物酶等)而变化。
包括二氧化硅纳米粒子的纳米粒子，具有平均粒度，其是指粒子的平均最长尺寸，其例如可以是不大于1000纳米，不大于500纳米，不大于200纳米，不大于超过100纳米，不大于75纳米，不大于50纳米，不大于40纳米，不大于25纳米，或不大于20纳米。平均粒度通常使用透射电子显微镜确定，但也可以使用各种光散射方法(例如，激光衍射)。平均粒度通常是指非团聚和/或非聚集的单个纳米粒子的平均尺寸。
本发明的纳米粒子可具有约50nm至约800nm的平均粒度，或其中的任何范围，例如但不限于约60nm至约400nm，或约80nm至约250nm。在本发明的特定实施方案中，纳米粒子的平均粒度为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、770nm、780nm、790nm、800nm、或其中的任何范围。在本发明的某些实施方案中，纳米粒子的平均粒度为约50nm至约250nm。
关于粒度，本领域技术人员应当理解，当为特定应用设计纳米粒子时，需要在适当尺寸的负载表面之间找到微妙的平衡以最大化其上负载的检测试剂的量(即，粒度和/或孔径大小的增加)和足够小的粒子体积以便保持悬浮在溶液中并形成具有可接受的扩散动力学(即，粒度减小)的分析物-纳米粒子复合物。因此，纳米粒子的平均粒度可以随着其使用的特定应用(例如，elisa，免疫荧光等)而变化。
本发明的纳米粒子适当地表现出高度的单分散性(即，基本上均匀的粒度)，以便在检测给定量的分析物时产生一致的信号强度。为了确保可靠和一致的检测，有利的是具有紧密的粒度分布，并因此使每个纳米粒子上存在的检测试剂物质的数量高度均匀，以产生均匀的信号强度。
适当地，通过动态光散射(dls)测量的本发明纳米粒子的多分散指数(pdi)小于或等于约0.2。在本发明的特定实施方案中，通过动态光散射(dls)测量的本发明纳米粒子的多分散指数(pdi)为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20或其中的任何范围。
在特定实施方案中，纳米粒子基本上是球形的。应当理解，术语“球形”是指圆形体，其表面在各方面与中心等距。
如本文通常使用的术语“结合剂”是指能够使用特定的分子间相互作用结合分析物的分子。举例来说，结合剂可在其表面或腔上具有结构域，其特异性结合并因此与分析物的特定空间和极性组织互补。结合剂的非限制性实例可包括抗体，受体和配体。
在一个实施方案中，结合剂是结合所讨论的分析物的抗体或抗体片段。优选地，抗体是单克隆抗体或其片段。
如本文所用，“抗体”是或包含免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”包括哺乳动物免疫球蛋白基因复合物的任何抗原结合蛋白产物，包括免疫球蛋白同种型iga，igd，igm，igg和ige及其抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”包括嵌合或人源化的免疫球蛋白，或者另外包含改变的或变体的氨基酸残基，序列和/或糖基化的免疫球蛋白，无论是天然存在的还是通过人为干预(例如通过重组dna技术)产生的。
抗体片段包括fab和fab'2片段，demibodies，双抗体和单链抗体片段(例如scv)，但不限于此。通常，抗体包含各自的轻链和重链可变区，每个可变区包含cdr1,2和3个氨基酸序列。优选的抗体片段包含至少一个轻链可变区cdr和/或至少一个重链可变区cdr。
抗体和抗体片段可以是多克隆的或优选是单克隆的。单克隆抗体可以使用标准方法产生，例如在
本领域技术人员将理解，由于其相对大的尺寸和亲水性，单克隆抗体通常不会适合和/或固定在本文所述的纳米粒子的孔内，因此通常附着于其外表面。
如本文所用的术语“检测试剂”是指通过本领域已知的许多检测技术和/或科技之一可检测的或产生可检测信号或物质的任何分子、化合物或材料，所述技术或科技例如光学(例如，荧光，化学发光，生物发光，比色)，电学，磁，光谱，光化学，放射化学，放射学，生物化学，免疫化学或化学方法。因此，检测试剂合适地是或包含标签。
多种分子、化合物或材料可用作检测试剂。检测试剂的非限制性实例包括荧光剂，酶，辅基，发光剂，化学发光剂，生物发光剂，荧光发射金属原子(例如铕(eu))，放射性同位素，电子致密试剂和半抗原(例如地高辛配基)。
非限制性示例性荧光检测试剂或荧光团包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，绿色，蓝色或红色荧光蛋白，量子点，伞形酮，二氯三嗪基胺荧光素等。发光检测试剂可包括能够适当氧化例如鲁米诺的那些催化剂或酶(例如hrp)中的任何一种，并且生物发光检测试剂可包括例如荧光素酶，荧光素和水母荧光素。
在特定实施方案中，检测试剂是或包含荧光剂和/或发光剂。在一些特定实施方案中，发光剂是化学发光剂或生物发光剂。
在一个特别优选的实施方案中，检测试剂是或包含量子点。量子点通常被理解为包含粒径为100nm或更小的半导体晶体粒子，其具有源自量子限制效应的特定发射性质。量子点通常具有约1nm至约10nm的粒径，并且其发射波长可通过改变粒径来控制。
优选地，多个量子点的平均粒径的范围为约1至约100nm。在某些实施方案中，量子点的平均粒度的范围为约1至约20nm(比如，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20nm或其中的任何范围)。在某些实施方案中，量子点的平均粒度的范围为约1nm至约20nm或约1nm至约10nm。量子点的平均直径可小于约150埃
量子点可具有各种形状，包括但不限于球形，棒形，圆盘形，其他形状以及各种形状粒子的混合物。可以选择量子点的特定组成，结构和/或尺寸，以在用特定激发源刺激时实现从量子点发射的所需波长的光。本质上，可以调整量子点以通过改变它们的尺寸在可见光谱上发光。量子点的窄fwhm可导致饱和的颜色发射。
量子点可包括一种或多种半导体材料。可包括在量子点(包括例如半导体纳米晶体)中的半导体材料的实例包括但不限于iv族元素，ii-vi族化合物，ii-v族化合物，iii族-vi化合物，iii-v族化合物，iv-vi族化合物，i-iii-vi族化合物，ii-iv-vi族化合物，ii-iv-v族化合物，包括上述任意一种的合金，和/或包括上述任意一种的混合物，包括三元和四元混合物或合金。非限制性实例列表包括zno,zns,znse,znte,cdo,cds,cdse,cdte,mgs,mgse,gaas,gan,gap,gase,gasb,hgo,hgs,hgse,hgte,inas,inn,inp,insb,alas,a1n,a1p,alsb,tin,tip,tias,tisb,pbo,pbs,pbse,pbte,ge,si,包括上述任意一种的合金，和/或包括上述任意一种的混合物，包括三元和四元混合物或合金。
在某些实施方案中，量子点可包含含有一种或多种半导体材料的核和含有一种或多种半导体材料的壳，其中壳设置在核的外表面的至少一部分，优选全部。包括核和壳的量子点也称为“核/壳”结构。
壳可以是具有与核的组成相同或不同的组成的半导体材料。壳可以包括外涂层，该外涂层在核的表面上包括一种或多种半导体材料。可包括在壳中的半导体材料的实例包括但不限于iv族元素，ii-vi族化合物，ii-v族化合物，iii-vi族化合物，iii-v族化合物，iv-vi族化合物，i-iii-vi族化合物，ii-iv-vi族化合物，ii-iv-v族化合物，包括上述任意一种的合金，和/或包括上述任意一种的混合物，包括三元和四元混合物或合金。实例包括但不限于zno,zns,znse,znte,cdo,cds,cdse,cdte,mgs,mgse,gaas,gan,gap,gase,gasb,hgo,hgs,hgse,hgte,inas,inn,inp,insb,alas,a1n,a1p,alsb,tin,tip,tias,tisb,pbo,pbs,pbse,pbte,ge,si,包括上述任意一种的合金，和/或包括上述任意一种的混合物。例如，zns、znse或cds外涂层可以在cdse或cdte半导体纳米晶体上生长。
在核/壳量子点中，壳或外涂层可包括一个或多个层。外涂层可包含至少一种与核的组成相同或不同的半导体材料。优选地，外涂层具有约1至约10个单层的厚度。外涂层也可具有大于10个单层的厚度。在某些实施方案中，可以在核上包括一种以上的外涂层。在某些实施方案中，周围的“壳”材料可以具有大于核材料的带隙的带隙。
在某些其他实施方案中，周围的壳材料可以具有小于核材料的带隙的带隙。
在某些实施方案中，可以选择壳以使其原子间距接近“核”底物的原子间距。在某些其他实施方案中，壳和核材料可具有相同的晶体结构。
制造量子点的方法在本领域中是已知的。制造量子点的方法的一个实例是胶体生长过程。通过将m供体和x供体注射到热配位溶剂中发生胶体生长。制备单分散量子点的优选方法的一个实例包括将有机金属试剂(例如二甲基镉)热解，注入热的配位溶剂中。这允许离散成核并导致宏观量的量子点的受控生长。注射产生可以以受控方式生长以形成量子点的核。可以温和地加热反应混合物以使量子点生长和退火。样品中量子点的平均尺寸和尺寸分布均取决于生长温度。保持稳定生长的生长温度增加(平均晶体尺寸的增加)。产生的量子点是量子点群的成员。由于离散成核和受控生长，可以获得的量子点群具有窄的单分散直径分布。直径的单分散分布也可称为“尺寸”。
可以通过调整qd的尺寸，改变结构或添加其他材料来实现qd的发射的增强或猝灭。猝灭可能有助于提高光效。更高的效率意味着，例如，当使用相同的光源时，从红色qd和绿色qd将产生更多的红光或绿光。例如，当qd彼此粘连时，红色qd粘在绿色qd上，红色qd可能会被绿色qd重新激发，这可能会增加红光的光效率，但可能会减少绿光的光效率。因此，希望qd在矩阵中彼此分离。考虑到本文所述的纳米粒子的孔和孔径大小的排列，固定在其上的qd不太可能彼此粘附，因此这种布置可以提高光效率。因此，可以最小化猝灭以降低制造成本。
待固定在本文所述的纳米粒子上的qd优选基于所需的峰值发射波长或用于所述纳米粒子的特定最终用途所需的波长组合来选择。当发射具有与特定实施方案中包括的其他量子点的峰值发射波长不同的光的量子点时，基于期望的光输出选择各自的量。相关领域的普通技术人员可以容易地做出这种确定。
检测试剂也可以是或包含可检测的酶或催化可检测物质形成的酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶等。这种酶通常能够通过转化其底物产生可检测的信号。应当理解，对于本发明，还可以考虑酶，例如，发光剂(即，化学发光剂和/或生物发光剂)，这取决于施加于其上的特定底物和随后由此产生的报告子信号。
本发明的纳米粒子也可以用辅基衍生化(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)。例如，纳米粒子可以用生物素衍生化并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合来检测。
检测试剂也可以是或包含放射性同位素，例如但不限于α-，β-或γ-发射体；或β-和γ-发射体。此类放射性同位素可包括但不限于碘(131i或125i)，钇(90y)，镥(177lu)，锕(225ac)，镨(142pr或143pr)，砹(211at)，铼(186re或187re)，铋(212bi或213bi)，铟(111in)，锝(99mtc)，磷(32p)，铑(188rh)，硫(35s)，碳(14c)，氚(3h)，铬(51cr)，氯(36cl)，钴(57co或58co)，铁(59fe)，硒(75se)和镓(67ga)。
适当地，本方面的方法还包括检测与所述分析物结合的纳米粒子的步骤。检测分析物，并且通过扩大、确定、评估、估计、测定或测量分析物的水平，可以通过本领域已知的能够检测结合其上的纳米粒子的特定检测试剂的任何技术来进行。
举例来说，检测可以包括流式细胞术，elisa，免疫印迹，免疫沉淀，原位杂交，免疫组织化学，免疫细胞化学，共聚焦显微镜，共聚焦扫描仪，比色检测，但不限于此。合适的技术可以适用于高通量和/或快速分析，例如使用蛋白质阵列，例如tissuemicroarraytm(tma)，msdmultiarraystm和多孔elisa，但不限于此。应当理解，待使用的检测方法可以至少部分地取决于纳米粒子的结合剂和/或检测试剂。
适当地，本方面的方法还包括从检测试剂产生报告信号的步骤。在某些实施方案中，产生报告信号的步骤包括使结合分析物的纳米粒子与检测试剂的底物接触，以便于从中产生报告信号。举例来说，当用可检测的酶功能化纳米粒子时，可以通过添加酶用于产生可检测的反应产物(即报告信号)的底物来检测纳米粒子。
例如，当检测试剂是辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺作为底物导致可检测的有色反应产物或报告信号。用于hrp的其他底物可包括2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(abts)，邻苯二胺二盐酸盐(opd)，鲁米诺和3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，但不限于此。碱性磷酸酶底物的非限制性实例包括对硝基苯磷酸酯(pnpp)，5-溴，4-氯，3-吲哚基磷酸酯(bcip)和硝基蓝四唑(nbt)。用于β-半乳糖苷酶底物的非限制性实例包括邻硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(bcig或x-gal)。
在某些其他实施方案中，产生报告信号的步骤包括使检测试剂与电磁辐射接触，以便于从中产生所述报告信号。在这方面，产生报告信号的步骤可以包括用例如合适波长的可见光或红外光激发检测试剂，使得检测试剂发荧光以产生可以随后检测的特定波长的光。举例来说，量子点可以被某些波长的光激发，然后发荧光，这样做，发射可以被检测到的光。
如本领域技术人员所理解的，本文所述的纳米粒子可以首先进行本领域公知的表面处理，并且例如如果需要，在本文中描述，以便将锚定基团应用于其中并且便于将检测试剂固定在其上。举例来说，这种表面处理可以导致添加选自氨基，硫醇基，羧基，聚乙二醇基，肽基及其任何组合的锚定基团。
应理解，该方法可以进一步包括检测由纳米粒子产生的报告信号的步骤。这可以通过本领域已知的任何方法进行，例如上文所述的方法。
在特定实施方案中，样品是或包含生物样品，例如取自患者或受试者的样品。为此，生物样品可包括来自受试者的组织(例如，活组织检查)，血液，血清，血浆，脑脊液，尿液或其他体液，或体液的滤液。在一个实施方案中，生物样品是、包含或获自非细胞来源。为此，生物样品可以是血清，血浆或脑脊髓液，但不限于此。
在一些实施方案中，可以使用用于检测分析物的方法，例如，以确定受试者是否具有感兴趣的特定疾病、障碍或病症，可以在“高通量”诊断测试或程序中进行，例如通过商业病理学实验室，在医疗点或医院。此外或可替代地，本方面的方法可用于确认特定疾病、障碍或病症的诊断，例如最初通过不同或替代诊断测试或程序检测到的疾病、障碍或病症。
在其他实施方案中，样品是或包含环境样品。本发明的该特定实施方案可以涉及获取室内样本，例如来自家庭，学校，商业建筑和工作场所，和/或室外样本。例如，为了检测和/或监测例如家庭环境中的毒素或过敏原水平，可以收集合适的样品粉尘。其他合适的样品可包括但不限于土壤，水，空气，食品或饮料。
另一方面，本发明提供诊断和/或筛选试剂盒，包括：
(a)用于检测分析物的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；
(iii)用于结合分析物的结合剂；和
(iv)固定在所述孔内的检测试剂；和
(b)使用说明书。
应理解，该方面的某些实施方案可用于检测和/或监测受试者中一种或多种分析物的水平。该方面的其他实施方案可用于检测和/或监测环境中一种或多种分析物的存在。
该方面的纳米粒子可以是如上所述的纳米粒子。优选地，纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。
试剂盒可以进一步包含另外的诊断试剂，例如用于检测试剂的底物(例如鲁米诺，abts或nbt)，如本领域和上文所述。粘合剂和/或检测试剂也可以如上所述。
适当地，本方面的试剂盒用于前面方面的方法。
在另一方面，本发明提供了一种产生显示锚定基团的纳米粒子的方法，包括以下步骤：
(i)提供金属或准金属源；
(ii)在液体环境中使金属或准金属源与碱和任选的表面活性剂接触；
(iii)使步骤(ii)的产物与显示锚定基团的化合物接触；
从而产生显示锚定基团的纳米粒子。
优选地，纳米粒子选自上文所述的那些，并因此相应地选择金属或准金属源。
在一个实施方案中，金属或准金属源是二氧化硅，和显示锚定基团的化合物是显示锚定基团的硅酸酯(silicate)。
在一个实施方案中，该方法还包括处理显示锚定基团的纳米粒子以除去剩余的表面活性剂模板的步骤。
在一个实施方案中，金属或准金属源在液体环境中与表面活性剂接触。在一个可替代的实施方案中，金属或准金属源在液体环境中不与表面活性剂接触。
除去表面活性剂可以通过酸处理。
在一个实施方案中，金属或准金属源进一步在液体环境中与醇接触。
合适地，锚定基团选自硫醇、胺、羧基、聚乙二醇基团、碳链及其任何组合。优选地，锚定基团是硫醇。在这方面，显示锚定基团的硅酸酯合适地是含硫醇的烷氧基硅烷，例如mptms(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷和mpdms(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷。
在一个实施方案中，表面活性剂可以是本领域熟知的季铵表面活性剂。在一个优选的实施方案中，表面活性剂是或包含烷基三甲基溴化铵，例如十六烷基三甲基溴化铵(ctab)。
在其中源是二氧化硅源的实施方案中，它可以是本领域已知的任何可水解二氧化硅源。在优选的实施方案中，可水解的二氧化硅源是或包含原硅酸烷基酯，例如teos和tmos。
合适地，该方面的二氧化硅纳米粒子是上文所述的。
在一个实施方案中，延迟时间为至少5分钟(例如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟和其中的任何范围)在步骤(ii)和(iii)之间提供，以允许在引入锚定基团之前二氧化硅纳米粒子在一定程度上形成。令人惊奇的是，已经发现在碱、表面活性剂和金属或准金属源结合的步骤和引入显示锚定基团的化合物的步骤之间，引入5分钟或更长的延迟允许在产生的纳米粒子中获得更高的硫醇含量。不希望受理论束缚，据信锚定基团化合物的延迟引入允许纳米粒子形成首先进行到没有任何锚定基团被引入的程度，以便随后引入锚定基团化合物在或者接近粒子孔的表面浓缩得到的锚定基团，与其中在表面处可能没有更高比例该基团的锚固基团更高内部化相反。在锚定基团是硫醇基团的情况下，可以实现通过chns元素分析测量的纳米粒子的1至10重量％范围内的硫含量。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含分散在基底中和/或基底上的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含：
(i)核芯；
(ii)从所述核芯径向延伸的孔；和
(iii)固定在所述孔内的多个量子点。
应当理解，本方面的量子点可以是如上所述的量子点。
合适地，该方面的纳米粒子是如上所述的纳米粒子。优选地，纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。
关于前述孔径大小和本文所述纳米粒子的形状，推测这种设计不仅提供了可用于其上qd负载的显著大的表面积，而且还提供了qd容易负载到多孔结构中。因此，提出电子显示器中的显著信号放大可以至少部分地是这种孔设计的功能。
对于本领域技术人员显而易见的是，孔径大小在某种程度上可以通过其中要固定的所需数量和/或特定qd来确定。举例来说，更多数量的qd和/或更大的qd通常需要更大的孔径大小。因此，纳米粒子的平均孔径大小可以随着待固定在其中的特定qd而变化。
关于粒度，本领域技术人员应当理解，当为特定应用设计纳米粒子时，需要在适当尺寸的负载表面之间找到微妙的平衡以最大化其上负载的qd的量(即，粒度和/或孔径大小的增加)和足够小的粒子体积，以便掺入在可接受尺寸的光学或显示层或容器内(即，粒度减小)。因此，纳米粒子的平均粒度可以随着其要使用的特定应用(例如，lcd、太阳能电池、led等)而变化。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子适当地表现出高度的单分散性(即，基本上均匀的粒度)，以便通过固定在其上的qd产生一致的信号强度(即发射光)。为了确保含qd的纳米粒子的可靠和一致的发射，有利的是具有紧密的粒度分布，并因此在每个纳米粒子上存在的qd数量的高度均匀性以产生均匀的信号强度。为此，本方面的纳米粒子的多分散指数(pdi)可以如上所述。
包含在本发明组合物中的含量子点的纳米粒子的总量优选范围为约0.01至约25重量％(例如，约0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25重量％)，以及它们之间的任何重量百分比。例如，对于各种应用，可能需要范围为约0.05重量％至约15重量％，或约0.05重量％至约5重量％的量。这些量意指是非限制性的。也可以确定这些范围之外的量是有用的。包含在组合物中的含量子点的纳米粒子的量可以基于特定的最终应用而变化。
在特定实施方案中，组合物可进一步包括一种或多种另外的组分或试剂，包括例如但不限于本领域已知的散射物质、触变胶和发射稳定剂中的一种或多种。
如全文所用，“分散的”包括在基底中和/或基底上的含qd的纳米粒子的均匀(即，基本上均匀)以及不均匀(即，基本上不均匀)的分布或放置。另外，如本文所述的含qd的纳米粒子可以使用任何合适的方法或者本领域技术人员已知的任何其他方法分散在基底中和/或基底上，例如基质材料，合适的方法例如有：将含qd的纳米粒子混合在聚合物中并浇铸膜；将含qd的纳米粒子与单体混合并将它们聚合在一起；将含qd的纳米粒子在溶胶-凝胶中混合。在特定实施方案中，含qd的纳米粒子被包封或包装在基底内。应注意，含qd的纳米粒子适当地均匀分布在整个组合物中，而在其他实施方案中，它们可根据应用特定的均匀性分布函数分布。另外，含qd的纳米粒子可以以单层或多层(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10...99,100等)厚的层进行排列。
本文描述的组合物可以是任何期望的尺寸，形状，构造和厚度。例如，组合物可以是层的形式，以及其他形状，例如圆盘，球体，立方体，块，管状构造等。虽然各种组合物可以是任何所需或所期望的厚度，合适的是，组合物的厚度约为100mm数量级(即，在一个维度上)，并且厚度低至小于约1mm，甚至厚度低至组合物中包含的特定纳米粒子的直径的数量级。在其他实施方案中，组合物可以是膜的形式，其厚度为例如10微米至100微米的数量级。
待固定在本文所述的纳米粒子上的qd优选基于所需的峰值发射波长或打算用于所述纳米粒子的特定最终用途所需的波长组合来选择。qd可以是如上所述的那些。
当量子点发射具有与特定实施方案中包括的其他量子点不同的峰值发射波长的光时，基于期望的光输出选择各个量子点的量。相关领域的普通技术人员可以容易地做出这样的决定。例如组合物中使用的具有不同峰值发射的量子点的比率由所使用的量子点的发射峰确定。例如，当在组合物中使用能够发射绿光的量子点和能够发射红光的量子点时，其中所述能够发射绿光的量子点具有峰值中心波长在约514nm至约540nm范围内和在其间无论是否重叠的任何波长，所述能够发射红光的量子点具有峰值中心波长在约615nm至约640nm范围内和在其间无论是否重叠的任何波长，发绿光量子点的重量百分比与发红光的量子点的重量百分比的比率可以在约12:1至约1:1的范围内(例如，约12:1，11:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1)，和在其间无论是否重叠的任何比例。
在本发明的某些实施方案中，多个量子点以红光的波长特征发光。在某些优选的实施方案中，能够发射红光的量子点发射的光具有发射峰值中心波长在约615nm至约635nm范围内和在其间无论是否重叠的任何波长。例如，量子点能够发射的红光具有峰值中心波长例如约630nm，约625nm，约620nm和/或约615nm。
在本发明的某些实施方案中，多个量子点以绿光特征的波长发光。在某些优选的实施方案中，能够发射绿光的量子点发射的光具有峰值中心波长在约520nm至约545nm范围内和在其间无论是否重叠的任何波长。例如，量子点能够发射的绿光具有峰值中心波长例如约520nm，约525nm，约535nm和/或约540nm。
如全文所用的，多个qd意指多于一个qd(即，2、3、4、5、10、100、1,000、1,000,000等qd)。所述组合物将适当地包含纳米粒子，所述纳米粒子包括具有相同组合物的qd，但在进一步的实施方案中，所述多种qd可以是各种不同的组合物。例如，qd可以全部以相同波长发射，或者在进一步的实施方案中，组合物可以包含具有以不同波长发射的qd的纳米粒子。
因此，在一个实施方案中，纳米粒子包括多个量子点，其包括至少一个能够发射红光的qd群和至少一个能够在被蓝光源激发时发射绿光的qd群。可以调节发光纳米晶体的波长和浓度以满足所需的光学性能。
如本文所用的，可见光是人眼可见的波长在约380和约780纳米之间的电磁辐射。可见光可以分为各种颜色的光谱，如红色，橙色，黄色，绿色，蓝色，靛蓝色和紫罗兰色。如本文所用，蓝光包括约435nm至约500nm之间的光，绿光包含约520nm至565nm之间的光，红光包含波长约625nm至约740nm之间的光。
基底可以是本领域已知的任何合适的材料。优选地，基底允许来自光源的光通过(即，基本上半透射或基本透射)。例如，在某些实施方案中，基底对通过量子点进行颜色转换的光优选为至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％是透射的。在某些实施方案中，基底对量子点发射的光优选为至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％是透射的。在特定实施方案中，基底包括对预定波长范围内的光是透射的材料。
可用于本文所述的本发明的各种实施方案和方面的基底的非限制性实例包括聚合物，单体，树脂，粘合剂，玻璃，金属氧化物和其他非聚合物材料。
优选的基底包括聚合物和非聚合物材料，其对电磁波谱的可见光和不可见光的预选波长(包括其范围)至少部分透射，并且优选完全透射。在某些实施方案中，预选波长可包括可见光(例如，400-700nm)，紫外(例如，10-400nm)和/或红外(例如，700nm-12μm)区域中的光的波长。优选的基底的实例包括但不限于玻璃或透明树脂。特别是从加工性的观点出发，合适地使用非固化性树脂，热固化性树脂或光固化性树脂等树脂。作为这种树脂的具体实例，可以是低聚物或聚合物的形式，三聚氰胺树脂、酚醛树脂、烷基树脂、环氧树脂、聚氨酯树脂、马来树脂、聚酰胺树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素，含有形成这些树脂的单体的共聚物等。
在特定的实施方案中，基底是或包含基质材料，例如聚合物基质。为此，合适的聚合物包括普通技术人员已知的可用于此目的的任何聚合物，包括聚合物材料，有机和无机氧化物。举例来说，基质材料可以是聚合物，例如聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、乙烯基树脂、聚丁二炔、聚亚苯基-亚乙烯基、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂、二氧化硅玻璃、硅胶、硅氧烷、多磷酸盐、水凝胶、琼脂糖、纤维素等。
在某些实施方案中，基底是柔性的。或者，基底可以是刚性的。
本文描述的组合物可以是层，密封剂，涂料，片材或薄膜。应当理解，在本文所述的实施方案中，其中提及层，聚合物层，基质，片材或薄膜，这些术语可互换使用，并且如此描述的实施方案不限于任何一种类型的组合物，而是包括任何一种本文所述或本领域已知的基底或层。
如本领域技术人员所理解的，本文所述的纳米粒子可以根据需要首先进行本领域公知的表面处理，以便在其上施加锚定基团并促进qd在其上的固定。举例来说，这种表面处理可以产生加入选自氨基，硫醇基，羧基，聚乙二醇基，肽基及其任何组合的锚定基团。
在某些实施方案中，含量子点的层可以密封在两个或更多个基底(例如第一基底和第二基底)之间。在这方面，优选基底的实例包括玻璃，聚碳酸酯，丙烯酸，石英，蓝宝石，聚合物材料如塑料或硅树脂(例如但不限于薄的丙烯酸，环氧树脂，聚碳酸酯，pen，pet，pe)。
在其他实施方案中，组合物可以包含在管状结构构件(例如，管，中空毛细管，中空纤维等)的中空容器或空腔部分中，其可以在任一端或两端开口。优选地，在将组合物包含在其中之后，对构件的开口端进行气密密封。密封技术的实例包括但不限于：(1)使管的开口端与环氧树脂接触，(2)由于固化树脂的收缩作用将环氧树脂拉入开口端，或(3)用玻璃粘附金属如玻璃粘附焊料或其他玻璃粘附材料覆盖开口端，(4)热胶；和(5)通过将玻璃加热到玻璃熔点以上并将壁夹在一起以封闭开口以形成熔融玻璃气密密封来熔化开口端。
在另一方面，本发明提供一种显示装置，包括：
(i)光源；
(ii)发光层，其包含上文所述的组合物，并光学上连接到光源；和
(iii)显示器。
在一个实施方案中，光源是或包括蓝色光源，例如蓝色led。
在一个实施方案中，该组合物是或包括膜。在另一个实施方案中，将组合物密封在基本上透明的容器中。优选地，基本上透明的容器对可见光和不可见光的预选波长(包括其范围)基本上是透射的，例如上面提供的那些。
在一个实施方案中，显示器是或包括液晶模块。
如本文所用，“光学上连接”是指将组件(例如光源和发光层)定位成使得光能够在没有实质干扰的情况下从一个组件传递到另一个组件。
在某些实施方案中，本文描述的显示装置适当地包括传统上存在于例如基于led的显示装置中的一个或多个附加元件。这些元件包括但不限于导光板，漫射器，水平增亮膜(bef)，垂直bef和反射器中的一个或多个。
适当地，这些元件的取向，它们的制造和在显示系统中的结合在本领域中是公知的。在实施方案中，本文提供了各种显示装置，其适用于许多数量的应用。如这里所使用的，“显示装置”是指允许在显示器上可视地表示数据等的元件的布置。合适的显示器包括各种平面，弯曲或其他形状的屏幕，薄膜，薄片或用于在视觉上向用户显示信息的其他结构。这里描述的显示装置可以包括在例如包括液晶显示器(lcd)，电视，计算机，移动电话，智能电话，个人数字助理(pda)，游戏设备，电子阅读设备，数码相机等的设备中。
图10中示出了本发明的显示装置200的示例性实施例。显示装置200包括光源202，导光板(lgp)204，包括本文所述的组合物的发光层206，以及lcd面板216。qd增强显示器200还可以可选地包括棱镜212和双增亮膜(dbef)214。光源202可以是蓝色发光二极管(led)或蓝色氮化镓(gan)led。
为了产生均匀照明，来自光源202的蓝光首先穿过lgp204，lgp204可包括一系列不均匀间隔的凸块或光提取特征(lightextractionfeatures)224和在光提取特征224后面的反射器218。lgp204将蓝光漫射通过一系列不均匀间隔的凸块或光提取特征224，如蓝光220所示。凸块或光提取特征的密度进一步远离光源202增加。lgp204的正面面向lcd面板216，并且lgp204的背面具有反射器218，反射器218以其它方式消耗光导向lcd面板216。在一个实例中，反射器218可以由高反射材料制成，例如白色聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，并且在一个实施方案中，反射作用在其表面的所有光的约97％。
lcd面板216还包括以子像素布置的滤色器，前偏光器，后偏光器和液晶以及电极，类似于本领域已知的传统lcd面板。通常，在lcd面板216和dbef214之间存在空气空间。
通常，发光层206被配置为从光源202透射蓝光220的一部分，使得白光222从发光层206出来。发光层206包括一组红色量子点(qd)208a和绿色qd208b，其通过量子点主动地将来自led的蓝光220转换成红光和绿光。当qd208a和208b被来自光源202的蓝光照射时，蓝光使qd208a和208b发光，从而产生二次光。二次光的颜色通常是qd208a和208b的尺寸，尺寸分布和组成的函数。
如图10所示，发光层206还包括其中设置有qd208a和208b的基底。基底允许来自光源202的光通过。
本领域技术人员将理解，qd增强显示器的配置可以变化。例如，可以使用其他点亮配置，包括在一些实施方案中的直接点亮配置。在替代实施方案中，棱镜212也可以被另外的亮度增强组件移除或替换。在另一个实施方案中可以移除dbef214。
在又一方面，本发明提供一种发光二极管装置，包括：
(i)阴极；
(ii)阴极上的电子传输层；
(iii)在电子传输层上形成的发光层，其中发光层包含上述组合物；
(iv)发光层上的空穴传输层；和
(v)在空穴传输层上形成的阳极。
应当理解，发光二极管(led)器件是半导体发光器件。与传统的白炽灯泡不同，传统的白炽灯泡通过用于加热灯丝的高电流来照亮，led仅需要低电流来发射等效光。led基于以下事实：在半导体材料中，当电子与空穴结合时，释放的能量以发光的形式显现。由于具有例如体积小、寿命长、驱动电压低、功耗低、响应快、抗冲击性好、单色性好的优点，因此led被广泛应用于各种电器等发光元件中。
在特定实施方案中，包含本发明的含qd的纳米粒子的发光层发射单一波长的光(例如，蓝色)。在替代实施方案中，发光层发射两种或更多种波长的光(即，第一光，第二光等)。在一个优选实施方案中，发光层在同一区域发射三种不同波长(例如，红色，蓝色和绿色)的光(即，第一光，第二光和第三光)；因此，与采用单独的led混合光的传统光源相比，该led通常表现出更好的显色指数。
在又一方面，本发明提供一种太阳能电池，
包括：
(i)电子导体层；和
(ii)电子发射层，其包含上文所述的组合物并与电子导体层连接。
关于太阳能电池，本领域技术人员将理解，太阳能电池理想地能够收集或捕获尽可能多的入射太阳光或能量并随后将其转换成电子。在这方面，显而易见的是，本文所述的含qd的纳米粒子可以被配置为基本上向入射光呈现致密的qd三维阵列，其充当紧密网以高效捕获入射光子并随后传输所产生的电子到电子导体层。
在优选的实施方案中，包含本发明的含qd的纳米粒子的电子发射层适于吸收两种或更多种波长的光。在一个特别优选的实施方案中，电子发射层适于基本上跨电磁波谱吸收光(例如，第一光，第二光，第三光等)。
因此，电子发射层优选含有两个或更多个组(即，2,3,4,5等)的量子点，其中每组量子点适于吸收电磁光谱的一部分内的光。举例来说，电子发射层可包括第一组量子点和第二组量子点，其中第一组量子点适于吸收电磁波谱的第一部分内的光和第二组量子点适于吸收电磁波谱的第二部分内的光。
对于本领域技术人员显而易见的是，电子导体层可以包括一种或多种合适的导电材料，其通常用于制造qd太阳能电池模块或组件，如本领域所熟知的。
在相关方面，本发明提供一种发光方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含上述组合物的发光层；和
(ii)用能够被其中的一个或多个量子点吸收的频率的电磁辐射激发发光层；
从而发光。
在一个实施方案中，本方面的方法还包括通过显示器接收发射光的步骤。
在特定实施方案中，发光层是显示装置的组成部分，例如lcd显示器。在其他实施方案中，发光层是led的组成部分，例如蓝色led。
在另一方面，本发明提供一种发射电子的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含上述组合物的电子发射层；和
(ii)用适合于被其中的一个或多个量子点吸收的频率的电磁辐射激发电子发射层；
从而发射电子。
在一个实施方案中，本方面的方法还包括通过太阳能电池的电子导体层接收发射的电子的步骤。因此，在特定实施方案中，电子发射层是太阳能电池的组成部分。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生其上固定有多个量子点的纳米粒子的方法，包括以下步骤：
(i)提供金属或准金属源；
(ii)在液体环境中使金属或准金属源与碱和任选的表面活性剂接触；
(iii)使步骤(ii)的产物与显示锚定基团的化合物接触；
(iv)使步骤(iii)的产物与所述量子点接触；
从而产生其上固定有多个量子点的纳米粒子。
优选地，纳米粒子选自上文所述的那些，因此相应地选择金属或准金属源。类似地，多个量子点适当地如上所述。
在一个实施方案中，金属或准金属源是二氧化硅源，且显示锚定基团的化合物是显示锚定基团的硅酸酯。
在一个实施方案中，该方法还包括处理显示锚定基团的纳米粒子以除去剩余的表面活性剂模板的步骤。
除去表面活性剂可以通过酸处理。
在一个实施方案中，金属或准金属源进一步在液体环境中与醇接触。
合适地，锚定基团选自硫醇、胺、羧基、聚乙二醇基团、碳链及其任何组合。优选地，锚定基团是硫醇。在这方面，显示锚定基团的硅酸酯合适地是含硫醇的烷氧基硅烷，例如mptms(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷和mpdms(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷。
在一个实施方案中，至少5分钟(例如，5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，50分钟，55分钟，60分钟，65分钟，70分钟，75分钟，80分钟，85分钟，90分钟和其中的任何范围)的延迟时间在步骤(ii)和(iii)之间提供，以允许在引入锚定基团之前二氧化硅纳米粒子在一定程度上形成。如前所述，令人惊讶地发现，在碱、表面活性剂和金属或准金属源结合的步骤和引入显示锚定基团的化合物的步骤之间，引入5分钟或更长的延迟允许在所得到的纳米粒子中获得更高的硫醇含量。因此，优选以这种方式执行本方法。
在一个实施方案中，金属或准金属源在液体环境中与表面活性剂接触。在一个替代的实施方案中，金属或准金属源在液体环境中不与表面活性剂接触。
在一个实施方案中，表面活性剂可以是本领域熟知的季铵表面活性剂。在一个优选的实施方案中，表面活性剂是或包含烷基三甲基溴化铵，例如c16tab。
在其中源是二氧化硅源的实施方案中，它可以是本领域已知的任何可水解二氧化硅源。在优选的实施方案中，可水解的二氧化硅源是或包含原硅酸烷基酯，例如teos和tmos。
在某些实施方案中，该方法还包括将步骤(iv)的产物分散在基底中和/或基底上的步骤，例如上文所述的基底。
合适地，该方面的二氧化硅纳米粒子是上文所述的。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施例，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不脱离本发明的范围的情况下，可以在示例的特定实施方案中进行各种修改和改变。
本文提及的所有计算机程序，算法，专利和科学文献均通过引用并入本文。
对本说明书中引用的出版物的任何引用并不是承认公开的内容构成了在是澳大利亚的公知常识。
为了更容易理解本发明并付诸实践，现在仅通过举例的方式描述其一个或多个优选实施例。
实施例
实施例1
在该实施例中，通过使用精心设计的介孔二氧化硅纳米粒子(dmsn)证明了通过信号放大具有2000倍灵敏度增强的超灵敏elisa(elisa+)的开发。dmsn具有容易进入的树突状孔通道(见图1)作为酶负载基质，用于检测超低浓度胰岛素，具有以下优点：(1)利用具有大表面积(484m2g-1)、高孔容积(1.39cm3g-1)和大的孔径大小(14.5nm)的dmsn实现超高酶负载以负载hrp。(2)大而开放的树突通道允许容易进入的空间以使底物分子与酶反应，这归因于超高活性。(3)利用超高hrp负载和易于接近的孔通道，与测试的商业elisa试剂盒相比，实现了血清中胰岛素检测灵敏度的2000倍增强。
材料和方法
化学制品
十六烷基三甲基氯化铵(ctac)溶液(25wt％在h2o中)，四乙基原硅酸酯(teos)，三乙醇胺(tea)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)，磷酸盐缓冲盐水(pbs)，戊二醛(50wt％在h2o中)，环己烷，氯苯，辣根过氧化物酶(hrp)和甲苯购自sigma-aldrich。豚鼠多克隆抗胰岛素抗体(第二抗体)从abcamaustraliaptyltd.订购。人胰岛素elisa试剂盒购自lifetechnologies(australiaptyltd)。所有化学品均未经纯化直接使用。用于所有实验的去离子水(di水)(18.2mvcm)从milli-q系统(millipore，bedford，ma)获得。
材料合成
dmsn-1的合成[15]：在100ml圆底烧瓶中，将24mlctac溶液(25wt％)，0.18gtea和36ml水混合并在60℃下搅拌1小时。然后，将4mlteos和16ml环己烷(20v/v％)混合并加入到溶液中。将溶液在150rpm(12小时)的搅拌速度下保持在60℃。在550℃下煅烧5小时后获得产物。
dmsn-2和3的合成[16]：在典型的合成中，将4.8mlctac(25％水溶液)，0.04gtea和7.2mlmilli-q水混合以形成水相并在60℃下搅拌1小时。然后将4ml预混油相(含有3.5ml氯苯和0.5mlteos)加入水相底部。将混合物在60℃，150rpm(12h)和500rpm(12h)的搅拌速度下搅拌，分别用于合成msn-2和msn-3。将固体样品以15000rpm离心15分钟并用乙醇洗涤三次。在最后的步骤中，在550℃下煅烧5小时后获得产物。
材料表征
通过micromeriticstristarii3020系统在77k下获得样品的氮吸附等温线。在测量之前，将裸/氨基改性的样品在100/80℃下真空脱气至少8小时。通过用于dmsn-2和3的barrett-joyner-halenda(bjh)方法和用于dmsn-1的密度泛函理论(dft)方法计算孔径大小分布[15]。通过使用典型的brunauer-eimmett-teller(bet)方法计算总孔容积和表面积。通过将样品分散在覆盖有碳膜的cu栅格上，用在100kv下操作的jeol1010显微镜直接拍摄tem图像。使用jeoljsm7800场发射扫描电子显微镜(fe-sem)在1kv下使用温和的bean模式获得sem图像。将样品分散在乙醇中，然后滴到铝箔片上并连接到导电碳带上。接下来，将样品在真空中在60℃下干燥12小时。使用来自malverninstruments的zetasizernano-zs在25℃下进行ζ电位测量。用shimadzuuv-2450双光束分光光度计测量uv-vis透射光谱。hrp和抗胰岛素的吸光度分别为401和278nm。
dmsn的氨基改性
将1g的dmsn分散在30ml的aptes(4mmol)甲苯溶液中，并在110℃下回流18小时。离心收集产物并用乙醇洗涤3次。将粉末在室温下干燥过夜。
hrp和第二抗体的固定化
hrp固定化方法根据以前的文献[7,14]进行了修改：将2mgdmsn悬浮于1mlpbs缓冲液(ph7.4)中，然后加入1ml2.5％戊二醛并将混合物在室内温度搅拌1小时。将混合物离心并用pbs洗涤3次以除去过量的试剂。在下一步中，将沉淀物用pbs重悬，并加入2mghrp。搅拌23小时后，将溶液离心并洗涤沉淀物以除去未结合的hrp。收集所有上清液用于uv测试以测量hrp浓度。将所得样品命名为dmsn-1-h，dmsn-2-h和dmsn-3-h。
第二抗体固定化方法根据以前的文献[7,14]进行了修改：用hrp固定6小时后，向溶液中加入1ml0.2mg/ml抗胰岛素并进一步搅拌17小时。将产物离心并洗涤以除去未结合的hrp和抗胰岛素。收集所有上清液用于uv测试以测量hrp和抗胰岛素的水平。将所得样品命名为dmsn-1-h-a，dmsn-2-h-a和dmsn-3-h-a。
固定化hrp的活性测量
通过使用tmb/h2o2作为底物进行固定化hrp的活性测量，并将结果与游离hrp进行比较。在具有不同hrp浓度(0-0.25ugml-1)的pbs中制备dmsns-h溶液。然后，在96孔微量培养板中将它们与tmb/h2o2(总体积为50μl)混合，并在25℃下孵育10分钟。然后，加入50μl的1mhcl以终止反应。用酶标仪在450nm读取光密度(o.d.)。
超灵敏elisa
新鲜制备具有超低浓度的标准胰岛素溶液(市售elisa试剂盒的lod的1～1/2000倍＝6.86～3.43×10-3pgml-1)。将它们从elisa试剂盒中的标准溶液中逐步稀释(在人血清中含有168pgml-1的胰岛素)。
通过简单地用功能化的dmsn-h-a替换抗胰岛素hrp，按照传统elisa试剂盒的说明书进行elisa+。通常，将50μl的每种标准品/对照/样品与50μl抗胰岛素hrp一起加入孔中。在室温下孵育30分钟。对于elisa+，使用50μl(4μgml-1)的官能化dmsn-h-a代替抗胰岛素hrp。彻底滗析液体，用稀释的洗涤溶液洗涤孔4次，然后加入100μl稳定的色原体。15分钟后，加入100μl终止溶液(1mhcl)并通过使用synergyht酶标仪在1小时内读取450nm处的吸光度来测量板。对于对照实验，使用pbs代替含有胰岛素的血清作为阴性对照。所有标准品/对照/样品均一式两份进行。
通过使用上述程序测试一系列低浓度(20-100fgml-1)的胰岛素样品，建立elisa+的标准曲线。为了测试回收率，将1μl胰岛素(1fg)掺入50μl(3fg)胰岛素标准溶液中，并且理论上它与4fg胰岛素一起成为样品x。然后，通过elisa+测试样品x并根据标准曲线计算。回收率是计算值与理论值(4fg)之间的差异。样品一式两份进行。
结果和讨论
dmsn的合成和表征
为了研究孔径大小对hrp负荷和elisa+灵敏度的影响，选择了三种结构相似但孔径大小不同的msn[15,16]。随着孔径大小增加，三种msn表示为dmsn-1(6.9nm)，dmsn-2(16nm)和dmsn-3(40nm)。进行氨基改性以在dmsn中接枝-nh2用于hrp固定(esm中的方案s1)，表明在官能化后维持三种dmsn的介孔结构。tem和sem用于表征dmsn的结构。图7中的tem图像显示了之前(图7(a，c，e)和之后(图7(b，d，f))氨基改性的dmsn的球形结构和孔通道。特别地，dmsn-2的开孔通道通过tem和sem图像显示在图2中。
进行氮吸附以评估dmsn的孔径大小。吸附-解吸图显示所有dmsn的iv型等温线(图8)。孔径大小分布对于dmsn-1通过密度泛函理论(dft)方法[15]和对于msn-2&3通过barrett-joyner-halenda(bjh)方法计算。与原始的相比，氨基改性的msn-1和2具有减小的孔径大小(dmsn-1：6.9至4.9nm；dmsn-2：16至14.5nm)，而在dmsn-3中未观察到显著降低。类似地，通过典型的brunauer-emmett-teller(bet)方法计算的总孔容积和表面积在所有dmsn的氨基改性后降低(表1)，但观察到dmsn-3-nh2与其他两个相比降低较少。孔径大小/孔容积/表面积的减小是由于氨基对内孔表面的占据，小孔隙材料的趋势更明显，这与先前的报道一致[17,18]。
dmsn-1(4.9nm)，dmsn-2(14.5nm)和dmsn-3(40nm)的不同孔径大小允许研究孔径大小对hrp/第二抗体负载的影响并最终研究对elisa敏感性的影响。其中，孔径大小大于hrp但小于第二抗体的dmsn-2预期具有最佳性能，因为其能够获得用于hrp负载的中孔，同时限制外表面上的第二抗体用于抗原-抗体结合。ζ电位测量显示原始dmsn-1/2/3的电荷为-25，-18.4和-27.3，而氨基改性的dmsn-1/2/3-nh2的电荷分别为36,14和26。电荷从负变为正，表明氨基改性成功(表1)。
hrp的固定化
使用如图6[7]所示的成熟开发的方法通过共价结合进行hrp的固定，并使用戊二醛作为结合剂。共价结合将避免在elisa过程中hrp的泄漏，这可能导致灵敏度降低。所得物质命名为dmsn-1-h，dmsn-2-h和dmsn-3-h，负载量分别为283,390和382mgg-1。与dmsn-2(390mgg-1)相比，dmsn-1的孔径大小(4.9nm，具有nh2改性)略小于hrp(6*5*4nm)，这降低了hrp进入中孔的可能性，因此负载量较小(283mgg-1)。高表面积和孔容积的氨基改性的dmsn-3具有高的负载能力，但非常大的孔径大小(40nm)对hrp的捕获效应很小，因此协同效应导致hrp负载量为382mgg-1，其类似于具有更小表面积和孔容积的dmsn-2的hrp负载量(390mgg-1)。
hrp的活性测试
为了解固定化hrp的活性，将其催化性能与游离hrp进行了比较。图3示出了hrp浓度与450nm处的光密度之间的线性关系(a450)。从每条线性回归曲线的斜率计算的dmsns-h的活性对于dmsn-1-h，dmsn-2-h和dmsn-3-h是5％，87％和85％。msn-1中的超低hrp活性可能是由负载的hrp和底物之间的反应限度引起的，其受限于具有与hrp类似尺寸的小的中孔。dmsn-2-h和dmsn-3-h中87％和85％的催化性质表明大的孔径大小具有容易进入的孔通道有利于高的酶活性。
固定第二抗体
在确保固定化hrp的酶活性可以在很大程度上得到维持后，开发具有hrp和第二抗胰岛素抗体(表示为dmsn-1-h-a，dmsn-2-h-a和dmsn-3-h-a)的dmsn作为标记用于超灵敏elisa+。在负载hrp后进行第二抗体的固定，并利用dmsn上剩余的-cho基团进行共价结合，该过程类似于hrp负载(方案s1)。在该条件下hrp的负载量与上述相似将57,60,55mgg-1(表3)的第二抗体分别缀合在dmsn-1，dmsn-2和dmsn-3上。负载量的第二抗体的dmsn之间没发现显著差异，这可能是由于较小的进料比(100mg抗体：1gdmsn)。
采用elisa+灵敏检测血清中的胰岛素
将具有hrp和第二抗体的功能性dmsn应用于人血清中的超灵敏胰岛素检测。通过稀释商业elisa试剂盒的标准溶液，新鲜制备所有胰岛素样品(在3.85fgml-1-7.7pg/ml范围内)，其检测限(lodc)为7.7pgml-1，如说明书中所建议的那样。当使用dmsn-2-h-a和dmsn-3-h-a扩增颜色信号时(图4)，检测限降低至3.85fgml-1，其等于lodc的1/2000。尽管dmsn-2-h-a和dmsn-3-h-a具有相同的检测限，但前者提供更高的od强度，因此它是三种dmsn中最佳的信号放大候选物。同时，dmsn-1-h-a的最低可检测浓度为7.7fgml-1(lodc的1/1000)，高于其他两种dmsn的最低可检测浓度。这是由于hrp负载较少和活性低。
与商业elisa试剂盒相比，elisa+显示检测灵敏度提高2000倍。它通过在dmsn-2中酶的高活性和高显色反应效率来实现，其具有合适的孔径大小和开孔通道。此外，第二抗体的分布也对高灵敏度起重要作用。在dmsn-1和dmsn-2的情况下，大尺寸的第二抗体(～20nm)限制了它们在外表面上的位置。然而，大的孔径大小的dmsn-3(40nm)将允许在孔内负载第二抗体，这阻碍了第二抗体与抗原(胰岛素)的结合，这是dmsn-3-h-a比dmsn-2-h-a较低的敏感性的可能的原因。
考虑到洗涤过程后可能有一些游离纳米粒子(dmsns-h-a)粘在孔上，也可能产生一些颜色，设置只有dmsns-h-a的对照组(图4)以评估来自左dmsns-h-a的颜色信号。将所有孵育和洗涤步骤的标准程序应用于对照组，但不添加胰岛素(抗原)。来自每个插入的dmsn-h-a(对照组)的平均信号强度对于dmsn-1-h-a，dmsn-2-h-a和dmsn-3-ha为0.115,0.594和0.314，其在图4中显示在浓度1区域下。因此，图4中显示的每个实验组的强度值表示通过检测值减去相应对照的值计算的绝对颜色变化。
建立校准曲线以通过测试低浓度(20-100fgml-1)的一系列胰岛素样品来确认elisa+的定量能力。该曲线显示在图5中，线性回归系数(r2)为0.9975，这表明elisa+对于人胰岛素定量是高度可靠的。当与定量限为7.7pg/ml的商品试剂盒相比时，elisa+显示出极高的灵敏度。为了进一步证实elisa+的定量功效，通过将1μl的1pg/ml胰岛素掺入标准溶液来测量回收率。elisa+的回收率为81％，与之前的报道相当。[19,20]在一项研究中，icp-ms用于检测浓度为111pm(640pg/ml)的胰岛素，并且实现了91％的回收率[20]。另一份报告使用液相色谱法用于低丰度(121pgml-1)人胰岛素检测，但回收率仅为33.2％-51.7％[19]。添加微量(1μl)的高回收率确保了对痕量或限量的珍贵样品的灵敏检测。
结论
通过使用具有高hrp负载的dmsn和易于进入的树突孔通道用于颜色信号放大，成功开发了超灵敏elisa+。与商业elisa试剂盒相比，实现了血清中检测灵敏度的2000倍增强。该研究提出了通过使用dmsn进行颜色扩增来提高elisa效率的好想法。而且，elisa+可广泛用于其他蛋白质的超灵敏检测。进而，很有可能将elisa+与现有技术结合以实现超级性能。
除了上述之外，所开发的dmsn显示出大且开放的孔结构，其可以有助于在其上容易地负载量子点并且在孔壁上适当地不受限制地布置，从而使从其中发射的任何光的猝灭最小化。
表1.材料的表面积、孔容积、孔径大小和ζ电位
*孔径大小测定采用dft方法[15]
表2.材料的hrp负载
表3.材料的第二抗体负载
实施例2-硫醇改性的树枝状二氧化硅粒子的合成材料和方法:(硫醇)
化学品：原硅酸四乙酯(teos)，三乙醇胺(tea)，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)，水杨酸钠，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，乙醇和盐酸(37％wt)购自sigma-aldrich。在整个实验中使用从实验室纯化系统获得的双蒸水。在所有实验中，水在超声波浴中脱氧，然后在使用前通过鼓泡n2气10分钟。
t-msn的合成。在典型的合成中，将tea(68mg)在80℃下在强烈搅拌30分钟下溶解在蒸馏水(25ml)中。加入ctab(380mg)和水杨酸钠(84mg)后，将所得混合物搅拌1小时，然后加入teos(3.8ml)。在80℃下进一步搅拌30分钟后，将mptms(0.1625ml)加入到反应溶液中。6小时后通过离心收集产物，用乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，随后在室温下用盐酸的乙醇溶液在60℃下提取3次历时6小时以除去模板ctab。将表示为t-msn的最终产物分散在水(30ml)中。
结果。通过上述合成产生的粒子具有树枝状结构，具有从中心核芯径向向外发出的尖锥，如图9所示。通过tem测量发现平均粒径为145nm，而通过动态光散射(dls，zetasizer)测量发现平均粒径略高于164nm。氮吸附分析显示平均孔径大小为14.3nm，和bet表面积为528m2/g。使用chns元素分析仪测量硫含量测定为5.97wt％。
实施例3-将量子点负载到硫醇改性的粒子中
将具有4nm直径的cdse量子点以10mg/ml的浓度分散在1ml的chcl3中。向其中加入实施例2合成的t-msn粒子的分散体(1mg，在1ml乙醇中)。将t-msn粒子与量子点一起摇动几分钟，将所得混合物离心并用etoh洗涤数次。量子点成功地负载到t-msn粒子中，每克t-msn的负载量为0.6g量子点。
实施例4-二氧化硅纳米粒子合成的替代方法
方法。在该实施例中，通过
表征。tem图像(图11a)表明获得了具有均匀形态的良好分散的二氧化硅纳米粒子。如图11b所示，显然平均粒径适当地为180±5nm并且粒子表现出纳米尺寸的径向尖锥。sem图像(图11c)进一步显示具有密集分布的二氧化硅尖锥的均匀尺寸的二氧化硅纳米粒子。氮吸附和解吸等温线(图11d)显示具有不同磁滞回线的典型iv型等温线，其表明存在高度中孔隙。相应的barrett-joyner-halenda(bjh)孔径大小分布曲线(图11d，插图曲线)来自吸附分支，表现出以9.1nm为中心的相对宽的峰。
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