检测伤口微生物感染的制作方法

本申请要求2016年3月30日提交的美国临时申请号62/315,546和2016年3月30日提交的美国申请号62/315,556的权益，所述公开通过引用以其全部内容结合在此并成为本文的一部分。

本文描述的实施例总体上涉及伤口愈合，并且具体地涉及用于检测和治疗伤口的组合物和方法。

背景技术：

在哺乳动物中，真皮损伤引发导致伤口愈合的有组织的复杂级联的细胞和生化事件。伤口愈合是导致恢复解剖学连续性和功能的复杂的动态过程：理想的愈合伤口是恢复到正常解剖结构、功能和外观的伤口。典型的伤口通过由四个阶段组成的模型愈合-“渗出”阶段、增殖阶段、修复阶段和上皮成熟(hatz等人，《伤口愈合和伤口管理(woundhealingandwoundmanagement)》，施普林格出版社(springer-verlag)，慕尼黑，1994年)或止血、炎症、增殖和重塑阶段(nwomeh等人，《临床整形外科手术(clin.plast.surg.)》，1998，25，341)。炎症阶段对伤口愈合过程特别重要，其中伤口部位处的生化反应促进愈合，但也由于产生过量的蛋白酶而导致组织破坏。

致病性感染是伤口愈合最常见的障碍之一。清洁伤口逐渐恶化到定植伤口通常与由致病微生物强加的生物负荷相关联。参见ovington等人，《造口术伤口管理(ostomywoundmanagement)》，49.7a：8-12，2003。感染的伤口是中间阶段，其特征在于感染的临床症状，如黄色外观、疼痛、发红、渗出脓液，而定植的伤口的特征在于慢性病原体感染并且难以愈合。伤口的感染也可能阻止愈合过程。例如，伤口中的病原体可能产生毒素(例如，梭菌属物类)、产生有害的代谢物如提高ph的氨(例如，变形杆菌属)、激活或产生组织裂解酶如蛋白酶或促进组织侵入，从而导致伤口的大小或严重程度增大。

为了使伤口的慢性受控制，在临床和兽医环境下采用各种各样的评估技术和/或工具。目前评估感染伤口的方法主要基于对与伤口相关联的各种参数进行测定。例如，可以在视觉上评估伤口，可以进行长度和深度测量，可以在可用的情况下使用数字摄影来追踪伤口的视觉状况和大小(krasner等人，同上)。在临床实践中，感染的诊断基于对次级参数的测量，如气味、局部疼痛的存在、热、肿胀、排泄和发红。这些临床指示剂中的许多指示剂，如炎症和排泄，对伤口感染的预测价值较低。在其它情况下，可以使用实验室和/或临床诊断程序来确定伤口部位的致病菌群的(一种或多种)数量和(一种或多种)类型。在医院实验室中擦拭伤口之后进行微生物学检验是确认细菌定植和识别与感染相关联的菌株从而允许正确的抗生素疗程处方的一种选择。然而，这个过程耗时且劳动强度大。诊断感染延迟可能延迟抗生素的施用，并且可能增加脓毒症发生的风险。

与现有临床诊断相关联的最大缺点之一是与感染发作和检测时间相关联的滞后。例如，使用擦拭程序对感染进行的阳性鉴定通常取决于在伤口部位处获得的微生物的“临界质量”，并且因此在达到可检测水平之前不能进行早期检测。而且，拭子可能被周围组织的菌群污染，从而使诊断程序复杂化。其它缺点包含例如抽样误差、拭子传输延迟、分析程序误差和/或报告误差。参见bowler等人的综述，《临床微生物综述(clinmicrobiolrev.)》，14(2):244–269,2001。

因此，对能够早期诊断临床感染、优选地允许在表现出感染的临床症状之前进行临床诊断的诊断试剂和方法存在迫切但未满足的需求。还需要将有助于在临床症状出现之前预测伤口的临床感染的组合物和方法。这种预后辅助将允许在伤口恶化之前通过合适的治疗(例如，抗微生物治疗)进行早期干预，并且需要手术或其它剧烈干预来预防进一步感染。此外，如果临床医生能够尽早对伤口感染做出反应，则也可以用最少的抗生素使用来治疗感染。这将减少住院治疗的需要并且将降低例如由于与其它患病受试者接触导致的继发感染的风险。

技术实现要素：

本文公开的技术提供了检测感染伤口和/或慢性伤口的组合物和方法。所公开的技术通过以下方式改进现有测定：增加检测感染伤口的灵敏度、精确度和特异性；提供定性和定量测量的能力；以及提高原位和实时感染伤口的检测速度。本文描述的测定和方法部分基于使用检测存在于感染伤口或慢性伤口中的生物标记物和/或探针的特异性试剂。检测过程可能涉及使用对感染伤口中存在的标记物具有特异性但对非感染性或非慢性伤口不具有特异性的试剂，并且检测步骤可能涉及对在作用于探针时由标记物产生的一个或多个信号的定性或定量测量。在检测方法涉及检测伤口中存在的酶的实施例中，探针包括对酶具有特异性的修饰酶底物，所述修饰酶底物产生可能任选地扩增的信号。这极大地提高了检测的效率和特异性。此外，可以采用多个检测探针，所述多个检测探针各自对一个或多个靶例如对伤口特异的酶具有特异性。这极大地有助于使诊断测定的效率和准确性最大化，同时使假阳性的发生率(例如，由于非特异性相互作用和/或靶冗余)最小化。此外，本文公开的实验结果证实，新型探针和基于其的测定技术能够检测和表征各种类型的伤口。最后，所公开技术的试剂可以与治疗分子如抗生素、抗真菌剂等一起使用，以监测和评估对慢性伤口的治疗和管理。

本文描述的实施例部分基于以下发现：免疫系统的细胞，包含由其产生的酶，可以在伤口的早期诊断中用作标记物。这些细胞例如嗜中性粒细胞在伤口部位募集以对抗感染，通过吞噬细菌(和其它病原体)和/或用酶中和它们来实现。一些酶对蛋白质(例如，弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、脂肪酶)具有特异性，其它酶对细胞壁组分(例如，溶菌酶)具有特异性，而又其它酶介导蛋白质变性(例如，nadph氧化酶、黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶(mpo)和其它过氧化物酶)。这些细胞例如嗜中性粒细胞通常只是寿命短暂的，并且当它们在感染区域裂变时，它们释放其包含酶的溶酶体的内容物，所述内容物然后可以被检测以提供对伤口状态的可靠测量。

因此，本文描述的各个实施例利用酶标记物的检测，所述酶标记物指示在感兴趣的生物样品(例如，伤口组织)中存在骨髓细胞和具体地嗜中性粒细胞。因此，这种酶在伤口流体中的增加的水平或活性对应于增强的细菌激发和有利于侵入性细菌的受干扰的宿主/细菌平衡的表现。

在一方面，本文提供了一种能够检测来自体液的酶活性的化学实体，所述化学实体包括以下中的一个或多个：锚区、酶识别区、酶不稳定区或酶反应区以及指示剂区。

在一些实施例中，所述化学实体包含以下中的至少三个：锚区、酶识别区、酶不稳定区或酶反应性区以及指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括以下中的一个：锚区、酶不稳定区或酶反应区以及指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括锚区之一、酶识别区之一、酶不稳定区或酶反应域之一以及指示剂区之一。在一些实施例中，所述化学实体经由所述锚区与支持材料结合。在一些实施例中，所述化学实体包括至少两个指示剂区。在一些实施例中，所述酶识别区域与所述酶不稳定区或所述酶反应性区部分或完全重叠。在一些实施例中，所述锚区与所述酶不稳定区或所述酶反应性区部分或完全重叠。在一些实施例中，所述锚区与所述指示剂区部分或完全重叠。在一些实施例中，所述指示剂区与所述酶不稳定区或所述酶反应性区部分或完全重叠。在一些实施例中，一旦通过靶酶活性与所述化学实体分离，所述指示剂区就与选自以下的一种或多种辅酶相互作用：脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶及其组合。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与选自以下的一种或多种靶酶相互作用：napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z、酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)、溶菌酶、髓过氧化物酶(mpo)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶和蛋白酶-3弹性蛋白酶、溶菌酶、酯酶、脂肪酶及其组合。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括在所述酶不稳定区或所述酶反应性区与一种或多种靶酶相互作用时能够产生可见颜色或可检测电子变化的部分，所述部分选自过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、苯酚、醌、中性染料、带电染料、纳米颗粒、量子点、胶体金颗粒或其类似物。在一些实施例中，所述过氧化物酶底物选自对氨基苯酚、abts(2,2苯酚、abts(速率选自金酸)二铵盐)、3,3'-二氨基联苯胺、dcpip、n,n-二甲基-对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚氧基、靛蓝、固蓝rr和4-氯-7-硝基苯并呋咱及其类似物。在一些实施例中，所述过氧化物酶底物是苯胺类似物。在一些实施例中，所述过氧化物酶底物是具有多于6个碳单元的固蓝rr的n-烷基衍生物。在一些实施例中，所述指示剂区包括在所述酶不稳定区或所述酶反应性区与一种或多种靶酶相互作用时能够产生可见颜色或可检测电子变化的部分，所述部分选自吲哚基类似物、中性染料、带电染料、纳米颗粒和胶体金颗粒。在一些实施例中，能够产生可见颜色或可检测电子变化的所述部分是带电染料或鲁米诺衍生物。在一些实施例中，所述带电染料选自甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16。在一些实施例中，所述带电染料选自反应性蓝色4、反应性红色120、反应性蓝色2、反应性绿色19和反应性棕色10。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区对溶菌酶不稳定或与其反应，并且所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括多糖、葡糖胺或肽聚糖、以及多糖、葡糖胺或肽聚糖。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽聚糖，并且肽聚糖对溶菌酶不稳定或与其反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括苯酚、萘酚、吲哚氧基或醌，并且所述苯酚、所述羧基氨基苯基、所述吲哚氧基或所述醌对髓过氧化物酶不稳定或与其反应并且不与血红素反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽、肽模拟物或蛋白质，并且所述肽、所述肽模拟物或所述蛋白质对弹性蛋白酶不稳定或与其反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaapxy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自1到50的数字，l为连接部分，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaapvxy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自0到50的数字，l为连接部分，如酯或酰胺，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽、肽模拟物或蛋白质，并且所述肽、所述肽模拟物或所述蛋白质对组织蛋白酶g不稳定或与其反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyn⁴n³n²n¹xy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸；每个y独立地为选自0到6的数字；n⁴选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺；n³选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和丝氨酸；n²选自脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸；n¹选自丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和蛋氨酸；l为连接部分，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分。在一些实施例中，所述锚区选自聚苯乙烯珠、硅胶珠、多糖珠、聚丙烯酰胺珠、纤维素珠、多糖、衍生纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、uv可活化基团、酚叠氮化物、环氧化物、肽聚糖、脂肪族链、脂肪族醇链、多环或多芳香环系、亲脂性基团及其组合。在一些实施例中，所述锚区在短时间uv照射后与支持材料结合。在一些实施例中，所述锚区包括用于与支持材料结合的离子化学基团。在一些实施例中，所述锚区包括用于与所述支持材料共价连接的反应性部分。在一些实施例中，所述锚区和所述酶不稳定区是多肽，并且所述锚区包括聚合物结合结构域。在一些实施例中，所述酶不稳定区对蛋白酶不稳定，并且所述聚合物结合结构域选自疏水结合结构域。在一些实施例中，所述酶不稳定区对组织蛋白酶或弹性蛋白酶不稳定。在一些实施例中，所述化学实体选自小分子实体或改性聚合物。

在一方面，本文提供了用于检测感染的化学实体，所述化学实体包括指示剂区，所述指示剂区包括呈现可见颜色变化的ph敏感性部分。在一些实施例中，所述化学实体进一步包括允许反应进入固相的反应性基团。在一些实施例中，所述ph敏感性部分是溴百里酚蓝、酚红、溴酚红、氯酚红、百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫；或其它磺基酞菁染料。

在一些实施例中，所述锚区在短时间uv照射后与支持材料结合。在一些实施例中，所述锚区包括用于与支持材料结合的离子化学基团。在一些实施例中，所述锚区包括用于与所述支持材料共价连接的反应性部分。在一些实施例中，所述锚区包括疏水部分，所述疏水部分在水性系统中引起很小溶解度或不产生溶解度，从而允许材料与固相保持缔合。

在一些实施例中，所述反应性区与细菌酶β-内酰胺酶相互作用。这是一种能够降解常见抗菌药物的细菌酶，并且其存在受治疗医师关注。除在其它生物标记物上报告的试剂外，发色β-内酰胺酶底物通常是有用的。

在一些实施例中，所述反应性区是病毒蛋白酶或宿主弗林蛋白酶的底物。在一些实施例中，切割产物的检测需要聚阳离子阱。在某些实施例中，这些可以是交联的。根据交联的程度和类型，它们也可以是超吸收剂。在一些实施例中，所述酶底物能够产生可以电子检测的氧化还原活性物类。在其它实施例中，通过反射光进行固相酶产物的电子检测。本文公开了化学实体，所述化学实体可以具有单体性质、低聚性质或聚合性质。在感染以其它方式变得明显之前，对所述化学实体进行修饰以用作检测伤口或体液感染的所选标记物的介质。在一些实施例中，所述化学实体用于检测哺乳动物的感染。在一些实施例中，所述化学实体检测一种或多种感染生物标记物并在所述一种或多种生物标记物存在的情况下产生可见的变化。在一些实施例中，所述一种或多种生物标记物是白细胞酶。在一些实施例中，所述一种或多种生物标记物选自弹性蛋白酶、溶菌酶、髓过氧化物酶、白细胞过氧化物酶、酯酶、脂肪酶、napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z、酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)和蛋白酶-3、β-内酰胺酶和其它类似的酶或其组合。在一些实施例中，所述化学实体检测特定ph范围。在一些实施例中，所述化学实体检测一种或多种白细胞酶和特定ph范围；并且在所述一种或多种白细胞酶和所述特定ph范围存在的情况下产生可见变化。在一些实施例中，所述可见变化是容易与伤口或体液中常见的颜色(例如，红色、黄色、粉红色或棕色)区分的颜色变化。在一些实施例中，所述可见变化是荧光、发光或通过物理手段如折射、气体释放或聚合物状态的变化介导的。在一些实施例中，所述化学实体包括选自由以下组成的组的一种或多种组分：锚区、酶识别区、酶不稳定区或酶反应区和指示剂区。在一些实施例中，所述体液是血液、血浆、血清、脑脊髓液、痰液、尿液或伤口渗出液。在优选的实施例中，所述体液是伤口渗出物。

在一些实施例中，将所述化学实体并入伤口敷料中，其中所述化学实体与和所述伤口敷料接触的伤口渗出物反应。在一些实施例中，将所述化学实体并入伤口敷料中，其中所述化学实体与通过所述伤口敷料抽吸到包括所述化学实体的试剂层的伤口渗出物反应。在一些实施例中，所述化学实体是指示剂结合物，在存在感染生物标记物时，所述指示剂结合物产生颜色或其它可见标记物。在一些实施例中，所述化学实体用于诊断哺乳动物中感染的伤口的方法中。在一些实施例中，所述化学实体用于治疗哺乳动物伤口的方法中。在一些实施例中，所述化学实体用于诊断和治疗哺乳动物伤口的方法中。

在一些实施例中，所述化学实体经由管或其它部件并入真空伤口治疗系统中，其中所述化学实体与和装置中的插入物接触的真空渗出物反应。

在一些实施例中，所述化学实体经由管或其它部件并入通气机系统中，其中所述化学实体与和所述化学实体接触的吸出物、气溶胶或痰液渗出物反应。

在一些实施例中，将所述化学实体并入试纸条中，其中在使用外部拭子或类似物施加待评估的流体之后，所述化学实体进行反应。在一些实施例中，所述化学实体引起可以通过反射光、电流分析法或类似的电化学过程以电子方式检测的变化。

在一些实施例中，使用所述化学实体使得在这些变化以其它方式变得明显之前检测哺乳动物或患者的感染状态的变化可行。在一些实施例中，所述方法是改进或主动疗法的基础，其中随后改变治疗或应用更详细的诊断被随后使用以选择疗法，以便预防哺乳动物或患者的医学状况恶化。

化学实体

在一些实施例中，所述化学实体是小分子化学实体或包括选自由以下组成的组的一种或多种组分的改性聚合物：锚区、酶识别区、酶不稳定区或酶反应区和指示剂区。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区是通过酶反应的结构。在一些实施例中，酶识别位点是允许与酶结合的结构。

在某些实施例中，所述化学实体是改性聚合物。在某些实施例中，所述化学实体是小分子化学实体。本文公开了包括选自由以下组成的组的一种或多种组分的化学实体：锚区、酶不稳定区或酶反应性区、酶识别区和指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括至少一个锚区、至少一个酶识别区、至少一个酶不稳定区或酶反应性区、一级至少一个指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体通过所述锚区与支持材料结合。在一些实施例中，所述化学实体是指示剂结合物。在一些实施例中，所述化学实体包括至少一个酶不稳定区或酶反应性区、至少一个酶识别区域和至少一个指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括至少一个锚区和至少一个指示剂区。

在一些实施例中，所述化学实体包括锚区、酶识别区、酶不稳定区或酶反应性区以及指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括酶识别区、酶不稳定区或酶反应性区以及指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括锚区、酶识别区以及酶不稳定区或酶反应性区。在一些实施例中，所述化学实体包括酶识别区、锚区以及两个酶不稳定区或酶反应性区。在一些实施例中，所述化学实体包括酶识别区、锚区、两个酶不稳定区区或酶反应区、以及两个指示剂区。在一些实施例中，所述化学实体包括酶识别区、两个酶不稳定区或酶反应性区、以及两个指示剂区。

在一些实施例中，所述一个或多个锚区和所述一个或多个酶不稳定区或酶反应性区彼此部分重叠。在一些实施例中，所述锚区和所述酶识别区或所述酶不稳定区或所述酶反应性区彼此部分或完全重叠。在一些实施例中，所述酶识别区域和所述酶不稳定区或所述酶反应性区彼此部分或完全重叠。在一些实施例中，所述一个或多个锚区在所述一个或多个酶不稳定区或酶反应性区内。在一些实施例中，所述锚区在所述酶不稳定区或所述酶反应性区内。在一些实施例中，所述一个或多个酶不稳定区或酶反应性区在所述一个或多个锚区内。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区在所述锚区内。

在一些实施例中，所述化学实体的所述锚区将所述化学实体与支持材料结合。在一些实施例中，所述锚区包括离子化学基团。在一些实施例中，所述离子化学基团与所述支持材料形成离子键。在一些实施例中，所述锚区包括疏水部分。在一些实施例中，所述疏水部分与所述支持材料相互作用以将化学实体与所述支持材料结合。在一些实施例中，所述锚区包括亲水部分。在一些实施例中，所述亲水部分与所述支持材料相互作用以将所述化学实体与所述支持材料结合。

在一些实施例中，所述锚区是珠子、聚合物、具有离子化学基团的材料、具有亲水部分的材料、或具有疏水部分的材料。在一些实施例中，所述锚区是珠子。在一些实施例中，所述锚区是聚合物。在一些实施例中，所述锚区是具有离子化学基团的材料，其中所述离子化学基团带正电荷。在一些实施例中，所述锚区是具有离子化学基团的材料，其中所述离子化学基团带负电荷。在一些实施例中，所述锚区是具有亲水部分的材料。在一些实施例中，所述锚区是具有疏水部分的材料，如脂族链或脂族醇。在一些实施例中，所述锚区包括用于共价连接到支持材料的反应性部分，如光活性苯基叠氮化物或环氧基团。

在一些实施例中，所述锚区是聚苯乙烯珠粒、硅胶珠粒、多糖珠粒、聚丙烯酰胺珠粒、纤维素珠粒、多糖、衍生化纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、uv可活化反应性基团或肽聚糖衍生物、或其组合。在一些实施例中，所述锚区在短时间uv照射后与支持材料结合。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与选自以下的一种或多种靶酶反应：弹性蛋白酶、溶菌酶、髓过氧化物酶、白细胞过氧化物酶、酯酶、脂肪酶、napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z、酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)和蛋白酶-3、β-内酰胺酶和其它类似的酶或其组合。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与弹性蛋白酶反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与溶菌酶反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与组织蛋白酶g反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与髓过氧化物酶反应。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括对弹性蛋白酶或组织蛋白酶g不稳定的肽、肽模拟物或蛋白质、或其组合。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括对弹性蛋白酶不稳定的肽、肽模拟物或蛋白质。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包含对组织蛋白酶g不稳定的肽、肽模拟物或蛋白质。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括对弹性蛋白酶不稳定的肽。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaap(v/f/a)xy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为大于0的整数，或者每个y独立地为1到50的整数，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地为1到6的整数，l为连接部分，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对弹性蛋白酶不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaap(v/f/a)xy-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为大于0的整数，或者每个y独立地为1到50的整数，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地为1到6的整数，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对弹性蛋白酶不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaapxy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自1到50的氨基酸，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地是1到6的整数，l为连接部分，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对弹性蛋白酶不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyaapxy-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自1到50的氨基酸，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地为1到6的整数，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对弹性蛋白酶不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyuuuuy-z肽，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自1到50的氨基酸，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地为1到6的整数，u表示选自精氨酸、赖氨酸、甘氨酸或丙氨酸的氨基酸，并且z是能够产生可见颜色变化或可检测电子变化的部分。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyuuuuuuy-z，其中每个x独立地为任何氨基酸，每个y独立地为选自1到50的氨基酸，或者每个y独立地为1到10的整数，或者每个y独立地为1到6的整数，u表示选自levlfq的氨基酸，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括对组织蛋白酶g不稳定的肽。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyn⁴n³n²n¹xy-l-z，其中每个x独立地为任何氨基酸；每个y独立地为选自0到6的数字；n⁴选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺；n³选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和丝氨酸；n²选自脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸；n¹选自丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和蛋氨酸；l为连接部分，并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对组织蛋白酶g不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列xyn⁴n³n²n¹xy-z，其中每个x独立地为任何氨基酸；每个y独立地为选自0到6的数字；n⁴选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺；n³选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和丝氨酸；n²选自脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸；n¹选自丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和蛋氨酸；并且z是能够引起可见颜色变化或可检测电子变化的部分；并且所述肽对组织蛋白酶g不稳定。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用fmoc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，z为过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、氨基苯醚、吲哚氧基、中性染料、带电染料、纳米颗粒或胶体金颗粒。在一些实施例中，z是过氧化物酶底物。在一些实施例中，所述过氧化物酶底物选自对氨基苯酚、abts(2,2'-亚氨基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)、3,3'-二氨基联苯胺、dcpip、n,n-二甲基对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚氧基、靛蓝、固蓝rr、4-氯-7-硝基苯并呋咱。在一些实施例中，z是芳胺。在一些实施例中，z是氨基酚。在一些实施例中，z是氨基苯酚醚。在一些实施例中，z是吲哚氧基。在一些实施例中，z是中性染料。在一些实施例中，z是带电染料。在一些实施例中，所述带电染料选自雷玛唑亮蓝、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是雷玛唑亮蓝、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是甲苯胺蓝。在一些实施例中，所述带电染料是反应性黑5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性紫5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。

在一些实施例中，z是基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。在一些实施例中，所述基于二氯三嗪的反应性染料呈现黑色。

在一些实施例中，z是含有磺酰基乙基-硫酸氢盐-反应性基团的反应性染料。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5。在一些实施例中，所述反应性染料是雷玛唑亮蓝。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝或反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5或雷玛唑亮蓝。

在一些实施例中，z是纳米颗粒。在一些实施例中，z是胶体金颗粒。

在一些实施例中，z是带电染料、吲哚衍生物或鲁米诺衍生物。在一些实施例中，z是吲哚衍生物。在一些实施例中，z是鲁米诺衍生物。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与溶菌酶反应。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括肽聚糖。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区是β-内酰胺。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括苯酚、氨基酚、氨基苯基醚、吲哚氧基或醌。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括苯酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚醚。在一些实施例中，酶标记或酶反应性区包括吲哚氧基。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括醌。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与髓过氧化物酶反应但不与血红素反应。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、中性染料、带电染料、纳米颗粒或胶体金颗粒。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括过氧化物酶底物。在一些实施例中，所述过氧化物酶底物选自对氨基苯酚、abts(2,2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、3,3'-二氨基联苯胺、dcpip、n,n-二甲基对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和4-氯-7-硝基苯并呋咱、固蓝rr、n-(2-羟基)十四烷基-固蓝rr。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括芳胺。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括中性染料。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括带电染料。在一些实施例中，所述带电染料选自雷玛唑亮蓝、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16、或这些中的每一种的水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是雷玛唑亮蓝、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是甲苯胺蓝。在一些实施例中，所述带电染料是反应性黑5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性紫5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括纳米颗粒。在一些实施例中，z是胶体金颗粒。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括带电染料、吲哚衍生物或鲁米诺衍生物。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括吲哚衍生物。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括鲁米诺衍生物。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在正常环境照明中呈现可见颜色变化的染料。在一些实施例中，所述染料具有针对伤口产物的对比色，所述伤口产物通常为红色、黄色或棕色。在另外的实施例中，所述染料是紫色、蓝色或深绿色。在一些实施例中，所述染料是紫色的。在一些实施例中，所述染料是蓝色的。在一些实施例中，所述染料是深绿色的。在一些实施例中，所述染料具有低分子量、是带电的、含有反应性或可连接基团、对γ辐射稳定、并且是深色的。在一些实施例中，所述染料选自cibracron系列染料、偶氮染料和雷玛唑染料、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述染料选自cibracron系列染料。在一些实施例中，所述染料选自偶氮染料。在一些实施例中，所述染料选自雷玛唑染料、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述染料选自罗丹明、香豆素、花青、氧杂蒽、聚甲炔、芘、二吡咯甲烷、二氟萘、萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、多甲藻素-叶绿素蛋白、荧光素、6-fam、罗丹明、德克萨斯红、加州红、ifluor594、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6f、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、瀑布蓝、瀑布黄、香豆素、cy-chrome、dylight350、dylight405、dylight488、dylight549、dylight594、dylight633、dylight649、dylight680、dylight750、dylight800、藻红蛋白、percp(多甲藻素-叶绿素蛋白)、percp-cy5.5、joe(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)、ned、rox(5-(和-6-)-羧基-x-罗丹明)、hex、荧光黄、海蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、alexa350、alex430、alexa488、alexa532、alexa546、alexa568、alexa594、alexa633、alexa647、alexa660、alexa680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、fl、fl-br2、530/550、558/568、630/650、650/665、r6g、tmr、tr和二甲基氨基偶氮苯磺酸(dabsyl)、或其结合物、或其组合。

在一些实施例中，所述指示剂区包括基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。在一些实施例中，所述基于二氯三嗪的反应性染料呈现黑色。

在一些实施例中，所述指示剂区包括含有磺酰基乙基-硫酸氢盐-反应性基团的反应性染料的反应产物。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5。在一些实施例中，所述反应性染料是雷玛唑亮蓝。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝或反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5或雷玛唑亮蓝。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在正常环境照明中呈现颜色变化的颗粒(例如，胶体金属或量子点)。在一些实施例中，所述指示剂区包括纳米颗粒。在一些实施例中，所述指示剂区包括胶体金颗粒。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在uv光下呈现可见颜色变化的染料。在一些实施例中，所述指示剂区包括荧光染料。在一些实施例中，所述指示剂区包括发光的染料。

在一些实施例中，所述指示剂区包括酶反应性部分。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生肉眼可见或可通过电子手段检测的产物。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生肉眼可见的产物。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生可通过电子手段检测的产物。在一些实施例中，所述指示剂区包括吲哚氧基糖苷或半乳糖苷，根据所使用的末端糖，所述吲哚氧基糖苷或所述半乳糖苷被葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶或半乳糖苷酶切割以产生靛蓝。在一些实施例中，所述指示剂区包括苯酚或萘酚，所述苯酚或所述萘酚被辅酶氧化以产生可见产物。在一些实施例中，所述指示剂区包括苯酚，所述苯酚被过氧化物酶氧化以产生可见产物。在一些实施例中，所述指示剂区包括可通过电子手段检测的金属基序。在一些实施例中，所述指示剂区包括可通过电子手段检测的二茂铁或二茂铁类似物。在一些实施例中，所述辅酶选自脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶和葡糖苷酶。在一些实施例中，所述辅酶不存在于所述伤口流体中。在一些实施例中，所述辅酶存在于所述伤口流体中。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生在uv光下可见的产物。

在一些实施例中，所述化学实体基本上由至少一个锚区、至少一个酶不稳定区或酶反应性区和至少一个指示剂区组成。在一些实施例中，所述化学实体基本上由至少一个酶不稳定区或酶反应性区和至少一个指示剂区组成。在一些实施例中，所述化学实体基本上由至少一个锚区和至少一个酶不稳定区或酶反应性区组成。在一些实施例中，所述化学实体能够在没有锚区的情况下与支持材料结合。

在一些实施例中，所述化学实体被印刷在支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，报告实体或化学实体化学结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示出所有尺寸类似的毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，所述化学实体离子结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，所述化学实体共价结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。所述支持材料包含但不限于纤维素，聚酰胺、聚酯、聚丙烯酸酯和可用作纤维的其它类似聚合物。在一些实施例中，所述支持材料是纤维素。在一些实施例中，所述支持材料是聚酰胺。在一些实施例中，所述支持材料是聚酯。在一些实施例中，所述支持材料是聚丙烯酸酯。

在一些情况下，伤口的ph可能影响伤口愈合的许多因素，如血管生成、蛋白酶活性、氧释放和细菌毒性。慢性不愈合伤口可能具有升高的碱性环境。随着伤口朝着愈合进展，伤口的ph变为中性，并且然后变为酸性。监测伤口的ph可以提供评估伤口状况(例如，感染或无感染)的方法，并有助于确定伤口对治疗的反应。

在一些实施例中，所述ph敏感性部分是溴百里酚蓝、酚红、溴酚红、氯酚红、百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫；或其它磺基酞菁染料。

在一些实施例中，mpo响应指示剂并入分子量大于459da的烷基苯胺酰胺。在优选的实施例中，此指示符具有以下结构：

其中，

r¹＝-ch3，-ch2ch3，-ch2ch2ch2ch3

x＝-c(＝o)-，-s(＝o)2-

r²＝可以是但不限于：

-c1-c10烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷基杂芳基

其中烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、杂芳基基团、烷芳基基团和烷基杂芳基基团任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：二茂铁、卤素(可以是f、cl、br、i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基、-nr⁴r⁵、r⁴c(＝o)-、r⁴c(＝o)o-、r⁴oc(＝o)o-、r⁴nhc(＝o)-、r⁴c(＝o)nh-、r⁴r⁵nc(＝o)-、r⁴oc(＝o)-

r⁴和r⁵可以独立地为但不限于：

-(c1-c12)烷基

-(c1-c12)烯基

-(c1-c12)炔基

-(c1-c8)[(c1-c4)烷氧基]烷基

-(c1-c8)[(c1-c4)烷氧基]烯基

-(c6-c10)芳基-(c1-c5)烷基

-(c2-c9)杂芳基-(c1-c5)烷基；

其中烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：卤素(可以是f、cl、br、i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基，

或者n(r⁴r⁵)是氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷或偶氮环、1-取代哌嗪或吗啉部分

y＝-nh-ch2-ch(oh)-，-nh-，-nh-c(＝o)-nh-，-nh-c(＝s)-nh-

r³可以是但不限于：

-c6-c30烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基

其中烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、杂芳基基团、烷芳基基团和烷基杂芳基基团任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：二茂铁、卤素(可以是f、cl、br、i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基、氰基(-cn)、叠氮基(-n3)、-nr⁴r⁵、r⁴c(＝o)-、r⁴c(＝o)o-、r⁴oc(＝o)o-、r⁴nhc(＝o)-、r⁴c(＝o)nh-、r⁴r⁵nc(＝o)-、r⁴oc(＝o)-

在一些实施例中，期望指示剂底物保持在适当位置并在适当位置反应。因此，水性体系的有限溶解度是优选的。在固相上保持在位的能力被定义为耐水性，并且在实例114中记录了测量它的方法。在优选的实施例中，底物的耐水性大于一，并且在仍更优选的实施例中，其大于2。

在一些实施例中，本文公开了具有下式(式d)的化合物：

其中，

r¹＝-ch3，-ch2ch3，-ch2ch2ch2ch3

x＝-c(＝o)-，-s(＝o)2-

r²＝可以是但不限于：-c1-c10烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基，其中烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、杂芳基基团、烷基芳基基团和烷基杂芳基基团任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：二茂铁、卤素(可以是f，cl，br，i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基、-nr⁴r⁵、r⁴c(＝o)-、r⁴c(＝o)o-、r⁴oc(＝o)o-、r⁴nhc(＝o)-、r⁴c(＝o)nh-、r⁴r⁵nc(＝o)-、r⁴oc(＝o)-

r⁴和r⁵可以独立地是但不限于：-(c1-c12)烷基-(c1-c12)烯基-(c1-c12)炔基-(c1-c8)[(c1-c4)烷氧基]烷基-(c1-c8)[(c1-c4)烷氧基]烯基-(c6-c10)芳基-(c1-c5)烷基-(c2-c9)杂芳基-(c1-c5)烷基；其中烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：卤素(可以是f、cl、br、i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基，或者n(r⁴r⁵)是氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷或氮杂环庚烷、1-取代哌嗪或吗啉部分；y＝-nh-ch2-ch(oh)-，-nh-，-nh-c(＝o)-nh-，-nh-c(＝s)-nh-

r³可以是但不限于：-c6-c30烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基，其中烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、杂芳基基团、烷基芳基基团和烷基杂芳基基团任选地被独立地选自以下的一种到五种取代基取代：二茂铁、卤素(可以是f，cl，br，i)、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烯基、(c1-c4)炔基、(c3-c7)环烷基、(c1-c6)杂环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c9)杂芳基、(c1-c4)烷氧基、氰基(-cn)、叠氮基(-n3)、-nr⁴r⁵、r⁴c(＝o)-、r⁴c(＝o)o-、r⁴oc(＝o)o-、r⁴nhc(＝o)-、r⁴c(＝o)nh-、r⁴r⁵nc(＝o)-、r⁴oc(＝o)-。

在一些实施例中，本文公开了具有下式(式a)的化合物：

其中

y为o或n

ar为

或二茂铁；

r为-c1-c10烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷基芳基、或烷基杂芳基；

α为a、v、f、g、m、r、或l；

β为键或独立地p、f、a、r、l或g；

γ为键或独立地p、a、r、l或g；

δ为键或独立地p、a、r、l、g、或v；

ε为键或独立地p、a、r、l、g、v或e；

为键或独立地p、a、r、l或g；

其中，如果β、γ、δ、ε和各自为键，则α的n端与x键合；

x是包括0到14个氨基酸的肽链；

pg是-c(＝o)-o-r¹，其中r¹是c1-c30烷基、叔丁基、或甲基芴基、或-c(＝o)-r²，其中r²是-c1-c30烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷芳基或烷基杂芳基。

在一些实施例中，本文公开了具有下式的化合物(式b)：

其中

l为a、aa、v或三唑基，

z为二茂铁、结晶紫、孔雀石绿、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5、反应性橙16、反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19或反应性棕10

α选自a、v、f、g、m、r或l

β为键或独立地p、f、a、r、l或g

γ为键或独立地p、a、r、l或g

δ为键或独立地p、a、r、l、g或v

ε为键或独立地p、a、r、l、g、v或e

为键或独立地p、a、r、l或g，

其中，如果β、γ、δ、ε和各自为键，则α的n端与x键合；

x是包括0到14个aa的肽链，其中aa是氨基酸、多胺或聚氧化烯；

pg为聚苯乙烯珠、硅胶珠、多糖珠、聚丙烯酰胺珠、纤维素珠、多糖、衍生纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、uv可活化基团、酚叠氮化物、环氧化物、肽聚糖、脂肪链、脂肪醇链、脂族胺、巯基、多环或多芳环体系、亲脂基团或其组合、-c(＝o)-o-r¹其中r¹为c1-c30烷基、叔丁基甲基芴基、-c(＝o)-r²其中r²是-c1-c30烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷芳基或烷基杂芳基。

通常，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

在一个实施例中，

a选自a、v、f、g、m、r、l

b选自无氨基酸或独立地p、f、a、r、l、g

g选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g

d选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g、v

e选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g、v、e

f选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g。

在另一个实施例中，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

a选自a、v、f、g、m、r、l

b选自无氨基酸或独立地p、f、a、g

g选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g

d选自无氨基酸或独立地p、a、r、l、g、v

e选自无氨基酸或独立地p、a、g、v、e

f选自无氨基酸或独立地p、a、g。

在另一个实施例中，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

a选自a、v、f、g、m、r、l

b选自无氨基酸或独立地p、f、a、g

g选自无氨基酸或独立地p、a、l、g

d选自无氨基酸或独立地p、a、l、g、v

e选自无氨基酸或独立地p、a、g、v、e

f选自无氨基酸或独立地p、a、g。

在另一个实施例中，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

a选自a、v、f、g

b选自无氨基酸或独立地p、f、a、g

g选自无氨基酸或独立地p、a、g

d选自无氨基酸或独立地p、a、g，

e选自：无氨基酸或独立地a、g、v，

f选自无氨基酸或独立地a、g。

特别地，在另一个实施例中，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

a选自a、v、f

b选自无氨基酸或独立地p、f、a，

g选自无氨基酸或独立地a、g

d选自无氨基酸或独立地a、g，

e选自无氨基酸或独立地a、g，

f选自无氨基酸或独立地a、g。

优选地，弹性蛋白酶底物具有式a-b-c-d-e-f，其中

a选自a、v、f

b选自无氨基酸或独立地p、f、a，

g选自无氨基酸或独立地a，

d选自无氨基酸或独立地a，

e选自无氨基酸或独立地a，

f选自无氨基酸或独立地a。

附图说明

图1：本文公开的化合物的示例性实施例。

图2：本文公开的化合物的示例性实施例，其对mpo和弹性蛋白酶具有多种反应要求(例如实例9，甲基-3-fmoc-aapv-酰胺-4-氨基苯酚或甲基-3-氨基-4-fmoc-aapv-酰胺苯甲酸酯)。

图3a：本文公开的化合物的示例性实施例，其对弹性蛋白酶具有多种反应要求。

图3b：本文公开的化合物的示例性实施例，其对弹性蛋白酶具有多种反应要求。

图4a：本文公开的化合物的示例性实施例，其对弹性蛋白酶具有反应，其中示出了针对弹性蛋白酶底物的锚的重叠功能。

图4b：本文公开的化合物的示例性实施例，其对mpo具有反应，其中示出了针对mpo底物的指示剂和反应性区的重叠功能。

图5：针对含有吲哚醚的β-内酰胺酶底物的合成途径。

图6：含有吲哚氧基发色团的酯酶和脂肪酶底物。

图7a：通过实例103和104的方法形成的x-gal、x-gluc肽聚糖和壳聚糖加合物。

图7b：通过实例103和104的方法形成的x-人、肽聚糖和壳聚糖加合物。

图7c：含有通过实例103的铃木产物与肽聚糖、壳聚糖或肽偶联的吲哚基发色团的酯酶底物。

图8：肽聚糖的羧甲基化和随后的衍生化的方案。

图9a：含有用于检测从感兴趣的器官(气道、血液、尿液等)发出的组织或体液中的感染的指示剂底物的管。所述管是pvc材料，用来自实例18的底物印刷的非织造物已经插入所述管中。

图9b：管插入物，所述管插入物被设计成容纳含有一种或多种底物的扁平滤纸系列，如来自实例10或18的底物与实例95的用作阳性对照(中心)的底物。

图9c：含有用作实例11的底物的载剂的聚烯烃内筒的管。这种材料用作空心圆柱体(右)的衬里。

图9d：以示例性方式使中空衬里适配pvc管。

图10a：含有来自实例10和18的指示剂底物的棒可以用于检测源自伤口负压处理的流体的反应。

图10b：相同的棒状格式可以用于监测气道或痰液的吸出物以检测初期感染。在此图像中，指示了响应于弹性蛋白酶或mpo的棒的校准。

图11：生产羧基二茂铁肽聚糖结合物的方案。

图12：硫酸盐、实例10和固蓝rr的产物。

图13：mpo的反应产物的实例和实例10和固蓝rr的产物。

具体实施方式

现在将在下文中更全面地描述各个方面。然而，这些方面可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于在此阐述的实施例；相反，提供这些实施例，使得本公开将彻底和完整，并且将向本领域的技术人员充分地传达其范围。

贯穿本公开，引用了各种专利、专利申请和出版物。这些专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其全部内容结合到本公开中，以便更全面地描述本公开日期之前本领域技术人员已知的现有技术。本公开将在所引用的专利、专利申请和出版物与本公开之间存在任何不一致的情况下进行管理。

i.定义

在提供值的范围的情况下，那个范围的上限和下限与在那个陈述范围内的任何其他所陈述的或中间值之间的每个中间值旨在被涵盖在本公开之内。例如，如果规定的范围为μ1m到μ8m，则旨在明确公开μ2m、μ3m、μ4m、μ5m、μ6m和μ7m以及大于或等于μ1m的值的范围以及小于或等于μ8m的值的范围。

除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数个指示物。因此，例如，提及“聚合物”包含单一聚合物以及两种或更多种相同或不同的聚合物，提及“赋形剂”包含单一赋形剂以及两种或更多种相同或不同的赋形剂等等。

紧接在数值之前的词“约”表示那个值的正负10％的范围，例如，“约50”表示45到55，“约25,000”表示22,500到27,500等，除非上下文本公开内容另有说明，或与此类解释不一致。例如，在如“约49、约50、约55”的数值列表中，“约50”表示延伸到小于前一值与后续值之间的间隔的一半的范围，例如，大于49.5到小于52.5。此外，鉴于本文提供的术语“约”的定义，应理解短语“小于约”值或“大于约”值。

“基本上”或“本质上”意指几乎完全或完全，例如，某些给定量的80％-95％或更高，例如，按重量或体积计至少85％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％、或更多％或所测量的任何其它参数。“基本上不含”是指几乎完全或完全不存在某些给定量，如以低于某些给定量的约1％到约20％的水平存在，例如按重量或体积计小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或更少％或所测量的任何其它参数。在一些实施例中，“基本上不含”是指以按药物组合物的重量计小于或等于的1到5％的水平存在。

ii.概述

本文提供了用于疗法和诊断伤口和伤口管理的组合物和系统，其中所述组合物在使用时表明原位伤口中存在升高的酶水平。

如本文所用，“伤口”是指组织结构的连续性或完整性的物理破坏。“伤口愈合”是指组织完整性的恢复。应该理解，这可以指组织完整性的部分或完全恢复。因此，伤口的治疗是指促进、改善、进展、加速或以其他方式进步与伤口愈合过程相关联的一个或多个阶段或过程。

伤口可以是急性的或慢性的。慢性伤口，包含压疮、静脉性腿部溃疡和糖尿病足溃疡，可以简单地被描述为无法愈合的伤口。虽然尚未完全了解慢性伤口的确切分子发病机制，但人们认为它是多因素的。由于急性损伤期间驻留细胞和迁移细胞的正常反应受损，因此这些伤口的特征在于延长的炎症反应、伤口细胞外基质(ecm)重塑缺陷和再上皮化失败。

伤口可以是任何内部伤口，例如维持皮肤的外部结构完整性，如瘀伤或内部溃疡，或外部伤口，特别是皮肤伤口，并且因此组织可以是任何内部或外部身体组织。在一个实施例中，组织是皮肤(如人皮肤)，即伤口是皮肤伤口，如真皮或表皮伤口。

人皮肤由两个不同的层组成，即表皮和真皮，其下面是皮下组织。皮肤的主要功能是保护内部器官和组织免受外部创伤和病原体感染、感觉和体温调节。大多数哺乳动物的皮肤组织结构相似。

皮肤的最外层即表皮厚约0.04mm，是无血管的，由四种细胞类型(角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞)组成，并且分层成若干上皮细胞层。表皮的最内层上皮层是底物膜，所述底物膜与真皮直接接触并将表皮锚定到所述真皮上。皮肤中发生的所有上皮细胞分裂发生在底物膜上。细胞分裂后，上皮细胞向表皮外表面迁移。在这种迁移过程中，细胞经历称为角质化的过程，由此细胞核丢失并且细胞转化为坚韧、平坦、抗性的非活细胞。当细胞到达最外层的表皮结构，即角质层、干燥、防水的鳞状细胞层时，迁移就完成了，这有助于防止下面的组织干燥。这层死亡的上皮细胞不断脱落，并被从底物膜移动到表面的角质化细胞取代。因为表皮上皮是无血管的，所以底物膜依赖于真皮的营养供应。

真皮是为表皮提供营养的高度血管化的组织层。此外，真皮含有神经末梢、淋巴管、胶原蛋白和结缔组织。真皮厚约0.5mm并且主要由成纤维细胞和巨噬细胞组成。这些细胞类型主要负责产生和维持胶原蛋白，胶原蛋白是在所有动物结缔组织包含皮肤中发现的蛋白质。胶原蛋白主要负责皮肤的弹性和弹性性质。在富含胶原蛋白的真皮下面发现的皮下组织为其上方的组织提供皮肤活动性、绝缘性、卡路里储存和血液。

伤口可以分为两大总体类别中的一种，即部分厚度伤口或全厚度伤口。部分厚度伤口局限于表皮和浅表真皮，对真皮血管没有损伤。全厚度伤口涉及真皮的破坏并延伸到更深的组织层，涉及真皮血管的破坏。部分厚度伤口的愈合通过上皮组织的简单再生发生。全厚度伤口的愈合更复杂。本文考虑的皮肤伤口可以是部分厚度或全厚度伤口。

本文考虑的伤口包含切口和撕裂伤、手术切口或伤口、穿刺、擦伤、划痕、压迫伤口、擦伤、摩擦伤口(例如，尿布疹、摩擦水疱)、褥疮溃疡(例如，压力或褥疮)；热效应伤口(由冷源和热源直接或通过传导、对流或辐射、以及电源造成的烧伤)、化学伤口(例如酸或碱烧伤)或致病性感染(例如，病毒、细菌或真菌)，其包含开放或完整的疖子、皮疹、瑕疵和痤疮、溃疡、慢性伤口(包含糖尿病相关的伤口，如小腿和足部溃疡、静脉性腿部溃疡和褥疮)、皮肤移植/移植供体和受体部位、免疫反应条件例如牛皮癣和湿疹、胃或肠溃疡、口腔伤口，包含口腔溃疡、软骨或骨质受损、截肢伤口和角膜病变。

化学实体及其组合物

本文描述的实施例提供了化学实体，其可以用于诊断和/或治疗慢性伤口。如本文所述的化学实体及其组合物用于检测哺乳动物伤口中一种或多种酶的水平的方法中。在一些实施例中，如本文所述的化学实体及其组合物用于诊断哺乳动物慢性伤口的方法中。在一些实施例中，本文所述的化学实体及其组合物用于诊断哺乳动物的感染伤口的方法中。在其它实施例中，本文所述的化学实体及其组合物用于治疗哺乳动物的伤口的方法中。在进一步的实施例中，本文所述的化学实体及其组合物用于治疗哺乳动物的感染或慢性伤口的方法中。

在其它实施例中，本文所述的化学实体及其组合物可以用于基于检测对一种或多种微生物具有特异性的生物标记物来诊断一种或多种致病微生物，例如细菌或病毒。

在一个实施例中，本文提供了能够检测来自体液的酶活性的化学实体，所述化学实体包含：锚区(a)；酶识别位点(r)和指示剂区(i)。在此实施例中，化学实体具有基本化学结构a-r-i(式i)，其中a是锚区；r是酶识别位点，并且i是指示剂区。

在一些实施例中，锚区(a)经由酶识别位点(r)与指示剂区(i)缔合。在此实施例中，酶识别位点是允许与酶结合的结构或基序。

在一个实施例中，酶识别位点(r)天然存在于锚区中。通过酶切割锚区的主链导致片段迁移，而所述片段进而可以变成酶的底物。

在另一个实施例中，酶识别位点(r)通过化学修饰引入锚区(a)。可替代地，酶识别位点(r)可以天然存在于指示剂区(i)中或通过一种或多种化学修饰合成引入指示剂区(i)。

在一个实施例中，式i的化学实体包括与指示剂(i)共价或非共价缔合的锚(a)，在这种情况下，识别位点(r)可以位于缔合部分(例如，通过共价键)中。如本领域所理解的，共价键涉及在键合的原子之间共享电子。相比之下，非共价键可以包含例如离子相互作用、静电相互作用、氢键相互作用、物理化学相互作用、范德华力、路易斯酸/路易斯碱相互作用或其组合。

在一个实施例中，锚a通过共价相互作用与指示物i缔合以形成识别位点r。在另一个实施例中，锚a通过共价相互作用与指示物i缔合，所述共价相互作用不是识别位点r的一部分。在第二个实施例中，r可以完全构成指示分子的一部分或构成指示剂区与之相关的单独基序或部分。

在一些实施例中，化学实体进一步包括酶不稳定区或酶反应性区。

在一个实施例中，识别位点(r)与选自由以下组成的组的一种或多种靶酶相互作用：脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶及其组合。在一些实施例中，酶不稳定区或酶反应性区与选自由以下组成的组的一种或多种靶酶相互作用：napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z；酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)、溶菌酶、髓过氧化物酶(mpo)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶和蛋白酶-3弹性蛋白酶、溶菌酶、酯酶、脂肪酶及其组合。

锚区(a)

在具有式i的化学实体的一些实施例中，锚区包括化合物，所述化合物是多糖、纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、肽聚糖、或壳聚糖、或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。

在一个实施例中，锚a包括选自羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、d-吡喃半乳糖苷或其衍生物的多糖。

在一个实施例中，锚a包括肽聚糖或其单体、其低聚物、其衍生物、其混合物或组合。如本领域所理解的，肽聚糖，也被称为胞壁质，是由糖和氨基酸组成的聚合物，所述聚合物在大多数细菌的质膜外形成网状层，从而形成例如细菌的细胞壁。糖组分由β-(1,4)连接的n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸的交替残基组成。与n-乙酰胞壁酸连接的是三到五个氨基酸的肽链。肽链可以与另一条链的肽链交联，从而形成3d网状层。

因此，在一个实施例中，肽聚糖可以包括选自n-乙酰葡糖胺(glcnac或nag)和n-乙酰胞壁酸(murnac或nam)或其组合的交替氨基糖的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个单元。肽聚糖，包含其较短片段，可以由天然或合成源产生。参见lee等人，《化学生物化学(chembiochem)》，11(18):2525-9,2010。

在另一个实施例中，锚a包括肽聚糖或多糖衍生物。实例肽聚糖包含肽聚糖盐、水溶性肽聚糖、羧化肽聚糖等。此类衍生物的代表性实例包含例如含有一个或多个羧甲基基团、羧乙基基团、羧丙基基团的肽聚糖，任选地包括一个或多个卤素、醇、酯或酰胺基团。其它具体实例包含包括一个或多个氯基团的卤代肽聚糖。在美国专利号5,017,359中描述了含有源自诺卡氏菌的细菌或细菌壁的肽聚糖的可溶性片段的可溶性肽聚糖和级分。

多糖衍生物包含例如羟乙基纤维素(hec)、羟丙基纤维素(hpc)、乙基羟乙基纤维素(ehec)、羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素(cmhec)、羟丙基羟乙基纤维素(hphec)、甲基纤维素(mc)、甲基羟丙基纤维素(mhpc)、甲基羟乙基纤维素(mhec)、羧甲基纤维素(cmc)、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(hpmc-as)、疏水改性羟乙基纤维素(hmhec)、疏水改性羟丙基纤维素(hmhpc)、疏水改性乙基羟乙基纤维素(hmehec)、疏水改性羧甲基羟乙基纤维素(hmcmhec)、疏水改性羟丙基羟乙基纤维素(hmhphec)、疏水改性甲基纤维素(hmmc)、疏水改性甲基羟丙基纤维素(hmmhpc)、疏水改性甲基羟乙基纤维素(hmmhec)、疏水改性羧甲基甲基纤维素(hmcmmc)、磺乙基纤维素(sec)、羟乙基磺乙基纤维素(hesec)、羟丙基磺乙基纤维素(hpsec)、甲基羟乙基磺乙基纤维素(mhesec)、甲基羟丙基磺乙基纤维素(mhpsec)、羟乙基羟丙基磺乙基纤维素(hehpsec)、羧甲基磺乙基纤维素(cmsec)、疏水改性磺乙基纤维素(hmsec)、疏水改性羟乙基磺乙基纤维素(hmhesec)、疏水改性羟丙基磺乙基纤维素(hmhpsec)或疏水改性羟乙基羟丙基磺乙基纤维素(hmhehpsec)。特别优选的纤维素衍生物是在水中具有热絮凝点的纤维素醚，如例如甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素和羟丙基纤维素。参见美国专利号8,465,586。

在一个实施例中，本文所用的“肽聚糖衍生物”和“多糖衍生物”包含肽聚糖或多糖的盐、酰胺、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或前体药物。本领域技术人员可以使用用于这种衍生化的已知方法容易地制备这类衍生物。在某些实施例中，衍生物可以施用于动物或人，而没有实质的毒性作用，并且是药学活性的或是前体药物。

在另一个实施例中，衍生物是肽聚糖或多糖化合物的盐，例如li⁺盐、na⁺盐、k⁺盐、rb⁺盐、mg²⁺盐、ca²⁺盐、sr²⁺盐或ba²⁺盐，优选na⁺盐、k⁺盐、mg²⁺盐、ca²⁺盐。此定义包含带电的肽聚糖或多糖的盐，如钠盐或钙盐。

在一些实施例中，衍生物锚定化合物是卤代锚定化合物，例如卤化多糖、卤代肽聚糖、卤代聚丙烯酸酯、卤代聚乙烯亚胺、卤代聚丙烯酰胺、卤代肽聚糖或卤代壳聚糖、或其单体，例如卤代n-乙酰氨基葡糖(glcnac或nag)和/或卤代n-乙酰胞壁酸(murnac或nam)。卤素选自由以下组成的组：cl、br、i；具体地，卤素是cl。

在一些实施例中，衍生化合物是锚定化合物的异构体。术语“异构体”包含具有相同分子式但分子中具有不同原子排列的化合物。在实施例中，化合物的异构体是化合物的“互变异构体”或“立体异构体”。术语“立体异构体”是指在一个或多个立体中心的手性方面不同的化合物。立体异构体包含对映异构体和非对映异构体。术语“互变异构体”是指质子位置不同的化合物的替代形式，如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体或锚定化合物的互变异构形式。

在一些实施例中，锚定化合物可以含有一种或多种前述化合物的组合或混合物。术语“组合”包含含有一种以上组分的化合物，所述化合物可以彼此结合或不结合。在一个实施例中，锚定化合物包括一种或多种前述化合物的组合，所述化合物例如通过共价或非共价相互作用彼此结合。作为具体实例，锚可以包括脱乙酰壳多糖和肽聚糖的组合。参见美国专利申请公开号2007/0167400。在另一个实施例中，混合物可以包括市售的肽聚糖和多糖混合物制剂(pg/ps；leelabsinc.，grayson，ga；参见美国专利号8,129,518)。

在一些实施例中，化合物包含上述聚合化合物的混合物。术语“混合物”是指两种或更多种物质混合在一起而不会发生它们将失去其单独性质的反应。例如，化合物a和化合物b的混合物可以含有化合物a和化合物b的任何重量比，使得混合物的总重量将为100％，例如化合物a/化合物b的重量比为99:1，或者化合物a/化合物b的重量比为1:99。典型的混合物可以含有约2种、3种、4种、5种或更多种上述聚合物化合物。

在一些实施例中，锚a进一步包括离子化学基团、具有亲水部分的材料、或具有疏水部分的材料，例如脂族链或脂族醇。在锚包括离子化学基团的实施例中，离子化学基团可以是带正电或带负电的。在一些实施例中，所述锚区包括用于共价连接到支持材料的反应性部分，如光活性苯基叠氮化物或环氧基团。参见美国专利申请公开号2016/0159777。

将反应性基团引入肽聚糖和/或其它糖苷化合物如多糖、纤维素、聚糖等的方法是本领域已知的。参见美国专利申请公开号2005/011261。

指示剂

在一些实施例中，化学实体包括一种或多种指示剂，例如，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多种指示剂。此类组合物可以包含例如与相同凝胶聚合物或不同凝胶聚合物结合的多个底物。

在某些实施例中，标记指示物。如本文所用，术语“标记”是指附着于表位结合剂或其它底物材料的任何物质，其中可通过检测方法检测到所述物质。合适标记的非限制性实例包含发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁剂、生物素、亲和素、链霉亲和素、蛋白质a、蛋白质g、抗体或其片段、多组氨酸、ni2+、flag标签、myc标签，重金属和酶(包含碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)。在实例中描述了将标记附着到锚定化合物上的方法。

在某些实施例中，指示剂用标记物标记，所述标记物是可检测标记物。可检测标记是部分，其存在可以被直接或间接确定。通常，标记的检测涉及产生可检测信号，如例如能量发射。标记可以具有化学、肽或核酸性质，但不限于此。所用标记的性质将取决于多种因素，包含所进行的分析的性质、所用能源和检测器的类型以及聚合物、分析物、探针和一级和二级分析物特异性结合配偶体的类型。

在具体实施例中，标记在空间上和化学上与其结合的成分(例如锚区)相容。特别地，标记的形状和大小不会妨碍酶识别位点(s)和/或酶反应区(r)。

在另一个实施例中，指示物或其中附着于锚的基序是脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、蛋白酶、内酰胺酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶或其组合的底物。

在一个实施例中，指示物或其中附着于锚的基序是蛋白酶的底物。特别地，指示物或其中附着于锚的基序是弹性蛋白酶的底物。

在另一个实施例中，指示物或其中附着于锚的基序是选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶3c或髓过氧化物酶(mao)或其组合。

在另一个实施例中，指示物或其中附着于锚的基序是糖苷酶的底物，所述糖苷酶是溶菌酶和选自由以下组成的组的蛋白酶：弹性蛋白酶、组织蛋白酶g或髓过氧化物酶(mao)或其组合。

在一些实施例中，酶不稳定区或酶反应性区与选自由以下组成的组的一种或多种靶酶相互作用：napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z；酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)、溶菌酶、髓过氧化物酶(mpo)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶和蛋白酶-3c。

在一个实施例中，指示剂(i)或其中附着于锚的基序是过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、氨基苯醚、吲哚氧基、中性染料、带电染料、纳米颗粒或胶体金颗粒。

在一些实施例中，指示剂(i)或其中附着于锚的基序是过氧化物酶底物。在一些实施例中，过氧化物酶底物选自对氨基苯酚、abts(2,2-苯酚,abts(底物，在一些实施例中，酸)二铵盐)、3,3'-二氨基联苯胺、3,4二氨基苯甲酸、dcpip、n,n-二甲基对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-(氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚基、靛蓝、固蓝rr、4-氯-7-硝基苯并呋咱。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是芳基胺。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是氨基酚。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是氨基苯酚醚。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是吲哚氧基。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是中性染料。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是带电染料。在一些实施例中，所述带电染料选自雷玛唑亮蓝、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是雷玛唑亮蓝、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是甲苯胺蓝。在一些实施例中，所述带电染料是反应性黑5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性紫5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。在一些实施例中，所述基于二氯三嗪的反应性染料呈现黑色。

在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是含有磺酰基乙基-硫酸氢盐-反应性基团的反应性染料。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5。在一些实施例中，所述反应性染料是雷玛唑亮蓝。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝或反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5或雷玛唑亮蓝。

在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是纳米颗粒。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是胶体金颗粒。在一些实施例中，指示剂(i)或与其连接的标记是带电染料、吲哚衍生物或鲁米诺衍生物。

具体地，指示物或其中附着于锚的基序包括含有磺酰基乙基硫酸氢酯反应性基团的染料，例如反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16或其组合；或含有二氯三嗪反应性基团的染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10或其组合。

锚-指示剂结合物

在各种酶中，锚a直接与指示剂i结合，例如通过糖苷键联。结合物的锚定部分选自由以下组成的组：例如肽聚糖或壳聚糖或多糖，并且指示剂i选自由以下组成的组：含磺酰基乙基硫酸氢酯反应性基团的染料或含二氯三嗪反应性基团的染料。

标记物

本文描述的实施例可以利用针对慢性或感染伤口中存在的各种生物学标记物测定的化学部分。在一个实施例中，标记物是伤口特异性标记物，所述伤口特异性标记物是选自由以下组成的酶：水解酶、蛋白酶、酯酶和过氧化物酶。

如本文所用，“伤口特异性酶”是在伤口中差异表达的酶。“差异表达”是指与其它位点例如正常组织或周围组织相比，伤口微环境中酶的水平或活性更高或更低。具体地，与正常或未受伤的组织相比，差异表达意味着伤口微环境中酶的更高水平的表达或活性。可以通过常规方法分析酶的差异表达。例如，可以通过elisa测定或其它免疫测定来分析样品中的酶水平。可以例如使用质谱或hplc通过测量底物的损失速率和/或产物的形成速率来分析酶的活性。这些技术是本领域已知的并且在实例部分中进行描述。

在一个实施例中，标记物是水解酶。如本文所用，“水解酶”或“水解的酶”是催化化学键水解的酶，例如酯酶和核酸酶(断裂酯键)；糖原酶(断裂糖苷接头)；肽酶(断肽键)等。

在一个具体实施例中，伤口特异性糖苷水解酶是溶菌酶。溶菌酶(uniprot登录号p61626[人]和p08905[小鼠])是一种糖苷水解酶，并且其主要功能是破坏细菌的细胞壁。它水解肽聚糖中的n-乙酰胞壁酸与n-乙酰-d-葡糖胺残基之间以及还有壳多糖中的n-乙酰-d-葡糖胺残基之间的(1→4)-β-键联。溶菌酶的天然底物是细菌细胞壁的肽聚糖层。然而，包含胞壁质降解产物以及合成化合物的各种各样的低分子量底物已用于各种光度、同位素和免疫学溶菌酶测定。等人，exs，75:105-10,1996。另见西格玛目录号m5639和西格玛目录号n8638。

在一个实施例中，化学部分的各个组分已经适合于通过伤口特异性水解酶识别，例如伤口特异性溶菌酶。

可替代地或另外地，可以修饰化学部分的各个组分以供其它伤口特异性酶识别。在一个实施例中，另外的伤口特异性酶是蛋白酶。如本文所用，“伤口特异性蛋白酶”是在伤口中差异表达的蛋白酶。“差异表达”是指与其它位点例如正常组织或周围组织相比，伤口微环境中蛋白酶的水平或活性更高或更低。具体地，与未受伤的组织相比，差异表达意味着伤口微环境中蛋白酶的更高水平的表达或活性。可以通过常规方法分析蛋白酶的差异表达。例如，可以通过elisa测定或其它免疫测定来分析样品中蛋白酶的水平。可以例如使用质谱或hplc通过测量肽底物的损失速率和/或产物的形成速率来分析蛋白酶的活性。这些技术是本领域已知的并且在实例部分中进行描述。

在一个实施例中，伤口特异性蛋白酶是组织蛋白酶g(uniprot登录号p08311[人]和p28293[小鼠])，其是储存在天青蛋白颗粒中的胰凝乳蛋白酶家族的三种丝氨酸蛋白酶之一。组织蛋白酶g特异性底物具有序列ala-ala-pro-phe或ala-ala-pro-met(西格玛奥德里奇(sigmaaldrich)目录号s7388和m7771)。

在另一个实施例中，伤口特异性蛋白酶是弹性蛋白酶(例如，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶或hne)(uniprot登录号p08246[人]和q3up87[小鼠])。hne是与胰凝乳蛋白酶在同一家族中的丝氨酸蛋白酶并且具有广泛的底物特异性。在炎症期间由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，它破坏细菌和宿主组织。在一个实施例中，用于检测hne的底物具有核心序列丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸(aapv)。在另一个实施例中，hne的底物是ala-pro-glu-glu-ile/met-arg-arg-gln(apeei/mrrq)(kasperkiewicz等人，pnasusa，111(7):2518–2523,2014；korkmaz等人，《分子生物学方法(methodsmolbiol.)》，844:125–138,2012)。

在一个实施例中，酶不稳定区包括对弹性蛋白酶不稳定的肽。在此实施例中，弹性蛋白酶的生色指示剂将是高对比度的，并且因此当在医药产品中原位使用时用作清楚的指示剂。

理想的第五将产生蓝色、紫色或深绿色。它也将固定在具有高周转率的空间允许位置。现有技术是相反的。可用的底物含有对硝基苯酚基团，所述对硝基苯酚基团具有低分子量但产生黄色可溶性发色团。大多数熟练的研究人员认为底物应该可溶于水，这是因为这是底物将进入活性位点的最可能方式。

相比之下，本文描述的实施例背离此一般原理。预期弹性蛋白酶消化固相底物，即结构蛋白，根据定义，所述结构蛋白是不可溶的，因此必须相应地适应对所述结构蛋白具有特异性的底物。这样，指示剂的颜色和它们可以采用的系统(例如电子检测)两者均适应伤口环境。

因此，与采用可溶性底物的现有技术教导相反，本文所述的实施例考虑使用产生蓝色、紫色或绿色的低水溶性弹性蛋白酶底物。

在仍另一个实施例中，伤口特异性酶是过氧化物酶，更具体地是髓过氧化物酶(mpo)。mpo(uniprot登录号p05164[人]和p11247[小鼠])是在中性粒细胞中发现的过氧化物酶。在存在过氧化氢(h2o2)和卤化物(最常见的氯化物)的情况下，它产生抗菌物质次氯酸盐、单线态氧(1o2)、氯(cl2)和羟基自由基(oh·)。可以使用四甲基联苯胺或4-苯甲酰氨基-2,5-二甲氧基苯胺检测mpo。参见andrews等人，《分析生物化学(analbiochem)》，127(2):346-50,1982；klebanoff等人，《白细胞生物学期刊(j.leukocytebiol》，77,598-625,2005。

在仍进一步的实施例中，伤口特异性酶是细菌酶，更具体地β-内酰胺酶(β-内酰胺酶)。β-内酰胺酶(登录号0008800)是由细菌(也称为青霉素酶)产生的水解酶(ec3.5.2.6)，所述水解酶为β-内酰胺抗生素如青霉素、头孢霉素和碳青霉烯(厄他培南)提供多重抗性。通过水解，内酰胺酶破坏β-内酰胺环开放。

在仍进一步的实施例中，伤口特异性酶是病毒酶，更具体地蛋白酶3c。这些蛋白酶由肠道病毒、鼻病毒、口疮病毒和心脏病毒编码，这些病毒属引起人和其它哺乳动物广泛感染。因此，蛋白酶3c可以用作伤口感染的标记物。

在仍进一步的实施例中，伤口特异性酶是mpo(uniprot登录号p05164[人]和p11247[小鼠])是在嗜中性粒细胞中发现的过氧化物酶。在存在过氧化氢(h2o2)和卤化物(最常见的氯化物)的情况下，它产生抗菌物质次氯酸盐、单线态氧(1o2)、氯(cl2)和羟基自由基(oh·)。可以使用四甲基联苯胺或4-苯甲酰氨基-2,5-二甲氧基苯胺检测mpo。参见andrews等人，《分析生物化学(analbiochem)》，127(2):346-50,1982；klebanoff等人，《白细胞生物学期刊(j.leukocytebiol》，77,598-625,2005

酶识别位点(r)

就本文公开的实施例涉及伤口特异性标记物的特异性检测而言，本文公开了含有用于伤口特异性标记物的酶识别位点(r)的底物。因此，在一个实施例中，化学部分包括锚区a或指示剂(i)，其包括伤口特异性酶的识别位点，例如酶裂解位点。

在一个实施例中，酶识别位点包括糖苷键。如本文所用，在糖类(或衍生自糖类的分子)的半缩醛或半缩酮基团与一些化合物例如醇的羟基之间形成“糖苷键”。含有糖苷键的物质是糖苷。术语“糖苷”现在扩展到也涵盖在半缩醛(或半缩酮)糖基团与羟基以外的若干化学基团之间形成键的化合物，如-sr(硫代糖苷)、-ser(硒代糖苷)、-nr1r2(n-糖苷)、或甚至-cr1r2r3(c-糖苷)。

在一个实施例中，本文公开的化学部分含有被糖基化酶切割的一个或多个糖苷键。在一个具体实施例中，化学部分包括直接或通过另一基团连接锚a和指示剂i的糖苷键。具体地，锚a和指示物i通过一个或多个糖苷键直接连接，在这种情况下，化学实体被糖原酶切割，并且因此可以用于检测糖原酶。

在一个实施例中，指示剂分子包括可酶促切割的肽，其包括肽键。如本文所用，“肽键”通过两个氨基酸之间的缩合反应形成，其中一个氨基酸的酸部分与另一个氨基酸的氨基部分反应以在两个氨基酸之间产生肽键(-co-nh-)。单个肽提供了基序以通过序列特异性蛋白酶进行识别。如本文所用，术语“序列特异性蛋白酶”是指识别肽的特异性序列以用于其消化的蛋白酶(例如，半胱天冬酶)，并且区别于从其一端依次分解肽或以序列非特异性方式消化肽的通用蛋白酶(例如，胰蛋白酶)。对于序列特异性，肽底物的氨基酸序列可以包括四个或更多个氨基酸(a.a.)残基。

如本文所用，术语“肽”包含包括直链或支链氨基酸的天然肽、肽模拟物、以及其药学上可接受的盐。通常，肽包括多个氨基酸残基，例如2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个或更多个氨基酸残基，所述氨基酸残基通过共价键例如肽键彼此键合。“氨基酸残基”是指掺入本公开的肽中的各个氨基酸单元。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的或合成的氨基酸以及与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸类似物、立体异构体和氨基酸模拟物。此定义包含天然氨基酸，如：(1)组氨酸(his)(2)异亮氨酸(ile)(3)亮氨酸(leu)(4)赖氨酸(lys)(5)蛋氨酸(met)(6)苯丙氨酸(phe)(7)苏氨酸(thr)(8)色氨酸(trp)(9)缬氨酸(val)(10)精氨酸(arg)(11)半胱氨酸(cys)(12)谷氨酰胺(gln)(13)甘氨酸(gly)(14)脯氨酸(pro)(15)丝氨酸(ser)(16)酪氨酸(tyr)(17)丙氨酸(ala)(18)天冬酰胺(asn)(19)天冬氨酸(asp)(20)谷氨酸(glu)(21)硒代半胱氨酸(sec)；包含非天然氨基酸：(a)瓜氨酸；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(gaba)；(d)鸟氨酸；(f)茶氨酸和氨基酸衍生物，如甜菜碱；左旋肉碱；肌肽肌酸；羟；羟脯氨酸；n-乙酰半胱氨酸；s-腺苷甲硫氨酸(sam-e)；牛磺酸；酪胺。其中，含有反应性侧链的氨基酸，例如半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸等，特别用于修饰底物。

在一些实施例中，化学实体含有用于检测伤口特异性酶的一个或多个酶不稳定区或酶反应性区(r)。

在一个实施例中，其中酶是糖苷酶如溶菌酶，酶不稳定区或酶反应性区包括至少3个葡糖胺或n-乙酰葡糖胺或肽聚糖单元的酰基壳聚糖，所述酰基壳聚糖任选被乙酰化。酶反应性位点可以含有例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、15个、20个或更多个单元的葡糖胺或n-乙酰葡糖胺或肽聚糖单元。在一个实施例中，r包括至少3个葡糖胺或n-乙酰葡糖胺或其组合，其中葡糖胺和/或n-乙酰葡糖胺任选地被乙酰化。在另一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽聚糖，其中肽聚糖任选地被乙酰化。

在一些实施例中，化学部分包括上文公开的一种或多种伤口特异性蛋白酶的酶反应性位点(r)，例如组织蛋白酶g、和髓过氧化物酶、弹性蛋白酶或其组合。如本文所用，术语“蛋白酶的反应性位点”是指包括蛋白质的氨基酸序列的肽，所述肽被蛋白酶识别为其蛋白酶活性的底物，例如作为可以切割成一个或更多个产物的底物。在一些实施例中，化学实体包括肽区，所述肽区包括肽序列，所述肽序列包括多个氨基酸。术语“多个”意指两个或更多个单元，例如多个氨基酸，尽管各个单元不需要在结构上和/或功能上不同。通常，化学实体的指示剂区(i)包括用作伤口特异性蛋白酶的酶反应性位点的肽。

在一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括对弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、髓过氧化物酶或其组合不稳定的肽。

在一个实施例中，酶不稳定区包括对弹性蛋白酶不稳定的肽。在此实施例中，弹性蛋白酶的生色指示剂将是高对比度的，并且因此当在医药产品中原位使用时用作清楚的指示剂。

理想的第五将产生蓝色、紫色或深绿色。它也将固定在具有高周转率的空间允许位置。现有技术是相反的。可用的底物含有对硝基苯酚基团，所述对硝基苯酚基团具有低分子量但产生黄色可溶性发色团。大多数熟练的研究人员认为底物应该可溶于水，这是因为这是底物将进入活性位点的最可能方式。

相比之下，本文描述的实施例背离此一般原理。预期弹性蛋白酶消化固相底物，即结构蛋白，根据定义，所述结构蛋白是不可溶的，因此必须相应地适应对所述结构蛋白具有特异性的底物。这样，指示剂的颜色和它们可以采用的系统(例如电子检测)两者均适应伤口环境。

因此，与采用可溶性底物的现有技术教导相反，本文所述的实施例考虑使用产生蓝色、紫色或绿色的低水溶性弹性蛋白酶底物。

肽序列通常被认为对蛋白酶底物很重要，然而，弹性蛋白酶具有非常普遍的水解潜力并且接受很多底物。这是因为它还参与许多组织中的抗微生物防御和免疫细胞移位。在这方面，它可以切割许多不同的肽。它在a、f、v或m与具有有限侧链复杂性的简单氨基酸之间切割良好。aapv、aapf、aaaa都是公认靶的实例。显而易见的是，随着n-端距离的增加，氨基酸起着不太重要的作用。在裂解位点的c端，没有明显的共识，然而，较少的复杂性是优选的。

在这种情况下更重要的是两个因素：

与锚的距离

发色团的性质

如果锚位点太近，则酶的作用受到抑制。因此，理想地，裂解位点与锚之间存在4个或更多个氨基酸。

发色团以及尤其其电荷是重要的。中性发色团优选地是带正电荷的部分，并且这些是优选的相对于带负电荷的发色团或染料。裂解位点附近的高密度负电荷抑制酶。因此，在使用负染料的情况下，它们优选地间隔2个或更多个氨基酸c-端形成裂解位点。

较长的氨基酸序列通常较少受阻，但它们也较不经济。

在一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyaapxy-z(seqidno:1)，

其中每个x独立地为任何氨基酸，

y各自独立地为0与200之间的整数，并且

z包括可检测标记。

在一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyaapxy-l-z(seqidno:2)，

其中每个x独立地为任何氨基酸，

y各自独立地为0与200之间的整数，并且

z包括可检测标记。

在另一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)，

其中每个x独立地为任何氨基酸，

y各自独立地为0与200之间的整数，并且

z包括可检测标记。

在又另一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)，

其中每个x独立地为任何氨基酸，

y各自独立地为0与200之间的整数，

l为连接部分，并且

z包括可检测标记。

在另一个具体实施例中，反应性区r包括肽序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)，其中x、l和z各自如上所述，并且y各自独立地为1到50的整数。

在仍进一步的实施例中，反应性区r包括肽序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)，其中x、l和z各自如上所述，并且y各自独立地为1到10的整数。

具体地，反应性区r包括肽序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)，其中x、l和z各自如上所述，并且y各自独立地为1到6的整数。

在一个实施例中，前述肽中的每一个包括序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)各自独立地对弹性蛋白酶不稳定。

在一些实施例中，例如用胺保护基团，例如芴基甲氧基羰基(fmoc)，保护氨基酸序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)中的一个或多个氨基酸。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括对组织蛋白酶g不稳定的肽。

在一个实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)，其中

x各自独立地为任何氨基酸；

y各自独立地为选自0到6的数字；

n⁴选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺；

n³选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和丝氨酸；

n²选自脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸；

n¹选自丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和蛋氨酸；并且

z包括可检测标记；并且肽对组织蛋白酶g不稳定。

在一些实施例中，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸受到保护。在一些实施例中，氨基酸序列中的一个或多个氨基酸用t-boc基团保护。在一些实施例中，所述氨基酸序列中的氨基酸之一用fmoc基团保护。

在一些实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括以下氨基酸序列：

xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)，其中

x各自独立地为任何氨基酸；

y各自独立地为选自0到6的数字；

n⁴选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺；

n³选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸和丝氨酸；

n²选自脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸；

n¹选自丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和蛋氨酸；并且

l为连接部分；并且

z包括可检测标记。

在一个实施例中，包括序列xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)和xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)的前述肽中的每一个各自独立地对组织蛋白酶g不稳定。

在一些实施例中，例如用胺保护基团，例如芴基甲氧基羰基(fmoc)，保护氨基酸序列xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)和xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)中的一个或多个氨基酸。

在一些实施例中，酶不稳定区或酶反应性区包括肽，所述肽包括氨基酸序列(a)xyuuuuy-z，其中x各自独立地为任何氨基酸；y各自独立地选自1到50的数字；u为选自levlfq的氨基酸，并且z是标记。具体地，在此实施例中，y是选自1到10的数字。

在一些实施例中，例如用t-boc基团或fmoc基团保护氨基酸序列(a)xyuuuuy-z中的一个或多个氨基酸。

在一些实施例中，氨基酸序列xyuuuuy-z对病毒3c蛋白酶不稳定。

可检测标记z

在一些实施例中，z为过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、氨基苯醚、吲哚氧基、中性染料、带电染料、纳米颗粒或胶体金颗粒。

在一些实施例中，z是过氧物酶底物，所述过氧物酶底物选自对氨基苯酚，abts(2,2苯酚，abts(过氧化物酶底物酸)二铵盐)的过氧化物酶底物、3,3'-二氨基联苯胺、3,4二氨基苯甲酸、dcpip、n,n-二甲基对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-(氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、吲哚基、靛蓝、固蓝rr、4-氯-7-硝基苯并呋咱。

在一些实施例中，z为芳基胺、氨基酚、氨基苯酚醚、吲哚基、中性染料、带电染料，所述带电染料选自雷玛唑亮蓝、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。具体地，z是选自雷玛唑亮蓝；甲苯胺蓝；反应性黑5或其水解或氨解衍生物的带电染料。

在一些实施例中，z是基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。在一些实施例中，所述基于二氯三嗪的反应性染料呈现黑色。在一些实施例中，z是含有磺酰基乙基-硫酸氢盐-反应性基团的反应性染料。

在一些实施例中，z是纳米颗粒。在一些实施例中，z是胶体金颗粒。

在一些实施例中，z是带电染料、吲哚衍生物或鲁米诺衍生物。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括苯酚、氨基酚、氨基苯基醚、吲哚氧基或醌。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括苯酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚醚。在一些实施例中，酶标记或酶反应性区包括吲哚氧基。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括醌。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区与髓过氧化物酶反应但不与血红素反应。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括过氧化物酶底物、芳胺、氨基酚、中性染料、带电染料、纳米颗粒或胶体金颗粒。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括过氧化物酶底物。在一些实施例中，过氧化物酶底物选自对氨基苯酚、abts(2,2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、3,3'-二氨基联苯胺、3,4二氨基苯甲酸、dcpip、n,n-二甲基对苯二胺、邻联茴香胺、对苯二胺、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺n-(4-(氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基邻苯二甲酰肼、5-氨基水杨酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和4-氯-7-硝基苯并呋咱、固蓝rr、n-(2-羟基)十四烷基-固蓝rr。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括芳胺。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括氨基酚。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括中性染料。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括带电染料。在一些实施例中，所述带电染料选自雷玛唑亮蓝、甲苯胺蓝、反应性黑5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5和反应性橙16、或这些中的每一种的水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是雷玛唑亮蓝、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是甲苯胺蓝。在一些实施例中，所述带电染料是反应性黑5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性紫5、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述带电染料是反应性橙16、或其水解或氨解衍生物。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括纳米颗粒。在一些实施例中，z是胶体金颗粒。

在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括带电染料、吲哚衍生物或鲁米诺衍生物。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括吲哚衍生物。在一些实施例中，所述酶不稳定区或所述酶反应性区包括鲁米诺衍生物。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在正常环境照明中呈现可见颜色变化的染料。在一些实施例中，所述染料具有针对伤口产物的对比色，所述伤口产物通常为红色、黄色或棕色。在另外的实施例中，所述染料是紫色、蓝色或深绿色。在一些实施例中，所述染料是紫色的。在一些实施例中，所述染料是蓝色的。在一些实施例中，所述染料是深绿色的。在一些实施例中，所述染料具有低分子量、是带电的、含有反应性或可连接基团、对γ辐射稳定、并且是深色的。在一些实施例中，所述染料选自cibracron系列染料、偶氮染料和雷玛唑染料、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述染料选自cibracron系列染料。在一些实施例中，所述染料选自偶氮染料。在一些实施例中，所述染料选自雷玛唑染料、或其水解或氨解衍生物。在一些实施例中，所述染料选自罗丹明、香豆素、花青、氧杂蒽、聚甲炔、芘、二吡咯甲烷、二氟萘、萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、多甲藻素-叶绿素蛋白、荧光素、6-fam、罗丹明、德克萨斯红、加州红、ifluor594、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6f、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、瀑布蓝、瀑布黄、香豆素、cy-chrome、dylight350、dylight405、dylight488、dylight549、dylight594、dylight633、dylight649、dylight680、dylight750、dylight800、藻红蛋白、percp(多甲藻素-叶绿素蛋白)、percp-cy5.5、joe(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)、ned、rox(5-(和-6-)-羧基-x-罗丹明)、hex、荧光黄、海蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、alexa350、alex430、alexa488、alexa532、alexa546、alexa568、alexa594、alexa633、alexa647、alexa660、alexa680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、fl、fl-br2、530/550、558/568、630/650、650/665、r6g、tmr、tr和二甲基氨基偶氮苯磺酸(dabsyl)、或其结合物、或其组合。

在一些实施例中，所述指示剂区包括基于二氯三嗪的反应性染料，如反应性蓝4、反应性红120、反应性蓝2、反应性绿19和反应性棕10。在一些实施例中，所述基于二氯三嗪的反应性染料呈现黑色。

在一些实施例中，所述指示剂区包括含有磺酰基乙基-硫酸氢盐-反应性基团的反应性染料的反应产物。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝、反应性紫5或反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5。在一些实施例中，所述反应性染料是雷玛唑亮蓝。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性橙16。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑色5、雷玛唑亮蓝或反应性紫5。在一些实施例中，所述反应性染料是反应性黑5或雷玛唑亮蓝。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在正常环境照明中呈现颜色变化的颗粒(例如，胶体金属或量子点)。在一些实施例中，所述指示剂区包括纳米颗粒。在一些实施例中，所述指示剂区包括胶体金颗粒。

在一些实施例中，所述指示剂区包括在uv光下呈现可见颜色变化的染料。在一些实施例中，所述指示剂区包括荧光染料。在一些实施例中，所述指示剂区包括发光的染料。

在一些实施例中，所述指示剂区包括酶反应性部分。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生肉眼可见或可通过电子手段检测的产物。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生肉眼可见的产物。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生可通过电子手段检测的产物。在一些实施例中，指示剂区包括吲哚氧基糖苷，根据所用的末端糖，所述吲哚氧基糖苷被己糖胺酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶或半乳糖苷酶切割以产生靛蓝。在一些实施例中，指示剂区包括被辅酶氧化以产生可见产物的苯酚。在一些实施例中，指示剂区包括被漆酶氧化以产生可见产物的苯酚。在一些实施例中，所述指示剂区包括可通过电子手段检测的金属基序。在一些实施例中，所述指示剂区包括可通过电子手段检测的二茂铁或二茂铁类似物。在一些实施例中，辅酶选自脂肪酶、酯酶、己糖胺酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖苷酶和漆酶。在一些实施例中，所述辅酶不存在于所述伤口流体中。在一些实施例中，所述辅酶存在于所述伤口流体中。在一些实施例中，所述酶反应性部分与辅酶相互作用以产生在uv光下可见的产物。

含有多个酶识别位点(r)的化学实体

在进一步的实施例中，本文公开了含有锚a、指示剂i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(r)。通常，这类化学实体用于测定多种酶，例如包括至少一种蛋白酶和至少一种糖苷酶的组合。

在一个实施例中，本文公开了含有锚a、指示物i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(r)，其中至少一个反应性位点对糖苷酶例如溶菌酶具有特异性；并且至少一个酶反应性位点对选自由以下组成的组的蛋白酶具有特异性：脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z；酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)、溶菌酶、髓过氧化物酶(mpo)、弹性蛋白酶、内酰胺酶、组织蛋白酶和蛋白酶-3c或其组合。先前已经描述了这些酶的各个反应性位点和识别位点。

在一个实施例中，本文公开了含有锚a、指示剂i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(r)，其中至少一个反应性位点对蛋白酶弹性蛋白酶具有特异性；并且至少一个酶反应性位点对选自由以下组成的组的蛋白酶具有特异性：髓过氧化物酶(mpo)、组织蛋白酶和蛋白酶-3c。先前已经描述了这些酶的各个反应性位点和识别位点。

在一个实施例中，本文公开了含有锚a、指示剂i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(r)，其中至少一个反应性位点对蛋白酶弹性蛋白酶具有特异性；并且至少一个酶反应性位点对选自由以下组成的组的微生物酶具有特异性：β-内酰胺酶和蛋白酶-3c。先前已经描述了这些酶的各个反应性位点和识别位点。

在一个实施例中，本文公开了含有锚a、指示剂i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(r)，其中至少一个反应性位点对蛋白酶弹性蛋白酶具有特异性；并且至少一个酶反应性位点对选自由以下组成的组的蛋白酶具有特异性：mpo。先前已经描述了这些酶的各个反应性位点和识别位点。

在一个实施例中，本文公开了含有锚a、指示剂i的化学实体，所述锚和所述指示剂单独或一起包括多个酶识别位点(s)和酶反应性位点(r)，其中至少一个反应性位点对蛋白酶弹性蛋白酶具有特异性；并且至少一个酶反应性位点对选自由以下组成的组的蛋白酶具有特异性：蛋白酶3c。先前已经描述了这些酶的各个反应性位点和识别位点。

由于采用酶底物组合具有更大的预测能力，可以预期，如上所述，与包括单一(例如，单个类型的)反应性位点和识别位点的实体(例如，单一的)相比，包括多个反应性位点和识别位点的化学实体的诊断效用将大大增强。至少包括多个反应/识别位点的实体将允许同时诊断至少2种、至少3种、至少4种或更多种标记物。举例来说，使用本文公开的多重化学实体，可以与病原体衍生的标记物(例如，β-内酰胺酶或病毒蛋白酶3c特异性反应性位点)同时检测和监测伤口部位的宿主弹性蛋白酶和/或mpo活性。

支持材料

在一些实施例中，化学实体的锚区(a)将化学实体与支持材料结合，例如通过共价相互作用、离子相互作用、疏水相互作用、静电相互作用、氢键相互作用、物理化学相互作用、范德华力、路易斯酸/路易斯碱相互作用或其组合。

在一些实施例中，支持基质包括与抗体、配体或表位标签共价偶联的葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅、合成聚合物或葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅或合成聚合物。

在一些实施例中，锚区是聚苯乙烯珠、硅胶珠、多糖珠、聚丙烯酰胺珠、纤维素珠、多糖、衍生化纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、uv可活化反应性基团、肽聚糖或壳聚糖衍生物、或其组合。在一些实施例中，所述锚区在短时间uv照射后与支持材料结合。

在一些实施例中，所述化学实体被印刷在支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，报告实体或化学实体化学结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示出所有尺寸类似的毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，所述化学实体离子结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。在一些实施例中，所述化学实体共价结合到支持材料上或支持材料中，如能够被伤口流体润湿并显示毛细管作用的滤纸或编织的或非编织的材料。所述支持材料包含但不限于纤维素，聚酰胺、聚酯、聚丙烯酸酯和可用作纤维的其它类似聚合物。在一些实施例中，所述支持材料是纤维素。在一些实施例中，所述支持材料是聚酰胺。在一些实施例中，所述支持材料是聚酯。在一些实施例中，所述支持材料是聚丙烯酸酯。

附加部分

在一些情况下，伤口的ph可能影响伤口愈合的许多因素，如血管生成、蛋白酶活性、氧释放和细菌毒性。慢性不愈合伤口可能具有升高的碱性环境。随着伤口朝着愈合进展，伤口的ph变为中性，并且然后变为酸性。监测伤口的ph可以提供评估伤口状况(例如，感染或无感染)的方法，并有助于确定伤口对治疗的反应。

因此，在一些实施例中，用于检测伤口感染的化学实体包括指示剂区，所述指示剂区包括呈现可见颜色变化的ph敏感性部分。在一个实施例中，ph敏感性部分在碱性ph下呈现可见的颜色变化，例如ph＝7.2到9.5；ph＝7.2到9.0；ph＝7.2到8.5；ph＝7.2到8.0；ph＝7.5到8.5；ph＝7.5到9.0；ph＝8.0到9.0。在其它实施例中，ph敏感性部分在以下ph值下呈现可见颜色变化：ph＝7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、或9.5或其0.1增量。

在一些实施例中，ph敏感性部分在中性ph范围下呈现可见颜色变化，例如在ph＝6.9、7.0或7.1或其0.05增量下。

在一些实施例中，ph敏感性部分在酸性ph下呈现可见颜色变化，例如ph＝4.5到6.8；ph＝4.5到6.5；ph＝5.0到6.8；ph＝5.4到6.8；ph＝5.4到6.5。在其它实施例中，ph敏感部分在以下ph值下呈现可见颜色变化：ph＝4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、或6.9、或其0.1增量。

在一些实施例中，ph敏感性部分选自由以下组成的组：溴百里酚蓝、酚红、溴酚红、氯酚红、百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫；硝嗪黄；和磺基酞菁染料或其组合。

组合物：

本文所述的实施例进一步涉及含有具有式i的化合物的组合物。可以使用常规方法制备这类组合物。

配制后，可以使用常规方法，例如使用载剂、胶凝剂，润肤剂、表面活性剂、保湿剂、粘度增强剂、乳化剂等，将所产生的具有式i的化合物的储备组合物进一步改性成期望形式，例如凝胶、香脂、乳液、乳膏、糊剂、软膏等，参见例如wo2013/004953。

用于组合物的载剂可以包含但不限于水、甘油、双甘油、甘油衍生物、二醇、二醇衍生物、糖、乙氧基化和/或丙氧基化酯和醚、尿素、pca钠、醇、乙醇、异丙基酒精及其组合。在一个实施例中，载剂是丙二醇。通常，组合物含有的载剂的量为：组合物重量的约1％到约99.9％、更典型地组合物重量的约2％到约95％、以及更典型地组合物重量的约5％到约90％。

热可逆胶凝剂定义为在高温(例如50℃)下在亲水性载剂中可溶、部分可溶或可混溶的成分，其中在冷却到25℃时，所述胶凝剂具有使载剂增稠的能力，但是当需要施加到底物上时，在50℃下粘度将降低。合适的亲水性载剂包含水、二醇，例如丙二醇。用于组合物的热可逆胶凝剂可以包含脂肪酸盐，如硬脂酸钠、棕榈酸钠、硬脂酸钾。这些盐可以添加到组合物中，或者可以通过添加脂肪酸并用适当的碱中和原位产生。原位形成组合物的实例提供硬脂酸和氢氧化钠以产生硬脂酸钠。其它常见的热可逆胶凝剂可以包含例如聚乙二醇和衍生物，如peg-20、peg-150二硬脂酸酯、peg-150季戊四醇四硬脂酸酯、二硬脂醇-75ipdi、二硬脂醇-100ipdi、脂肪醇，例如鲸蜡醇、脂肪酸，如硬脂酸、羟基硬脂酸及其衍生物及其组合。

除载剂和热可逆胶凝剂外，所述组合物可以含有各种其它成分和组分。可以包含在组合物内的其它成分的实例是润肤剂、甾醇或甾醇衍生物、天然和合成脂肪或油、粘度增强剂、流变改性剂、多元醇、表面活性剂、醇、酯、硅氧烷、粘土、淀粉、纤维素、颗粒、保湿剂、成膜剂、滑爽改性剂、表面改性剂、皮肤保护剂、保湿剂、防晒剂等。

药物组合物和/或制剂：

本文描述的实施例进一步涉及包括前述具有式i的化合物的一种或多种化合物和载剂的药物组合物和/或制剂。本文中采用的术语“药学上可接受的”指在正确医学判断的范围内适合于与人类和/或其它哺乳动物接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、盐、组合物、剂型等。在一些方面，“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或者列于美国药典或其它公认的药典中以用于哺乳动物(例如动物)以及更具体地用于人类。

药物组合物可以通过本领域已知的任何合适方法制备。此类组合物的实例包含适用于以下的那些组合物：(a)局部施用，例如，制品(例如，纱布、垫、拭子、敷料)、乳膏、软膏、凝胶、洗剂等；(b)肠胃外施用，例如皮下、作为无菌溶液或悬浮液肌肉内或静脉内注射；(c)口服施用、外用(例如浸液、包含水溶液和非水溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒、与饲料混合的粒料、涂覆于舌头的糊剂等。

在某些实施例中，药物组合物可以包括一种或多种抗生素剂。如本文所用，术语“抗生素”或“抗微生物剂”是指抑制或破坏微生物生长的物质。优选地，抗生素可用于抑制感染因子的毒性和/或治疗传染病。抗生素还指半合成物质，其中由微生物例如酵母或真菌产生的天然形式在结构上被修饰。

优选地，抗生素选自由以下组成的组：β-内酰胺类(包含β-内酰胺酶抑制剂和头孢菌素类)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和/或甘氨酰环素和/或多粘菌素。还可以采用抗微生物剂的任何组合，例如，至少一种β-内酰胺和至少一种氟喹诺酮；至少一种氨基糖苷类和一种头孢菌素；至少一种β-内酰胺和一种β-内酰胺酶抑制剂，任选地与氨基糖苷类等一起使用。

如本文所用，术语“β-内酰胺”抑制剂包含：天然和半合成青霉素和青霉素衍生物，例如苄星青霉素、苄青霉素(青霉素g)、苯氧基甲基青霉素(青霉素v)、普鲁卡因青霉素和苯唑西林；甲氧西林、双氯西林和氟氯西林；莫西林；阿莫西林和氨苄青霉素；阿洛西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林；比阿培南、多利培南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南和pz-601；头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟、头孢噻肟；头孢吡肟和头孢匹罗；头孢羟氨苄、头孢克肟、头孢丙烯、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟和头孢匹罗；头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑和氟罗沙芬；替吉莫南、诺卡菌素a和野火菌毒素；克拉维酸、拉氧头孢和氟氧头孢。氟喹诺酮类包含环丙沙星、加洛沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星和莫西沙星。氨基糖苷类包含例如卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、庆大霉素、西索米星、奈替米星、新霉素b、新霉素c、新霉素e(巴龙霉素)和链霉素，包含合成衍生物克拉霉素和阿奇霉素。四环素包含天然存在的化合物(例如，四环素、金霉素、土霉素、去甲环素)或半合成剂(例如，莱美环素、美洛环素、甲基环素、米诺环素、氢吡四环素)。甘氨酰环素(例如，米诺环素/替加环素)衍生自四环素。多粘菌素包含例如多粘菌素b和多粘菌素e(粘菌素)。

在某些实施例中，组合物可以含有以下浓度的抗生素：0.1mg/ml、0.5mg/l、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/m、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml或更多。例如，亚胺培南和厄他培南可以以50mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml、5mg/ml和1mg/ml的浓度使用。

伤口敷料：

在某些实施例中，本文公开了包括如本文所述的伤口敷料材料的伤口敷料，例如具有式i的化合物。在一些实施例中，伤口敷料基本上由如本文所述的伤口敷料材料组成，例如具有式i的化合物。

在一个实施例中，本文公开的伤口敷料是生物相容的、可生物降解的、非免疫原性的且易于商购的。

在一个实施例中，具有式i的化合物以颗粒的形式如纤维颗粒或粉末颗粒提供，任选地含有药物。特别地，所述材料优选地含有pg纤维。

所述组合物可以优选地包括敷料材料和其它化合物的紧密混合物。例如，在一个实施例中，紧密混合物包括敷料材料和如溶剂等合适载体的混合溶液或分散体、或通过从这种溶液或分散体中除去溶剂而制备的固体组合物。在此实施例中，敷料材料占材料重量的至少5％、更优选地至少10％、20％、30％、50％、75％、90％或更高％。在某些优选的实施例中，所述材料基本上由敷料材料组成。

所述材料的其它组分可以包含按重量计0％到25％，例如按重量计约1％到约20％的一种或多种其它生物相容性多糖，例如如海藻酸钠或藻酸钙等藻酸盐、如羧基乙酸淀粉钠等淀粉衍生物、如甲基纤维素或羧甲基纤维素等纤维素衍生物、或如透明质酸或其盐等糖胺聚糖、硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素。所述材料还可以包括按重量计至多约25％，例如按重量计约1％到约20％的选自由以下组成的组的一种或多种结构蛋白：纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白及其混合物。优选地，所述蛋白质包括胶原蛋白，并且更优选地，所述蛋白质基本上由胶原蛋白组成。所述材料还可以包括按重量计至多约20％的水，优选地按重量计约2％到约10％的水。所述材料还可以含有按重量计0％到40％的增塑剂，例如按重量计约5％到约25％，优选地如甘油或山梨糖醇等多元醇。

在某些实施例中，所述材料还可以包括按重量计至多约10％，例如按重量计约0.01％到约5％、典型地按重量计约0.1％到约2％的一种或多种治疗性伤口愈合剂，如非甾体抗炎药(例如对乙酰氨基酚)、类固醇、局部麻醉剂、抗微生物剂或生长因子(例如成纤维细胞生长因子或血小板衍生生长因子)。抗微生物剂可以例如包括防腐剂、抗生素或其混合物。优选的抗生素包含四环素、青霉素、土霉素、红霉素、杆菌肽、新霉素、多粘菌素b、莫匹罗星、克林霉素及其混合物。优选的防腐剂包含银，所述银包含胶体银、银盐，所述银盐包含构成所述材料的阴离子聚合物中的一种或多种的盐、磺胺嘧啶银、氯己定、聚维酮碘、三氯生、硫糖铝、季铵盐及其混合物。根据所公开的技术的这些含药伤口敷料材料在伤口敷料材料在使用中分解时提供治疗剂的持续释放。

所有上述百分比均以干重计。优选地，伤口敷料材料与其它助剂和材料的重量比为约1:99到约99:1。更优选地，重量比在约1:9到约9:1的范围内，更优选在约4:1到约1:4的范围内，仍更优选地在约2:1到约1:2的范围内。

所述材料可以呈任何方便的形式，如粉末、微球、薄片、垫子或薄膜。

在某些实施例中，所述材料呈半固体或凝胶软膏的形式以供局部施用。

在某些实施例中，所述材料呈冷冻干燥或溶剂干燥的生物可吸收海绵的形式以便施用于慢性伤口。优选地，海绵的平均孔径为10μm到500μm，更优选约100μm到300μm。通过冷冻干燥或溶剂干燥包括具有式i的化合物的水性分散体与合适的治疗剂一起制成合适的海绵。

在又其它实施例中，材料呈柔性薄膜的形式，所述柔性薄膜可以是连续的或中断的(例如穿孔的)。柔性薄膜优选地包括增塑剂以使其柔韧，如甘油。

具有一系列可控性质的两种凝胶形成聚合物例如纤维素衍生物的现成可用性意味着可以将所公开技术的组合物的性质控制到特别的程度。具体地，可以控制材料的生物吸收速率、孔隙率和密度。

在一个实施例中，本文提供了片状伤口敷料材料，其包括组合物的活性层，所述组合物包括具有式i的化合物。活性层通常将是使用中的伤口接触层，但在一些实施例中，可以通过液体可渗透的顶片将其与伤口分离。在一个实施例中，活性层的面积为约1cm²到约400cm²，具体地约4cm²到约100cm²。

在另一个实施例中，伤口敷料材料进一步包括背衬片，所述背衬片在与活性层的面向伤口侧相对的活性层上方延伸。优选地，背板比活性层大，使得宽度为1mm到50mm、优选地5mm到20mm的边缘区域围绕活性层延伸以形成所谓的岛状敷料。在这种情况下，背衬片优选地至少在其边缘区域涂有压敏医用级粘合剂。

在敷料材料包括背衬片的实施例中，背片基本上是液体不可渗透的。在另一个实施例中，背衬片是半透性的，例如，背衬片优选地可渗透水蒸气，但不能渗透液态水或伤口渗出物。优选地，背衬片还是微生物不可渗透的。在37.5℃下，在100％到10％的相对湿度差下，合适的连续贴合背衬片具有的背衬片的水蒸汽传输速率(mvtr)将优选地单独为300到5000g/m²/24小时，优选地500到2000g/m²/24小时。背衬片厚度优选地在10微米到1000微米的范围内，更优选地在100微米到500微米的范围内。

用于形成背衬片的合适聚合物包含聚氨酯和聚烷氧基烷基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯。优选地，背衬片包括主要为闭孔的高密度封闭聚氨酯泡沫的连续层。合适的背衬片材料是聚氨酯膜。

在包括含有粘合剂的背衬层的伤口敷料中，粘合剂层应该被水蒸气透过和/或图案化以允许水蒸气通过。粘合剂层优选地是常规用于岛型伤口敷料的连续水蒸气透过的压敏粘合剂层类型，例如基于丙烯酸酯共聚物、聚乙烯基乙醚和聚氨酯的压敏粘合剂。可以选择性地使用基于聚氨酯的压敏粘合剂。

在另一个实施例中，敷料可以包括可以在活性层与保护片之间构建的多层吸收制品的另外的层。例如，这些层可以包括有孔塑料薄膜以在使用中为活性层提供支持，在这种情况下，薄膜中的孔优选地与水凝胶层中的孔对齐。

更进一步地，在其它实施例中，敷料可以包括在活性层与保护片之间的吸收层，特别是如果敷料用于渗出伤口。任选的吸收层可以是常规用于吸收伤口愈合领域中的伤口流体、血清或血液的任何层，包含纱布、非织造织物、超吸收剂、水凝胶及其混合物。优选地，吸收层包括一层吸收泡沫，如开孔的亲水性聚氨酯泡沫。在其它实施例中，吸收层可以是非织造纤维网，例如粘胶短纤维的梳理网。

在某些实施例中，伤口敷料可以通过可移除的覆盖片保护。覆盖片通常由柔性热塑性材料形成。合适的材料包含聚酯和聚烯烃。优选地，覆盖片的面向粘合剂的表面是释放表面。也就是说，仅对活性层微弱粘附的表面和背衬片上的粘合剂有助于水凝胶层从覆盖片上剥离。例如，覆盖片可以由如含氟聚合物等非粘附性塑料形成，或者可以设置有释放涂层，如硅树脂或含氟聚合物剥离涂层。

在一个实施例中，伤口敷料是无菌的并且封装在微生物不可渗透的容器中。

试剂盒：

在某些实施例中，所公开的技术提供了试剂盒，所述试剂盒包括在一个或分开的隔室中任选地与赋形剂、载剂或油一起的具有式i的化合物。所述试剂盒可以进一步包括一个或多个隔室中的附加成分，例如胶凝剂、润肤剂、表面活性剂、保湿剂、粘度增强剂、乳化剂等。所述试剂盒可以任选地包括用于配制用于诊断、检测或治疗伤口例如慢性或感染伤口的制品的说明书。试剂盒还可以包括将组分单独或一起用于治疗伤口的说明书。

在相关实施例中，所公开的技术提供了包括包装和至少一个包括前述组合物的吸收制品(如上所述)的试剂盒。可替代地，试剂盒可以单独包括任选地与可用于包装或与包装一起使用的次要信息一起的单独组分。

本文公开的其它实施例涉及使用组合物制备用于治疗伤口的敷料的用途。优选地，伤口是慢性伤口，例如选自由以下组成的组的伤口：静脉溃疡、褥疮性溃疡和糖尿病性溃疡。

表面：

所公开技术的实施例进一步提供了包括前述具有式i的化合物的表面，其中所述报道分子或肽被朝向成允许与配偶体例如酶结合。优选地，表面是固体支持物的表面。许多不同的固体支持物是本领域技术人员已知的。有用的固体支持物包含天然聚合碳水化合物及其合成修饰的、交联的或取代的衍生物，如尤其具有硝酸和羧酸的琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，如包含交联或改性明胶的蛋白质和衍生物；天然碳氢化合物聚合物，如乳胶和橡胶；可以用合适的多孔结构制备的合成聚合物，如包含聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸酯的乙烯基聚合物、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，如聚酯、聚酰胺、以及其它聚合物，如聚氨酯或聚环氧化物；多孔无机材料，如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包含硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱金属和碱土金属的硅酸盐，铝和镁；和氧化铝或氧化硅或水合物，如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可以与上述聚合物材料用作过滤器)；以及上述类型的混合物或共聚物，如通过在预先存在的天然聚合物上初始化合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。

在一个实施例中，支持物是阵列板的孔，例如微阵列。用于构造此类阵列的方法是本领域已知的，例如，cao等人，《应用环境微生物学(applenvironmicrobiol)》，77(23):8219–8225,2011。可以一式三份地点样具有式i的每种化合物(或单独的肽指示剂)以消除由于阵列中的物理缺陷引起的不规则数据。

系统：

所公开技术的实施例进一步提供了包括前述组合物和/或试剂盒的诊断系统。

可以以各种形式提供诊断系统的各种部件。例如，具有式i的化合物(例如，含有肽报道分子的化合物)可以作为冻干试剂提供。这些冻干试剂可以在冻干前预先混合，以便在重构时它们形成完全混合物，其中每种组分的适当比例准备用于测定。此外，所公开技术的诊断系统可以含有用于重构试剂盒的冻干试剂的重构试剂。

核酸

在一个实施例中，本文中包含对以下肽进行编码的核酸：

xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)，其中x、y、n1、n2、n3、n4、l和z各自如上所述。

在一个实施例中，本文中包含对以下肽进行编码的核酸：xyuuuuy-z(seqidno:7)，其中x、y、u和z各自如上所述。

本文所用的短语“核酸”或“核酸序列”是指基因组或合成来源的dna或rna的寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任何片段，所述dna或rna可以是单链或双链的并且可以代表肽核酸(pna)或任何dna样或rna样材料的正义链或反义链。在此上下文中，“片段”是指那些长度大于约10个核苷酸的核酸序列，并且最优选长度为至少约40个核苷酸、至少约100个核苷酸或至少约300个核苷酸。

本文公开的实施例进一步涉及前述多核苷酸的变异体。

在一个实施例中，本文包含的是前述核酸的变异体，所述核酸包括与例如对以下肽进行编码的核酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高％同一性的核苷酸序列或可替代地由所述核苷酸序列组成：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)，其中x、y、n1、n2、n3、n4、l和z各自如上所述。

在一个实施例中，本文包含的是前述核酸的变异体，所述核酸包括与例如对以下肽进行编码的核酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高％同一性的核苷酸序列或可替代地由所述核苷酸序列组成：xyuuuuy-z(seqidno:7)，其中x、y、u和z各自如上所述。

本领域技术人员可以使用常规软件例如三对一序列操纵套件(其为每个输入的多肽序列产生三个潜在的核酸序列)来获得编码核酸序列。三对一软件可从生物信息学(.)组织免费获得。

短语“百分比同一性”或“％同一性”是指在两个或更多个氨基酸或核酸序列的比较中发现的序列相似性的百分比。可以通过电子方式确定百分比同一性，例如，通过使用megalign程序(lasergene软件包，dnastar)。megalign程序可以根据不同的方法例如clustal方法在两个或更多个序列之间产生比对。(higgins等人，《基因(gene)》73:237-244,1988)。clustal算法通过检查所有对之间的距离将序列分组为簇。簇成对排列，然后成组排列。通过将序列a的长度减去序列a中的缺口残基数减去序列b中的缺口残基数除以序列a与序列b之间的残基匹配总和来计算两个氨基酸序列例如序列a与序列b之间的百分比相似性，时间为一百。两个氨基酸序列之间的低同源性或无同源性的缺口不包含在确定百分比相似性中。核酸序列之间的同一性百分比也可以通过clustal方法或通过本领域已知的其它方法计算，例如jotunhein方法(参见例如，hein等人，(1990)《酶学方法(methodsenzymol)》，183:626-645)。序列之间的同一性也可以通过本领域已知的其它方法确定，例如通过改变杂交条件。

在另一个实施例中，本文包含的是变异体多核苷酸，所述变异体多核苷酸在严格杂交条件或较低严格条件下与一种或多种核酸分子杂交。如本文所用的术语“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。例如，在高严格条件下的杂交可以在约37℃到42℃下在约50％甲酰胺中发生。在约30℃到35℃下，在约35％至25％甲酰胺的降低的严格条件下可以发生杂交。具体地，杂交可以在高严格条件下在42℃下在50％甲酰胺、5×sspe、0.3％sds和200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子dna中发生。如上所述，杂交可在降低的严格条件下发生，但在35℃的降低温度下在35％甲酰胺中发生。通过计算关注核酸的嘌呤与嘧啶的比率并相应地调节温度，可以进一步缩小对应于特定严格性水平的温度范围。上述范围和条件的变化是本领域众所周知的。

如本文所用的术语“杂交复合物”是指通过在互补碱基之间形成氢键而在两个核酸序列之间形成的复合物。杂交复合物可以在溶液中形成或在溶液中存在的一个核酸序列与固定在固体支持物(例如，其核酸已经固定到纸、膜、滤膜、芯片、销钉或载玻片或任何其它合适的底物)上的另一个核酸序列之间形成。

在另一个实施例中，本文包含的是变异体，所述变异体是前述核酸的多核苷酸片段。

本文还包括的是与一种或多种核酸杂交的寡核苷酸，例如pcr引物。如本文所用，术语“寡核苷酸”是指具有至少约6个核苷酸到60个核苷酸、优选地约15个核苷酸到30个核苷酸、以及最优选地约20个核苷酸到25个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列可以用于pcr扩增或杂交测定或微阵列。如本文所用，术语“寡核苷酸”基本上等同于术语“扩增子”、“引物”、“寡聚物”和“探针”，因为通常在本领域中定义了这些术语。

本文还包含的是修饰的核酸，如pna。如本文所用，“肽核酸”(pna)是指反义分子或抗基因剂，所述反义分子或抗基因剂包括长度为至少约5个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与以赖氨酸结尾的氨基酸残基的肽骨架链接。末端赖氨酸赋予组合物溶解性。pna优选地结合互补的单链dna和rna并阻止转录物延伸，并且可以聚乙二醇化以延长它们在细胞中的寿命(参见例如，nielsen等人，(1993年)《抗癌药物设计(anticancerdrugdes)》，8:53-63)。

载体

本文还包含的是含有前述核酸中的一种或多种的载体。在一个实施例中，载体包括至少一种蛋白质编码核酸，例如对以下与一个或多个附加序列可操作地连接的多肽序列进行编码的核酸：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]或其酶可切割片段和/或其免疫原性片段。附加序列本质上可以是合成的。如本文所用，术语“可操作地关联”或“可操作地连接”是指功能相关的核酸序列。如果启动子控制编码的多肽的转录，则启动子与编码序列可操作地关联或可操作地连接。虽然可操作地关联或可操作地连接的核酸序列可以是连续的并且在阅读框中，但是某些遗传元件(例如阻遏基因)不与编码的多肽连续连接而仍与控制多肽表达的操纵基因序列结合。

密码子优化序列

本文包含的是前述核酸序列和载体的密码子优化序列。用于在宿主细胞(例如细菌，如大肠杆菌或昆虫hi5细胞)中表达的密码子优化可以使用可从爱荷华州科勒尔维尔的integrateddnatechnologies，inc.免费获得的密码子优化工具(codonopt)常规进行。

宿主细胞

本文包含的是含有前述核酸序列和载体的宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞能够在标准培养条件下重组表达载体中含有的基因序列以产生多肽产物，例如多肽序列xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]或其酶可切割片段和/或其免疫原性片段。在一个具体实施例中，宿主细胞是大肠杆菌。

多肽

在一个实施例中，本文包含的是包括以下氨基酸序列的多肽：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]。

在另一个实施例中，本文包含的是前述多肽的变异体，所述多肽包括与例如以下多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高％同一性的氨基酸序列或可替代地由所述多肽序列组成：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]。具体地，所述片段包括针对本文所述的酶的酶识别位点(r)的最小结构基序，例如溶菌酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、mao、蛋白酶3c或其组合。可替代地或另外地，片段肽是可被抗体或其抗原结合结构域识别的免疫原性分子。

同系物

在另一个实施例中，本文包含的是前述肽和多核苷酸的同系物。如本文所用，术语“同系物”是指一定程度的互补性。可能存在部分同源性或完全同源性。词语“同一性”可以代替词语“同源性”。至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列被称为“基本上同源的”。可以在严格性降低的条件下使用杂交测定(southern或northern印迹、溶液杂交等)检查完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或杂交探针将在严格性降低的条件下竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说严格性降低的条件是允许非特异性结合，因为降低的严格性条件要求两个序列彼此结合是特异性(即选择性)相互作用。可以通过使用缺乏甚至部分互补程度(例如，小于约30％同源性或同一性)的第二靶序列来测试不存在非特异性结合。在不存在非特异性结合的情况下，基本上同源的序列或探针将不与第二非互补靶序列杂交。

突变异体

在另一个实施例中，本文包含的是变异体肽，所述变异体肽包括以下核心多肽序列中的突变：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]或其酶可切割片段。

在一个实施例中，突变是1个氨基酸到3个氨基酸的取代、缺失、添加。优选地，突变不改变如此形成的突变肽中的酶识别位点。如果突变导致识别位点或裂解位点的组合物发生变化，则预期突变是由于保守的氨基酸取代造成的。

如本文所用的，词语“插入”或“添加”是指分别通过将一个或多个氨基酸残基或核苷酸添加到天然存在的分子中发现的序列而导致的氨基酸或核苷酸序列的变化。如本文所用，“取代”是指分别用不同的氨基酸或核苷酸取代一个或多个氨基酸或核苷酸。

抗体

本文公开的实施例进一步包含与上述免疫原性肽中的一种或多种特异性结合的抗体。

在一个实施例中，抗体与包括以下氨基酸序列的多肽结合：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]。在另一个实施例中，抗体与这些多肽的片段结合。本文考虑的是此类抗体的抗原结合片段，例如f(ab)结构域、f(ab)2结构域、scfv结构域，包含(使用例如相位展示技术)合成产生的抗体。

在一个实施例中，抗体与以下多肽序列结合：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u]或其酶可切割片段和/或其免疫原性片段。本文考虑的是此类抗体的抗原结合片段，例如f(ab)结构域、f(ab)2结构域、scfv结构域，包含(使用例如相位展示技术)合成产生的抗体。

纯化分子

本文包含的是纯化的生物分子，例如核酸、蛋白质、肽和/或抗体分子，包含其结合物。如本文所用，术语“基本上纯化的”是指从其天然环境中移除、且被隔离或分离并且至少约60％不含、优选地约75％不含、以及更优选地约90％不含与其天然关联的其它组分的核酸、氨基酸或抗体。

在本文所述的实施例中，可以通过与化学实体的各种组分例如锚区和/或指示剂区组合来改变生物分子，使得与任何天然对应物相比，它们的形式和/或功能显著改变。

制作式i化合物的方法：

本文提供的实施例进一步涉及制作包含其前体的式i化合物的方法。术语“前体”包含用作反应物以产生中间产物或最终产物的任何化合物。

在一个实施例中，本文提供了制作包括结构a-r-i的式i化合物的方法，其中a是如上所述的锚，并且i是如上所述的指示剂，所述方法包括使锚与指示剂分子结合，例如，通过共价键。在一个实施例中，如前所述，锚或指示剂可以包括伤口特异性标记物的识别位点(r)，例如伤口特异性酶，如水解酶，以及更具体地蛋白酶或糖苷酶。在此实施例中，伤口特异性标记物的底物包括例如可水解的底物，例如氨基酸、糖、肽、多糖、核酸、脂质、内酰胺或其组合。

在一个实施例中，锚通过肽键联、糖苷键联、酰胺键联、酯键联、醚键联、酸酐键联或类似键联与报道分子结合。如本文所用，“肽键”通过两个氨基酸之间的缩合反应形成，其中一个氨基酸的酸部分与另一个氨基酸的氨基部分反应以在两个氨基酸之间产生肽键(-co-nh-)。在一个实施例中，用伤口特异性蛋白酶，例如弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、蛋白酶c或mao或其组合，切割肽键。如本文所用，在糖类(或衍生自糖类的分子)的半缩醛或半缩酮基团与一些化合物例如醇的羟基之间形成“糖苷键”。在一个实施例中，用伤口特异性糖苷酶例如溶菌酶切割肽键。内酰胺键在酰胺和内酯之间形成并且在许多抗生素的核心结构中找到。在一个实施例中，内酰胺键被β-内酰胺酶切割。

用于结合反应性部分以产生糖苷、肽、酯、氧酯、酰胺、酰氨基、氧酰胺基、醚、磺酰基、亚磺酰基、磺酰胺或其它键联如烷氧基、烷硫基、烷基氨基等的方法是本领域已知的并且进一步在实例中进行描述。

在另一个实施例中，本文提供了制作包括结构a-i的式i化合物的方法，其中a和i各自如前所述。

在一个实施例中，a通过糖苷键联或肽键联与i结合。

在另一个实施例中，a通过亲水或疏水键联与i结合。

在一个实施例中，通过首先将锚区a与指示剂区i结合以产生式i化合物来合成具有结构a-i的式i化合物。

在另一个实施例中，首先通过基因重组技术合成指示物，例如在合适的宿主细胞中表达对指示剂区进行编码的核酸，并且将指示物与锚区结合。在此实施例中，在一个实例中，指示剂区被设计成含有与锚区结合的核酸序列，例如亲水或疏水。亲水相互作用的一个代表性实例包括使用含有极性基团的锚，例如与指示剂分子中的极性氨基酸相互作用的部分羧化糖或肽聚糖。疏水相互作用的另一个代表性实例包括使用含有非极性基团的锚，例如与指示器分子中的疏水性氨基酸残基相互作用的酰胺化或酯化的侧链(或其衍生物)。

在一个实施例中，可以通过宿主细胞表达系统合成肽指示剂，例如包括以下氨基酸序列的多肽：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u](包含变异体多肽)。这种方法可以包括例如：产生对上述多肽或变异体中的一种或多种进行编码的构建体；将所述构建体置于合适的载体中，例如质粒载体或杆状病毒载体；用载体转染宿主细胞，例如大肠杆菌或昆虫hi5细胞；在合适的条件下培养宿主细胞以允许表达所述载体；以及任选地从培养基中纯化表达的多肽。

在另一个实施例中，可以使用固相肽合成来合成肽指示剂，例如包括以下氨基酸序列的多肽：xyaapxy-z(seqidno:1)、xyaapxy-l-z(seqidno:2)、xyaap(v/f/a)xy-z(seqidno:3)或xyaap(v/f/a)xy-l-z(seqidno:4)；xyn⁴n³n²n¹xy-z(seqidno:5)或xyn⁴n³n²n¹xy-l-z(seqidno:6)或xyuuuuy-z(seqidno:7)[其中先前已经描述了x、y、n1-n4、l、z和u](包括变异体多肽)(参见merrifield等人，《美国化学学会期刊(j.am.chem.soc)》85(14):2149–2154)。

仍进一步地，具有结构a-r-i的式i化合物可以在单个反应室或多个反应室中合成。

诊断和治疗方法：

在一个实施例中，本文所述的组合物、敷料、制品、试剂盒和系统可用于诊断或治疗伤口，特别是慢性或感染的伤口。尽管可以诊断和/或治疗任何类型的伤口，但是这些实施例特别适用于诊断和治疗渗出伤口流体的伤口。例如，伤口可以是慢性或急性伤口。慢性伤口的代表性实例包含例如静脉溃疡、褥疮、褥疮性溃疡、糖尿病性溃疡和病因不明的慢性溃疡。急性伤口的代表性实例包含例如可能由有意的手术切口引起的急性创伤性撕裂。

如本文所用，术语“伤口流体”是指存在于伤口表面或通过抽吸、吸收或洗涤从伤口表面除去的任何伤口渗出物或其它流体(适当地基本上不包含血液)。对已经从患者身体除去的伤口流体进行适当的确定、测量或量化，但还可以在原位对伤口流体进行适当的确定、测量或量化。术语“伤口流体”通常不是指远离伤口部位的血液或组织血浆。伤口流体是哺乳动物伤口流体，合适地人伤口流体。

在一个实施例中，诊断方法包括：使伤口与至少一种包括式i或式ii化合物的组合物、包括这种化合物的敷料材料、包括这种材料或化合物的制品、包括这种材料或化合物的试剂盒、或包括这种材料或本文所描述的化合物的系统接触；以及测量与伤口相关联的参数。在具体实施例中，所测量的参数是伤口特异性水解酶的水平或活性。具体地，所测量的参数是水解酶的活性。

在前述实施例中，测量可以原位或非原位进行。如本文所用，术语“原位”是指在系统或装置的上下文内存在或发生的过程、事件、对象或部件，包含周围环境，例如与组合物、制品、系统或装置接触的生物材料。作为实例，原位反应可以指装置中存在的各种组分(例如，具有式i或式ii的化合物)的反应，包含由人皮肤组织提供的组分(例如，含有酶的伤口渗出物)。所述术语与非原位形成对比，非原位是指环境之外。

在第二实施例中，测量是非原位进行的，例如，从伤口移除流体以在所公开技术的设备或装置中进行分析。

适当地，测量是原位进行的。

在一个诊断实施例中，所述方法包括确定报道分子的水平，例如受伤口特异性酶作用的底物的产物。更具体地，所述方法包括确定水解酶产物的水平。如本文所用，术语“确定”包含测量所述水解酶的活性或水平的数值；确定活性或水平是否高于或低于预定范围；和/或将活性或水平的数值与对照标准进行比较。对照标准可以包括确定从未受伤部位或健康受试者获得的活检材料中的水解酶的水平或活性。

在一个具体实施例中，术语“确定”包括：测量选自以下的至少一种伤口特异性酶的参数(例如，活性或水平)：脂肪酶、酯酶、过氧化物酶、氧化酶、糖苷酶、葡糖醛酸酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、napsin(天冬氨酰蛋白酶)、葡糖神经酰胺酶葡糖醛酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶、组织蛋白酶a、b、d、g、l、s、z；酸性神经酰胺酶、乳铁蛋白(lf)、溶菌酶、髓过氧化物酶(mpo)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶和蛋白酶-3或其组合；确定所述参数是否超过第一预定阈值；和/或将参数的数值与对准标准进行比较。对照标准可以包括确定从未受伤部位或健康受试者获得的活检材料中的蛋白酶的参数。在相关实施例中，术语“确定”包括确定与多个上述蛋白酶相关联的参数的加权平均值(加权和)是否超过所述加权平均值的预定阈值。

在一个具体实施例中，参数是伤口流体中的分析物(例如蛋白酶)的活性水平。通常，单个分析物的活性以单位/ml来表达。

在另一个实施例中，参数是伤口流体中的分析物(例如蛋白酶)的水平。通常，术语量也表示特定分析物的活性。

当在本文中使用时，术语“组合量”或“组合活性”是指通过将数学函数应用于多个值而产生的单个数值，例如针对多个单独分析物获得的那些量。例如，术语“组合量”或“组合活性”可以指一组单独值的总和或乘积。通常，术语“组合量”或“组合活性”涉及一组单独值的总和。例如，在合适的实施例中，弹性蛋白酶的量是指弹性蛋白酶样活性(例如，u/ml)，并且金属蛋白酶(mmp)的量是指相应分析物的总浓度(例如，以ng/ml为单位)。

当在本文中使用时，术语“定量”是指在实验误差的范围内测量样品中的特定的一个或多个分析物或一个或多个底物的绝对数量。

术语“标记物”或“分析物”是指使用本文定义的设备、装置、试剂盒或方法识别或确定的任何化学实体。由所公开技术的设备、装置、试剂盒或方法确定或识别的标记物或分析物是上述酶的切割产物。

当在本文中使用时，术语“预定范围”是指技术人员将理解的数据范围或曲线指示患者的特定子类。例如，预定范围可以是将对特定伤口治疗如抗生素疗法反应良好的伤口的典型数据范围或曲线。可替代地，预定范围可以适当地指将对特定伤口治疗如抗生素疗法反应不佳的伤口的典型数据范围。

当在本文中使用时，术语“预定阈值”是指技术人员将基于对已知愈合和未愈合伤口确定的水平的统计分析确定的最小水平指示不愈合伤口，例如如上文进一步解释的。为使试验在临床上有用，应将阈值设定在适当的水平，以便正确识别具有高蛋白酶活性的未愈合伤口。增大阈值将增加仅未愈合伤口超过阈值的机会。然而，如果阈值太高，则由于高水平蛋白酶而不能愈合的伤口将不被识别，并且临床上这将意味着它们将不接受所需的蛋白酶调节治疗。

当在本文中使用时，术语“对照标准”或“对照”是指可以用作参考或比较的数据集或曲线，以便定义或标准化另一数据点或数据集。例如，术语“对照”或“对照标准”可以是指示患者的特定子类的数据集或曲线。适当地，对照标准可以是指示愈合或未愈合伤口状态的数据集或曲线。

适当地，在所公开技术的其它方面或实施例中，“对照”或“对照标准”可以是可以用作比较工具的数据集或曲线，以允许技术人员确定伤口是否可能对伤口治疗如抗生素疗法有反应或无反应。在一个实施例中，对照标准是指示对伤口治疗反应不佳的患者的数据集或曲线。通常，对照标准是指示对伤口治疗反应良好的患者的数据集或曲线。如本文所公开的，倾向于对伤口治疗反应良好的患者表现出比不易对治疗反应良好的患者更低的水解酶组合量或活性。例如，如本文所公开的，倾向于对伤口治疗反应良好的患者表现出对至少一种伤口特异性水解酶较低的组合量。

在一个实施例中，阈值人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性为约5u/ml到约30u/ml，包括其间的所有值，例如约6u/ml、约7u/ml、约8u/ml、约9u/ml、约10u/ml、约11u/ml、约12u/ml、约13u/ml、约14u/ml、约15u/ml、约16u/ml、约17u/ml、约18u/ml、约19u/ml、约20u/ml、约21u/ml、约22u/ml、约23u/ml、约24u/ml、约25u/ml或更多指示慢性伤口感染。

在一个具体实施例中，至少9.6的阈值人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性水平指示慢性伤口感染。在一些实施例中，至少22.9u/ml的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性水平指示慢性伤口感染。

在一个实施例中，约1000u/ml到约10000u/ml的阈值溶菌酶活性水平指示慢性伤口感染，包含其间的所有值，例如约1100u/ml、约1200u/ml、约1300u/ml、约1400u/ml、约1500u/ml、约1600u/ml、约1700u/ml、约1800u/ml、约1900u/ml、约2000u/ml、约2100u/ml、约2200u/ml、约2300u/ml、约2400u/ml、约2500u/ml、约2600u/ml、约2700u/ml、约2800u/ml、约2900u/ml、约3000u/ml、约3250u/ml、约3500u/ml、约3750u/ml、约4000u/ml、约4250u/ml、约4500u/ml、约4750u/ml、约5000u/ml、约5250u/ml、约5500u/ml、约5750u/ml、约6000u/ml或更多。在一个具体实施例中，至少4800u/ml的溶菌酶活性水平指示慢性伤口感染。

在一个实施例中，约10u/ml到约100u/ml的阈值组织蛋白酶g活性水平指示慢性伤口感染，包含其间的所有值，例如约15u/ml、约20u/ml、约25u/ml、约30u/ml、约35u/ml、约40u/ml、约45u/ml、约50u/ml、约55u/ml、约60u/ml、约65u/ml、约70u/ml、约75u/ml、约80u/ml、约85u/ml、约90u/ml、约95u/ml、约100u/ml、约110u/ml、约120u/ml或更多。在一些实施例中，至少50u/ml、至少40u/ml、至少30u/ml、至少20u/ml、至少15u/ml或至少10u/ml的组织蛋白酶g活性水平指示慢性伤口感染。

本文公开的实施例进一步涉及使用本文所述的组合物、材料、制品、敷料、试剂盒和/或系统治疗慢性或感染的伤口。治疗实施例包含使所公开技术的组合物、材料、制品、敷料、试剂盒、系统或装置与有需要的受试者接触。任选地，所述方法可以包含确定受试者是否对治疗有反应。

技术人员将能够容易地识别伤口是否“对治疗有反应”。具体地，本领域技术人员将能够容易地确定本发明权利要求中识别的蛋白酶水平，所述蛋白酶水平预测或指示对伤口治疗，特别地对用包括氧化纤维素的伤口敷料进行的治疗反应良好或反应不佳。本文所用的术语“反应性”和“一个或多个反应者”是指被认为对伤口治疗，特别是对用药理学药剂例如抗生素进行的治疗反应良好的伤口。类似地，“无反应性”和“无反应者”是指不被认为对伤口治疗，特别是对用药理学药剂例如抗生素进行的治疗反应良好的伤口。例如，在伤口治疗4周后表现出优于50％伤口闭合的患者被认为对所述治疗有反应。

在某些实施例中，可以用本文所述的组合物、制品、系统或装置同时对患者进行诊断和治疗。当在本文中使用时，术语“同时”意指一起执行所述目标，例如诊断和治疗。

在某些实施例中，可以用本文所述的组合物、制品、系统或装置依次对患者进行诊断和治疗。当在本文中使用时，术语“依次”是指所陈述的目标例如诊断和治疗在时间上或空间上是分离的，例如治疗前诊断或治疗后诊断或其组合，例如第¹次诊断＝＝>治疗＝＝>第²次诊断。

本文描述的实施例进一步使护理人员或患者能够快速且可靠地确定伤口是否可能是未愈合的，并且基于此确定选择适当的疗法。例如，未愈合的伤口可能需要涂覆特殊的伤口敷料，如包括特定治疗剂的伤口敷料，以促进愈合。相应地，本文描述的实施例进一步提供了治疗伤口例如慢性或感染伤口的方法，所述方法包括：确定伤口是愈合的还是未愈合的，如果伤口是未愈合的，然后将包括治疗剂的伤口辅料涂覆到伤口上。

本文描述的实施例提供了用于诊断或检测感染伤口的方法和测定。所述方法适用于检测细菌感染剂。在一个实施例中，伤口被革兰氏阴性细菌感染。典型的革兰氏阴性细菌包含变形菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和螺杆菌、以及蓝细菌。当与药物结合分类时，它们包含引起呼吸系统紊乱的铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌、引起泌尿系统紊乱的大肠杆菌和奇异变形杆菌、以及引起消化系统紊乱的幽门螺杆菌和芽孢杆菌、以及微球菌，如脑膜炎奈瑟氏球菌、卡他莫拉菌和淋病奈瑟菌。

在另一个实施例中，伤口被革兰氏阳性细菌感染。“革兰氏阳性细菌”是指其细胞壁中含有磷壁酸(例如，脂磷壁酸和/或壁磷壁酸)或功能等同的糖聚合物(例如，鼠李糖多糖、糖醛酸磷壁酸、阿拉伯半乳聚糖、脂甘露聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖)的一种细菌或多种细菌。功能等同的糖聚合物的非限制性实例描述于weidenmaier等人，《自然(nature)》，6:276-287,2008中。

细菌包含感染哺乳动物宿主(例如，牛、鼠、马、灵长类动物、猫科动物、犬科动物和人类宿主)的致病菌。这种致病细菌的实例包含例如细菌物类的成员，例如拟杆菌、梭菌、链球菌、葡萄球菌、假单胞菌、嗜血杆菌、军团菌、分枝杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌或李斯特菌。在人类宿主中引起疾病的致病菌的一些临床相关实例包含但不限于：炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、空肠弯曲杆菌、衣原体肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、耐万古霉素粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、产肠毒素大肠杆菌(etec)、肠致病性大肠杆菌、大肠杆菌o157:h7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特氏菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、立克次体立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vsa)、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。

在另一个实施例中，感染性细菌选自由以下组成的组：艰难梭菌、耐碳青霉烯类肠杆菌科(cr-克雷白氏杆菌属；cr-大肠杆菌)和淋病奈瑟氏球菌。在另一个实施例中，感染性细菌选自由以下组成的组：多药耐药性不动杆菌、耐药性弯曲杆菌、产生广谱β-内酰胺酶(esbl)的肠杆菌科细菌、耐万古霉素肠球菌、多药耐药性铜绿假单胞菌、耐药性非伤寒沙门氏菌、耐药沙门氏菌肠炎沙门氏菌、耐药志贺氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐药肺炎链球菌和耐药结核病。在另一个实施例中，感染性细菌选自由以下组成的组：耐万古霉素金黄色葡萄球菌、红霉素耐药a组链球菌、克林霉素耐药b组链球菌。

在某些实施例中，在宿主受试者中发现慢性或感染伤口。优选地，宿主是哺乳动物，例如啮齿动物、人、家畜、伴侣动物或非驯养或野生动物。在一个实施例中，受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施例中，受试者可以是家畜。合适的家畜动物的非限制性实例可以包含猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在又另一个实施例中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可以包含宠物，如狗、猫、兔和鸟。在又另一个实施例中，受试者可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”是指可以在动物园中发现的动物。这种动物可以包含非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在示例性实施例中，受试者是人。

在一方面，本文提供了检测哺乳动物伤口中的一种或多种酶的水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将本文所述的伤口敷料材料与哺乳动物伤口接触；(b)在视觉上将与哺乳动物伤口接触的伤口敷料材料与一个或多个参考样品进行比较；以及(c)获得与哺乳动物伤口接触的伤口敷料材料中的报道分子的浓度的定性确定。

优选地，诊断和治疗是原位进行的。因此，本文描述的实施例允许以容易、非侵入性方式诊断和治疗伤口。例如，可以实时进行诊断，并且可以将治疗应用于受感染的伤口或患者(全身)，并且实时监测伤口治疗的进展，例如，由于伤口愈合导致由报道分子生成的信号消散。

另一方面，本文提供了使用化学实体检测伤口中蛋白酶活性的方法，其中所述化学实体包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：锚区、酶不稳定区或酶反应区、以及指示剂区。在另一个方面，所述方法包括将mpo、弹性蛋白酶、溶菌酶、磷脂酶和过氧化氢酶的底物置于固体表面上，使得任何反应对眼睛都是可见的。在另一方面，所述方法用于评估各种各样的体液，包含伤口流体、泪液、玻璃体流体、csf、气道抽吸物或痰液、滑液、血液、血浆、血清、尿液、腹膜液、间质液、皮下积液、胆汁、肠液或类似流体，通过使其与含有底物的材料接触并随后评估底物的变化。

另一方面，本文提供了检测气道中感染的方法，其包括通过特定取样或通过与通气装置的长期接触使化学实体与来自感染器官的流体接触。

实例

本文描述的结构、材料、组合物和方法旨在是代表性实例，并且应当理解，本公开的范围不受实例的范围限制。本领域技术人员将认识到，可以使用所公开的结构、材料、组合物和方法的变化来实践实施例和所公开的技术，并且这种变化被认为是在本公开的范围内。

取决于最后一步，所有离子化合物被处理和分离成具有各种抗衡离子的盐，并且未进一步说明。

通过在dmf中与乙醇胺反应并在405nm1nnaoh中定量释放的硝基苯酚，将聚对硝基苯基丙烯酸酯的“分子量”确定为虚拟分子量。虚拟分子量＝材料/反应性位点的g。

“h-rbb”是指雷玛唑亮蓝与氨反应的产物(参见实例29)，“rbb”是指相应的自由基末端，“h-”在化合物名称中是指氢，而不是组氨酸；“正常条件”是指无防潮或防氧保护措施的室温、大气压；肽片段通过本领域技术人员已知的常规方法合成；通过单字母代码描述任何肽；然而，单个字母也可以指杂原子；“cv”表示双-(4-二甲基氨基苯基)-(4-[n-哌嗪基]苯基)-碳鎓离子、结晶紫的衍生物。

实例1.fmoc-aapv-吲哚酯

通过粉末漏斗将fmoc-aapv-oh(43.47g，75.12mmol)和cdi(14.62g，90.19mmol)直接称重到500ml圆底烧瓶中。将dcm(干燥，120ml)直接添加到烧瓶中，使用额外的dcm(干燥，30ml)洗涤粉末漏斗并将其也添加到烧瓶中。将混合物在氩气氛下在室温搅拌15分钟，并且然后额外的45分钟，同时使氩气通过混合物。然后使用粉末漏斗一次性添加吲哚氧基；用的dcm(干燥的10ml)洗涤漏斗，所述dcm也被添加到反应混合物中。在使氩气通过反应混合物的同时在室温下持续搅拌1小时，然后添加额外的dcm(干燥，20ml)并在室温下搅拌，同时使氩气通过混合物持续10分钟。之后在氩气氛下在室温下搅拌混合物过夜。用滤纸使反应混合物通过布氏漏斗过滤并填充到分液漏斗中。用dcm(30ml)洗涤反应烧瓶，也通过布氏漏斗过滤洗涤的dcm，并也将其填充到分液漏斗中。将水(350ml)添加到分液漏斗中；提取后，收集有机相。用丙酮洗涤分液漏斗直到不再洗掉颜色，然后用水完全装满并再次倒空。将有机相重新填充到分液漏斗中并再次用水(350ml)洗涤。相分离后，将有机相收集在干净的锥形瓶中、干燥(na2so4，40.56g)并浓缩至干燥。将粗产物悬浮在二乙醚(600ml)中并在室温下搅拌2小时。通过玻璃熔块滤出固体。一些固体粘在烧瓶上；将其溶于dcm(50ml)中、浓缩至干燥并添加到剩余固体中。将所有固体重新悬浮在二乙醚(600ml)中并在室温下搅拌过夜。之后再次通过玻璃熔块滤出固体。将粘附在烧瓶上的固体溶解在dcm(50ml)中、浓缩至干燥并与剩余固体混合。将产物保持在室温下用带孔的滤纸覆盖7天，并且然后在油泵(室温，2小时，0.008毫巴)下干燥，以产生41.4g(79.4％)产物。

实例2.fmoc-aapv-5-溴-4-氯-吲哚酯

将fmoc-aapv-oh(117mg，0.20mmol)和cdi(39mg，0.24mmol)溶解在dcm(干燥，3ml)中并在氩气氛下在室温下搅拌5分钟。然后在一次性添加5-溴-4-氯-吲哚氧基(50mg，0.20mmol)之前，将混合物在室温下搅拌5分钟，同时使氩气通过混合物。持续使氩气通过混合物5分钟，添加额外的dcm(干燥，2ml)并在氩气氛下在室温下搅拌混合物3.5小时。之后将反应混合物浓缩至干燥并在氩气氛下在冰箱中储存18天。将粗产物进行色谱分离：15.8g硅胶、洗脱液：dcm中2％meoh。获得仍被污染的蓝色固体(42mg)。对产物进行第二次色谱分离：13.7g硅胶、洗脱液：起始洗脱液etoac/环己烷(3:1，200ml)变为纯etoac。获得几乎无色的固体(32mg)。esi-ms(正)：[m+h]⁺：805、[m+na]⁺：828、[m+k]⁺：844

实例3fmoc-aaapv-吲哚氧基酯

在氩气氛下在室温下，将fmoc-aaapv-oh(361mg，0.56mmol)和hobt·h2o(127mg，0.94mmol)溶解在dcm(3ml)中。添加了dipea(190μl，0.90mmol)和edci·hcl(179mg，0.93mmol)。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌2小时。然后一次性添加吲哚氧基(55mg，0.41mmol)，同时使氩气通过所述混合物。持续使氩气通过反应混合物5分钟以上；然后添加额外的dcm(2ml)并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。添加dcm(20ml)并提取水性饱和混合物。添加nahco3(用于加速相分离，添加盐水(5ml))。用盐水(15ml)洗涤有机相、干燥(na2so4)并浓缩至干燥。以dcm作为溶剂开始，通过柱色谱(15.0g硅胶，40μm到63μm)纯化粗产物。用dcm对柱进行洗脱，直到所有蓝色和粉红色都从柱上洗掉。然后将洗脱液更换为dcm中5％meoh。收集无色产物(88mg)和略带粉红色(污染的)固体(49mg)。

实例4：fmoc-aaapv-(n-乙酰基)-吲哚基酯

在氩气氛下在室温下将fmoc-aaapv-oh(305mg，0.428mmol)和hobt·h2o(97.5mg，0.47mmol)溶解在dmf(2ml)中。5分钟后，添加dipea(145.6μl，0.86mmol)和edci·hcl(138mg，0.72mmol)。在氩气氛下在室温下将混合物搅拌1小时(混合物1)。并行地，在氩气氛下在室温下将吲哚乙酸乙酯(50mg，0.285mmol)溶解在dmf(2ml)中。在添加naome(15mg，0.270mmol)之前使氩气通过溶液5分钟。继续使氩气通过混合物额外20分钟(混合物2)。在几秒钟内将混合物1添加到混合物2中。将氩气流吹扫通过反应混合物2小时，然后将混合物在氩气氛下搅拌过夜。将混合物浓缩至干燥，重新溶解在etoac(50ml)中，用水性饱和的nahco3(2×30ml)、水(1×20ml)和盐水(1×30ml)进行洗涤。使有机相干燥(na2so4)并浓缩至干燥。通过柱色谱(15.0g硅胶，40μm到63μm，洗脱液：dcm)纯化粗产物，以产生33mg固体产物。esi-ms(正)：[m+h]⁺：807；[m+na]⁺：829。

实例5：fmoc-aapv-3-吲哚酰胺

在氩气氛下在室温下，将fmoc-aaapv-oh和hobt*h2o溶解在25ml二颈圆底烧瓶中的dcm(干燥)中。添加dipea和edci*hcl。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌1小时；然后使氩气通过混合物5分钟。一次性添加1h-吲哚-3-胺，并使氩气通过混合物5分钟。然后添加额外的dcm(干燥，2ml)并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌2小时。添加dcm(25ml)并将混合物用饱和nahco3-溶胶(饱和的)提取；提取后，用盐水(20ml)洗涤有机相。用etoac(30ml)提取合并的水相。(tlc的etoac和dcm相，dcm中5％meoh：etoac：一个点；dcm3个点)。干燥两个有机相(na2so4)并分别浓缩至干燥。以dcm作为溶剂开始，通过柱色谱法纯化来自dcm相的粗产物。用dcm对柱进行冲洗，直到所有蓝色和粉红色都从柱上洗掉。然后将洗脱液更换为dcm中5％meoh。收集：34mg的棕色固体esi-ms(正)：[m+h]⁺：764；[m+na]⁺：786。

实例6：fmoc-aapv-4-甲氧基-1-萘酚酯

在氩气氛下在室温下，将fmoc-aapv-oh(169mg，0.29mmol)和cdi(59mg，0.36mmol)溶解在dcm(干燥，3ml)中。10分钟后，添加4-甲氧基-1-萘酚(50mg，0.29mmol)，将溶液在室温下搅拌45分钟。添加dcm(30ml)和水(20ml)；提取后，用na2so4干燥有机相并浓缩至干燥。通过柱色谱(洗脱液：dcm中5％meoh)纯化粗产物，以产生58mg的米色固体。esi-ms(正)：[m+h]⁺：735；[m+na]⁺：757。

实例7：fmoc-aapv-1-萘酚酯

将fmoc-aapv-oh(241mg，0.42mmol)和hobt*h2o(107mg，0.70mmol)悬浮于dcm(干燥，4ml)中。5分钟后，添加dipea(119μl，0.70mol)和edci*hcl(134mg，0.7mmol)。然后一次性添加1-萘酚(50mg，0.35mmol)，并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过周末。添加dcm(20ml)和水(20ml)并提取混合物。由于相分离是非常缓慢的，因此添加盐水溶液(10ml)并再次提取混合物。使有机相干燥(na2so4)并浓缩至干燥。通过柱色谱(洗脱液：dcm中5％meoh)纯化粗产物，以产生106mg产物。esi-ms(正)：[m+h]⁺：705；[m+na]⁺：727。

实例8.fmoc-aapv-(2-萘酚)

合成：在氩气氛下在室温下，将fmoc-aapv-oh(241mg，0.42mmol)和hobt*h2o(107mg，0.42mmol)悬浮于干燥dcm(3ml)中。5分钟后，添加dipea(119μl，0.7mmol)和edci*hcl(134mg，0.7mmol)，将溶液在室温下搅拌45分钟。然后一次性添加2-萘酚(50mg，0.35mmol)，并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌2小时。添加dcm(30ml)和水(30ml)；提取后，用盐水(30ml)洗涤有机相，用na2so4进行干燥并浓缩至干燥，以产生250mg几乎无色的固体。为了纯化，将粗产物在短硅胶柱上进行闪蒸，洗脱液：dcm中5％meoh。产率：168mg无色固体(68％)。esi-ms(正)[m+h]^-：853。

实例9：甲基-3-fmoc-aapv-酰胺-4-氨基苯甲酸酯和甲基-3-氨基-4-fmoc-aapv-酰胺基苯甲酸酯

在氩气氛下在室温下，将fmoc-aapv-oh(214mg，0.37mmol)和hobt*h2o(91mg，0.6mmol)悬浮于干燥dcm(干燥，2ml)中。5分钟后，添加dipea(105μl，0.6mmol)和edci*hcl(115mg，0.6mmol)，将溶液在室温下搅拌45分钟。然后一次性添加甲基-3,4-二氨基苯甲酸甲酯(50mg，0.3mmol)，随后添加额外的dcm(干燥，1ml)，并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。添加dcm(20ml)和水(10ml)；提取后，用饱和nacl溶胶(10ml)洗涤有机相，用na2so4干燥并浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱纯化粗产物。洗脱液：以2％meoh/dcm(约120ml)开始，然后改变为dcm中5％meoh。产率：97mg的含有两种异构体的混合物和10mg的异构体中的仅一种。esi-ms(正)：[m+h]⁺：727；[m+na]⁺：749。

实例10.n-(1-[2-羟基]十四烷基酯)固蓝rr(n-4-(1,3-二甲氧基-2-n-苯甲酰苯基)-n`-外消旋-(2-羟基-正十四烷基)-胺)

将固蓝rr染料(7.3mmol)置于3颈圆底烧瓶中，并且在环境温度下溶解于氯仿(30ml)中，同时搅拌(磁力搅拌器，500rpm)。30分钟后搅拌添加1,2-环氧十四烷(11mmol)，随后用硫酸(催化剂)处理。将温度升至回流并持续搅拌12小时。当在过程对照(esi-ms(+p))中表明原材料完全消耗时，将任何固体滤出并在空气流中干燥。需要若干个重结晶步骤(乙醇)以获得足够纯净形式的期望产物。产率：600mg，esi-ms(正模式)[m+h]⁺：485。

实例11.fmoc-aaapv-(二氨基苯甲酸)

用dmf(5ml)溶解fmoc-aaapv-oh(710mg)。随后添加hobt(210mg)和dcc(240mg)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。用dmf(1ml)溶解3,4-二氨基苯甲酸(160mg)和吡啶(100μl)并在搅拌下添加到反应混合物中。14小时后，蒸发溶剂，并通过硅胶色谱法用含有0.5％甲酸的环己烷/dcm/甲醇(4/2/1)纯化残余物，以得到400mg产物。esi-ms(正)[m+h]＝784。

实例12.fmoc-aapf-吲哚酯

将fmoc-aapf-oh(994mg，1.59mmol)和cdi(308mg，1.90mmol)溶解在干燥dcm(4ml)中。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌10分钟以及额外的20分钟，同时使氩气通过混合物，随后添加额外的dcm(干燥，2ml)。在使氩气通过反应混合物的同时持续搅拌2分钟，然后一次性添加吲哚氧基(208mg，1.56mmol)。在使氩气通过溶液的同时持续搅拌15分钟，之后添加额外的dcm(干燥，2ml)并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。将反应混合物填充到分液漏斗中，用dcm(20ml)洗涤烧瓶，并将洗涤-dcm也添加到分液漏斗中。用水(30ml)洗涤混合物，并将有机相与有机相和水相之间的一些浆液一起收集。再次用水(30ml)洗涤有机相，用na2so4进行干燥并浓缩至干燥。将粗产物悬浮在et2o(50ml)中并在室温下搅拌90分钟。然后滤出固体并重新悬浮在新鲜的et2o(40ml)中并在室温下搅拌过夜。滤出固体并在油泵中干燥，以产生444mg(38％)产物。

esi-ms(正)：[m+h]⁺：742；[m+na]⁺：764

实例13：fmoc-aaa-吲哚氧基酯

将fmoc-aaa-oh(103mg，0.52mmol)和cdi(102mg，0.23mmol)溶解在dcm(干燥，6ml)中。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌15分钟以及额外的10分钟，同时使氩气通过所述混合物。然后一次性添加吲哚氧基(30mg，0.23mmol)。在使氩气通过混合物的同时持续搅拌10分钟，之后添加额外的dcm(干燥，2ml)并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。用水洗涤反应混合物(介于有机相与水相之间的大量固体)。收集有机相，再次用水洗涤，用na2so4进行干燥并浓缩至干燥(仅33mg)。

将粗产物溶于et2o(5ml)中并摇动2分钟。倾析液体，并且可以获得7mg(5％)期望产物。

[m+na]⁺：591

实例14：fmoc-aapa-吲哚氧基酯

将fmoc-aapa-oh(285mg，0.52mmol)和cdi(102mg，0.63mmol)溶解在25ml双颈圆底烧瓶中的dcm(干燥，5ml)中(用热风枪加热，同时在氩气氛下抽空并冷却)。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌5分钟以及额外的10分钟，同时使氩气通过混合物。然后一次性添加吲哚氧基(71mg，0.53mmol)。在使氩气通过混合物的同时持续搅拌15分钟，之后添加额外的dcm(干燥，2ml)并将其在氩气氛下在室温下搅拌两天。将混合物转移到分液漏斗中并用水洗涤两次。用na2so4干燥有机相并浓缩至干燥。将粗产物溶于et2o(20ml)中并在室温下搅拌30分钟。然后通过硅胶柱色谱法(洗脱液：dcm中2％meoh)纯化以得到25mg(7％)期望产物。

esi-ms(正)：[m+na]⁺：688

实例15.fmoc-v-吲哚基酯

将fmoc-v-oh(501mg，1.48mmol)和cdi(291mg，1.79mmol)溶解在dcm(干燥，6ml)中。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌10分钟以及额外的10分钟，同时使氩气通过混合物。然后添加额外的dcm(干燥，2ml)，随后一次性添加吲哚氧基(199mg，1.49mmol)。在使氩气通过混合物的同时持续搅拌混合物10分钟，之后添加额外的dcm(干燥，2ml)并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。用水洗涤反应混合物两次，用na2so4进行干燥并浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱纯化粗产物。

洗脱液：以dcm开始(在压力下用dcm洗涤柱直到所有蓝色和粉红色都从柱上洗掉)，然后将洗脱液变为dcm中5％meoh。

所述产物以第一个有色级分进入色谱柱。

用作为洗脱液的dcm第二次对产物进行色谱分离。

收集的是级分：25-35(130mg)

36-44(92mg)

45-52(81mg)

总产率：222mg(33％)

由于只有级分36-44产生可称重的固体，因此将这些级分用于测试。

[m+na]⁺：477

实例16：fmoc-aaaa-吲哚氧基酯

将fmoc-aaaa-oh(503mg，0.95mmol)和cdi(191mg，1.18mmol)悬浮于dcm(干燥，10ml)中。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌10分钟以及额外的10分钟，同时使氩气通过混合物。然后一次性添加吲哚氧基(125mg，0.94mmol)，随后添加额外的dcm(干燥，5ml)。在使氩气通过混合物的同时在室温下持续搅拌15分钟，之后再次添加额外的dcm(干燥，5ml)，并在使氩气通过混合物的同时持续搅拌另外两分钟。然后，将反应混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。由于将所有溶剂蒸发过夜，因此添加dcm(25ml)并在用水(2×25ml)洗涤混合物之前将混合物在室温下搅拌5分钟。用na2so4干燥有机相并浓缩至干燥。仅获得57mg粗产物。由于大量固体保持在水相中，因此将此固体滤出并干燥。将此固体与上面获得的57mg合并。将合并的固体悬浮于et2o(20ml)中并在室温下搅拌过夜。滤出固体并得到229mg(39％)含产物和原材料(fmoca-a-a-a-oh)的固体

[m+h]⁺：640；[m+na]⁺：662

实例17：fmoc-apv-吲哚基酯

将fmoc-apv-oh(482mg，0.92mmol)和cdi(191mg，1.18mmol)溶解于dcm(干燥，10ml)中。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌10分钟以及额外的10分钟，同时使氩气通过混合物。然后一次性添加吲哚氧基(125mg，0.94mmol)，随后添加额外的dcm(干燥，5ml)。在使氩气通过混合物的同时在室温下持续搅拌15分钟，之后再次添加额外的dcm(干燥，5ml)，并在使氩气通过反应混合物的同时持续搅拌2分钟，并且然后将反应混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。用水(2×20ml)洗涤反应混合物，用na2so4干燥有机相并浓缩至干燥。将粗产物悬浮于et2o(20ml)中并在室温下搅拌2小时。只剩下粘附到烧瓶上的少量固体。倾析液体并收集固体(76mg，17％)

[m+na]⁺：645

实例18：fmoc-phe-吲哚氧基酯

将fmoc-phe-oh(2.9g，7.5mmol)和cdi(1.47g，9.0mmol)直接称重到100ml三颈圆底烧瓶中。添加dcm(干燥，50ml)，将混合物在室温下搅拌5分钟，然后在室温下搅拌10分钟，同时使氩气通过混合物。之后添加额外的dcm(干燥，4ml)，随后添加吲哚氧基(1.00g，7.6mmol)。在使氩气流通过混合物的同时在室温下持续搅拌30分钟。然后添加额外的dcm(干燥，10ml)，并再次将混合物在室温下(与氩气流)搅拌20分钟。最后在氩气氛下在室温下搅拌过夜。将反应混合物填充到分液漏斗中，用dcm(30ml)洗涤烧瓶，并将洗涤-dcm也填充到分液漏斗中。添加水(100ml)，提取后收集有机相并重新填充到干净的分液漏斗中。再次用水(100ml)洗涤有机相，干燥(na2so4)并浓缩至干燥。将粗产物溶于乙醚(100ml)中进行纯化。由于其完全溶解，因此将其再次浓缩至干燥并通过硅胶柱色谱法(洗脱液：dcm)纯化。收集：级分：

28和29：152mg

22-27

30-48

将级分22-27浓缩至干燥。然后添加dcm(20ml)以溶解一些蓝色。滤出固体、再溶解并再次浓缩至干燥以产生132mg产物。

将滤液与级分30-48合并，从而产生1.00g不纯产物。总产率：1.284g(26.5％)

[m+na]⁺：525

实例19：ac-phe-吲哚氧基酯

将ac-phe-oh(1.55g，7.5mmol)和cdi直接称重到100ml三颈圆底烧瓶中。添加50ml的干燥dcm8，并将混合物在室温下搅拌5分钟。然后在使氩气通过混合物的同时在室温下搅拌15分钟。15分钟后添加吲哚氧基(1.01g，7.6mmol)。在使氩气通过混合物的同时持续搅拌20分钟。此时添加更多的dcm(干燥，5ml)并持续(与氩气流)搅拌23分钟。再次添加dcm(干燥，8ml)并在室温下(与氩气流)搅拌5分钟。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。将混合物填充到分液漏斗中，用dcm(20ml)洗涤烧瓶，所述dcm也被填充到分液漏斗中。用水(80ml)洗涤后，收集有机相并重新填充到干净的分液漏斗中。再次用水洗涤混合物，收集有机相、干燥(na2so4)并浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱纯化粗产物。洗脱液：以dcm(在压力下)开始直到洗掉大部分蓝色和粉红色，然后将溶剂变为dcm中2％meoh，并在无压力下继续色谱法。仅收集了几乎纯的级分：196mg(8％)。

[m+na]⁺：345

实例20：fmoc-f-v-t(bzl)-f-

将fmoc-f-v-t(bzl)-f-oh(1.228mg，1.49mmol)悬浮于dcm(干燥，10ml)中。添加cdi(291mg，1.79mmol)，将混合物在室温下搅拌10分钟，并在室温下另外搅拌15分钟，同时使氩气通过混合物。添加dcm(干燥，3ml)并在一次性添加吲哚基(200mg，1.50mmol)之前将混合物在室温下(与氩气流)搅拌另外两分钟。将混合物在室温下(与氩气流)一起搅拌45分钟。之后添加额外的dcm(干燥，8ml)并在除去氩气管之前将混合物在室温下再搅拌5分钟，并将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。添加dcm(20ml)，滤出剩余的蓝色固体并用dcm(20ml)洗涤。将滤液填充到分液漏斗中并用水洗涤两次。使有机相干燥(na2so4)并浓缩至干燥。将粗产物溶解于dcm(7ml)中并添加乙醚(20ml)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后滤出沉淀物(58mg，5％)并用乙醚(20ml)洗涤。

[m+na]⁺：962

实例21：β-内酰胺吲哚醚

将吲哚氧基(327mg，2.46mmol)称重到25ml三颈圆底烧瓶中(用热风枪将烧瓶真空加热并在氩气氛下冷却)。添加thf(干燥，6ml)并在使氩气流过混合物的同时在室温下搅拌混合物10分钟。然后一次性添加叔丁醇钾(228mg，2.03mmol)，并在室温下与永久氩气流一起持续搅拌15分钟。此时，一次性添加4-甲氧基苄基-3-氯甲基-7-(2-苯基乙酰氨基)-3-头孢烯-4-羧酸酯(1.01g，2.05mmol)。在室温下将混合物与稳定氩气流一起持续另外搅拌30分钟。通过esi-ms检测产物。esi-ms(正)：[m+na]+＝606；[m+k]+＝622。

实例22.n-(炔丙基)-(rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r、1,3-偶极[3+2]环加成(“点击化学”)的染料结合物

合成：雷玛唑亮蓝r与炔丙基胺盐酸盐的反应是在正常条件下在饱和水性nahco3中进行的。用esi-ms(-p)进行反应监测。用乙酸乙酯从水相提取产物，并以足够的纯度进行沉淀以用于随后的反应(1,3-偶极[2+3]-环加成)。esi-ms(负)[m-h]^-：538。

实例23.fmoc保护试剂(fmoc-v-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺)(fmoc-v-三唑-rbb)

使用点击化学条件(胡宁氏碱、铜催化)使实例22与fmoc-缬氨酸-n-(2-羟基-3-叠氮基丙基,酰胺反应。反应产物用于下面的另外实例中。

实例24.h-v-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(h-v-三唑-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物。

合成：在正常条件下进行fmoc保护的试剂(fmoc-v-三唑-rbb，实例23)与哌啶在甲醇溶液中的反应。用esi-ms(-p)进行反应监测。在真空干燥后沉淀的具有足够纯度的产物用于随后的反应(酰胺化)。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：753。

实例25.fmoc-aapvav-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(fmoc-aapvav-三唑-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1.2当量)处理dcm中的五肽fmoc-aapva-oh(1当量)和hobt·h2o(1.2当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-v-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(1当量；实例24)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单除去挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约83％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1385。

实例26.fmoc-aapv-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(fmoc-aapv-三唑-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1.2当量)处理dcm中的三肽fmoc-aap-oh(1当量)和hobt·h2o(1.2当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-v-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(1当量；实例24)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。水性后处理产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约90％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1214。

实例27.h-aapvav-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(h-aapvav-三唑-rbb)

基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapvav-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(1当量；实例25)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1162。

实例28.h-aapv-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺)(h-aapv-三唑-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapv-{2-羟基-3-[1-(5-(n-rbb-甲基)1,2,3-三唑基)}丙酰胺(1当量；实例26)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：992。

实例29.rbb-胺(h-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于胺化/酰胺化的原材料的染料结合物

合成：在正常条件下进行雷玛唑亮蓝r与氢氧化铵溶液的反应，在冰浴中初始冷却。通过esi-ms(-p)对反应进行监测。从水相滤出产物并以足够的纯度进行沉淀以用于随后的反应(酰胺化)。产率：>64％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：500。

实例30.(rbb)-氨基-fmoc-丙氨酸(fmoc-a-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物。

合成：在正常条件下在乙醇中进行h-rbb(实例29)与fmoc-丙氨酸五氟苯酯的反应。用esi-ms(-p)进行反应监测。用二氯甲烷(dcm)从水相提取产物，并在真空干燥后以足够纯度进行沉淀以用于随后的反应(脱保护/酰胺化)。产率：>90％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：793。

实例31.rbb-酰氨基-丙氨酸-nh2(h-a-rbb)

类别：基于雷玛唑亮蓝r、氨基酸结构单元肽合成的染料结合物。

合成：在正常条件下在甲醇中进行fmoc-a-rbb(实例30)与哌啶的反应。用esi-ms(-p)进行反应监测。在真空干燥后沉淀的具有足够纯度的产物用于随后的反应(酰胺化)。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：571。

实例32.fmoc-aapvaa-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物结合物

合成：在环境温度下用dcc(1.2当量)处理dcm中的五肽fmoc-aapva-oh(1当量)和hobt·h2o(1.2当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-a-rbb(1当量；实例31)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。水性后处理产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约58％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1202。

实例33.h-aapvaa-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapvaa-rbb(1当量，实例32)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：980。

实例34.丙烯酰胺基-aapvaa-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：将h-aapvaa-rbb(1当量；实例33)溶解在甲醇中，并在环境温度下用丙烯酸五氟苯酯(1.2当量)进行处理，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明在约12小时(过夜)后原材料的消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生足够纯的作为蓝色无定形固体的用于下一步骤的粗产物。产率：>95％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：599。

实例35.fmoc-va-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物。

合成：在环境温度下用fmoc-缬氨酸-opfp酯处理甲醇中的h-a-rbb(1当量；实例31)的溶液，同时进行搅拌。在通过esi-ms(-p)监测反应表明原材料消耗之后，使反应混合物经受水性后处理并用dcm进行提取。在真空中蒸发dcm产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约48％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：892。

实例36.h-va-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物；

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-va-rbb(1当量；实例35)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：670。

实例37.fmoc-aapfa-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1当量)处理dcm中的四肽fmoc-aapf-oh(1当量)和hobt·h2o(1当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-a-rbb(0.8当量；实例31)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中对挥发物进行水性后处理和蒸发产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约98％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1179。

实例38.h-aapfa-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapfa-rbb(1当量)(实例37)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：957。

实例39.fmoc-aapva-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1.2当量)处理dcm中的五肽fmoc-aapva-oh(1当量)和hobt·h2o(1.2当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-rbb(1当量；实例29)并在室温下搅拌混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。水性后处理产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约23％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1131。

替代性合成1：在环境温度下用dcc(1当量)处理dcm中的三肽fmoc-aap-oh(1当量)和hobt·h2o(1当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-va-rbb(0.8当量；实例36)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗(约15小时，过夜)。在真空中对挥发物进行水性后处理和蒸发产生足够纯的作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约70％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1131。

替代合成2：将fmoc-aapva-oh(110mg)和hobt(50mg)悬浮在dmf(10ml)中。添加dcc(50mg)。搅拌5分钟后，添加溶解在dmf(3ml)中的h-rbb(100mg；实例29)。搅拌2小时后，如ms所指示的，反应完成。将粗混合物用于fmoc脱保护(参见实例40中的替代合成)。esi-ms(负)[m-h]^-：1131。

实例40.h-aapva-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapva-rbb(1当量；实例39)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]-：909。

替代合成：使用fmoc-aapva-rbb的粗dmf混合物(来自实例39中的替代合成2)，添加哌啶(200μl)并将混合物搅拌过夜。蒸发溶剂，并将残余物重新溶解在甲醇(约50ml)中。在浓缩至10ml后，将深蓝色上清液倒入二乙醚(200ml)中。分离沉淀物并进行干燥以产生145mg蓝色细粉末(h-aapva-rbb)。esi-ms(负)[m-h]^-：909。

实例41.fmoc-v-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物。

合成：在环境温度下用fmoc-缬氨酸-opfp酯处理甲醇中的h-rbb(1当量；实例29)的溶液，同时进行搅拌。在通过esi-ms(-p)监测反应表明原材料消耗之后，使反应混合物经受水性后处理并用dcm进行提取。在真空中蒸发dcm产生作为白色无定形固体的粗产物。产率：约31％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：821。

实例42.h-v-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r、用于肽合成的氨基酸结构单元的染料结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-v-rbb(1当量；实例41)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：599。

实例43.fmoc-aapv-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

在环境温度下用dcc(1当量)处理dcm中的三肽fmoc-aap-oh(1当量)和hobt·h2o(1当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-v-rbb(0.8当量；实例42)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗(约15小时，过夜)。在真空中对挥发物进行水性后处理和蒸发产生足够纯的作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约70％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1060。

实例44.h-aapv-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapv-rbb(1当量；实例43)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生足够纯的作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：838。

实例45.fmoc-aapf-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1当量)处理dcm中的四肽fmoc-aapf-oh(1当量)和hobt·h2o(1当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-rbb(0.8当量；实例29)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中对挥发物进行水性后处理和蒸发产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：约98％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：1108。

实例46.h-aapf-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：在环境温度下用甲醇/哌啶(2:1)的混合物处理fmoc-aapf-rbb(1当量)(实例45)45分钟，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生作为蓝色无定形固体的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：886。

实例47.丙烯酰胺基-aapf-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：将h-aapf-rbb(1当量；实例46)溶解在甲醇中，并在环境温度下用丙烯酸五氟苯酯(3当量)进行处理，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明在约12小时(过夜)后原材料的消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生粗产物，所述粗产物再次溶解在dcm中，留下不可溶的白色副产物。随后在真空中过滤时蒸发产生足够纯的作为蓝色无定形固体的用于下一步骤的产物。产率：约98％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：94

实例48.fmoc-缬氨酸-(3-叠氮基-2-羟基)-丙酰胺

类别：用于肽合成的氨基酸结构单元、1,3-偶极[3+2]-环加成的底物。

合成：将fmoc-n-(2-环氧丙基-1-酰氨基)-缬氨酸(1当量)溶解在dcm中。将叠氮化钠(过量)溶解在水中，并在环境温度下将水相添加到有机溶液中，同时进行搅拌(>1000rpm)。添加催化量的相转移催化剂四-正-丁基硫酸氢铵，随后添加催化量的硫酸。后者被时间消耗并且需要定期更新，直到通过esi-ms(+p)进行的反应监测表明原材料完全转化。在真空中对挥发物进行水性后处理和蒸发产生作为无定形固体的无色至米色粗产物。产率：66％(粗产物)。esi-ms(正)[m+na]⁺：460。

实例49.丙烯酰胺基-aapva-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝r的染料-肽结合物。

合成：将h-aapva-rbb(1当量；实例40)溶解在甲醇中，并在环境温度下用丙烯酸五氟苯酯(1.2当量)进行处理，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明在约12小时(过夜)后原材料的消耗。在真空中简单蒸发挥发物产生足够纯的作为蓝色无定形固体的用于下一步骤的粗产物。产率：>95％(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：963。

实例50.双-氨基乙基-(雷玛唑黑b)

类别：基于雷玛唑黑b、氨基化/酰胺化底物的染料结合物

合成：将雷玛唑黑b(1当量)溶解在水中，并在环境温度下用氨水(28-30％，过量)处理，同时进行搅拌。通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明在约20小时(过夜)后原材料完全转化。在真空中简单蒸发挥发物产生足够纯的带有轻微紫色光泽的作为黑色无定形固体的用于下一步骤的粗产物。产率：定量(粗产物)。esi-ms(负)[m-h]^-：740。

实例51.氨乙基-雷玛唑亮紫

类别：基于雷玛唑亮紫5r、氨基化/酰胺化底物的偶氮染料结合物

合成：将雷玛唑亮紫5r(1当量)溶解在水中，并在环境温度下用氨水(28-30％，过量)处理，同时进行搅拌。因为在esi-ms电离中既没有检测到原材料也没有检测到产物的事实，所以通过esi-ms(-p)进行的反应监测是不可能的。在延长的反应时间(9天)时间段后，为了确保完全转化，在真空中简单蒸发挥发物产生作为深紫色无定形固体的粗产物。产率：约82％(粗产物)。

实例52.fmoc-aapf-氨基乙基-(雷玛唑黑b)

类别：基于雷玛唑黑b、四肽结构单元、组织蛋白酶底物的染料结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1当量)处理dcm中的四肽fmoc-aapf-oh(1当量)和hobt·h2o(1当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加双-氨基乙基-(雷玛唑黑b)(0.8当量；实例50)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。无需进一步纯化即可用于下一步骤。

实例53.fmoc-aapf-氨基乙基-(雷玛唑黑b)-(n'-乙酰基)-乙酰胺

类别：基于雷玛唑黑b、组织蛋白酶底物的染料肽结合物。

合成：在环境温度下用过量乙酸酐处理fmoc-aapf-氨基乙基-(雷玛唑黑b)(实例52)的搅拌反应混合物4小时。当通过esi-ms(-p/+p)进行的监测反应表明原材料消耗时，过滤反应混合物，并在真空中蒸发滤液，从而产生黑色无定形粉末作为粗产物。随后使用粗产物而无需另外纯化。通过与弹性蛋白酶的反应对同一性进行插补以产生单-乙酰化-雷玛唑黑b-氨基衍生物。

实例54.cmc9m31f-aapfa-rbb

类别：全原型组装(背骨/切割单元/染料)、组织蛋白酶底物。

合成：在环境温度下，将布拉尼斯cmc9m31f(1当量)溶解在水中并用hobt(1.2当量)进行处理，随后用edc·hcl(1.2当量)处理0.5小时，同时进行搅拌。添加h-aapfa-rbb(0.1当量；实例38)并持续搅拌过夜(>14小时)。第二天，通过透析纯化反应混合物，从而产生蓝色胶状物作为粗产物。产率：取决于取代度；1克布拉尼斯提供约1克产物。所产生的产物是聚合物且不易通过光谱表征。然而，它是蓝色的，并且在10kda膜中透析后蓝色与高mw级分相关联。使用esims检测与弹性蛋白酶的反应以检测染料的释放。

实例55.cmc9m31f-aapf-rbb

类别：全原型组装(背骨/切割单元/染料)、组织蛋白酶底物。

合成：在环境温度下，将布拉尼斯cmc9m31f(1当量)溶解在水中并用hobt(1.2当量)进行处理，随后用edc·hcl(1.2当量)处理0.5小时，同时进行搅拌。添加h-aapf-rbb(0.1当量；实例46)并持续搅拌过夜(>14小时)。第二天，通过透析纯化反应混合物，从而得到蓝色胶状物作为粗产物。产率：取决于替代程度；1克布拉尼斯提供约1克产物。所产生的产物是聚合物且不易通过光谱表征。然而，它是蓝色的，并且在10kda膜中透析后蓝色与高mw级分相关联。使用esims检测与弹性蛋白酶的反应以检测染料的释放。

实例56.与纸膜结合的aapva-rbb

类别：表面上的完整原型组装或固相“6651”(锚区/酶不稳定区或酶反应区/指示剂区)、弹性蛋白酶底物。

合成：将纸膜(1当量)浸泡在dmf中，并且随后在环境温度下用hobt·h2o(约1.2当量)、dcc(约1.2当量)和h-aapva-rbb(约1当量；实例40)进行处理，同时进行搅拌。在两天的反应时间后，滤出纸膜，用水洗涤、饱和水性nahco3、乙醇、乙酸乙酯洗涤，并用乙醚干燥。处理后，膜保持轻微的绿色，这表明负载程度非常低。产率：不适用。所产生的产物是聚合物且不易通过光谱表征。

实例57.fmoc-m-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝、氨基化/酰胺化底物的离析物的甲硫氨酸染料结合物。

合成：将h-rbb(1当量；实例29)溶解在甲醇中，并在环境温度下添加fmoc-甲硫氨酸五氟苯酯(3当量)。通过esi-ms(-p)进行的反应监测指示起始原材料消耗，并且通过在真空中蒸发任何挥发物来停止反应。获得纯度足以用于下一步骤的作为粗产物的蓝色无定形固体。产率：定量(基于染料)。esi-ms(负)[m-h]^-：853。

实例58.h-m-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝、氨基化/酰胺化底物的甲硫氨酸染料结合物。

合成：在环境温度下将fmoc-m-rbb(1当量；实例57)溶解在甲醇和哌啶(2:1v/v)的混合物中，同时进行搅拌。在短时间(<1小时)后，通过esi-ms(-p)进行的反应监测指示起始原材料消耗，并且通过在真空中蒸发任何挥发物来停止反应。蓝色无定形固体作为粗产物保留，所述粗产物溶于乙腈。滤出不可溶的白色副产物，再次在真空中除去挥发物。获得纯度足以用于下一步骤的蓝色无定形固体。产率：定量。esi-ms(正)[m+h]⁺：633。

实例59.fmoc-aaapm-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝b、五肽结构单元、组织蛋白酶底物的染料结合物。

合成：在环境温度下用dcc(1.2当量)处理dcm中的四肽fmoc-aaap-oh(1当量)和hobt·h2o(1.2当量)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-m-rbb(1当量；实例58)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(-p)进行的反应监测表明原材料消耗。用dcm进一步稀释反应混合物，滤出尿素物质，并使滤液经受水性后处理。在经硫酸钠干燥后在真空中蒸发挥发物产纯度足以用于下一步骤的作为粗产物的蓝色无定形固体。产率：>85％。esi-ms(负)[m-h]^-：1163。

实例60.h-aaapm-rbb

类别：基于雷玛唑亮蓝b、五肽结构单元、组织蛋白酶底物的染料结合物。

合成：在环境温度下将fmoc-aaapm-rbb(1当量；实例59)溶解在甲醇和哌啶(2:1v/v)的混合物中，同时进行搅拌。在短时间(<1小时)后，通过esi-ms(-p)进行的反应监测指示起始原材料消耗，并且通过在真空中蒸发任何挥发物来停止反应。蓝色无定形固体作为粗产物保留，所述粗产物溶于乙腈。滤出不可溶的白色副产物，再次在真空中除去挥发物。获得纯度足以进一步研究的蓝色无定形产物。产率：定量。esi-ms(负)[m-h]^-：941。

实例61.聚-n-酰基-三苯甲基-l-半胱氨酸

将h-cys(trt)-oh(1030mg)和三乙胺(450μl)添加到干燥dmf(6ml)中的聚对硝基苯基丙烯酸脂(paa)(722mg)中。小心地移动(即，翻转)反应混合物，偶尔进行超声波处理，直到所有固体溶解。然后将混合物温热至54℃，保持15小时，偶尔摇动。当通过ms进行的反应监测表明h-cyst(trt)-oh消失时，添加乙醇胺(250μl)以淬灭未反应的位点并继续温热额外30分钟。将混合物倒入甲醇(80ml)中。分离所有沉淀物，用dmf(5ml)再溶解，并通过添加甲酸(100μl)或饱和水性氯化钙溶液(100μl)用甲醇(100ml)再沉淀。分离沉淀物，用甲醇(100ml)搅拌2小时并过滤。在用甲醇和二乙醚洗涤后，分离出540mg产物。

合并上清液、添加甲酸直到硝基苯酚的颜色消失并如上所述对沉淀物进行再沉淀，得到额外405mg的产物。总产率：约70％。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，三苯甲基半胱氨酸的消失是对所提出的结构的有力支持。)

使用此过程，其它胺被装载到活化的聚丙烯酸酯(见表1)。当小规模进行时，粗反应混合物在dmf中的凝胶色谱证明是合适的纯化方法。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。

表1

实例62.与聚合物(聚-(n-酰基-boc-lys-oh)-co-(丙酰基-cys(trt)-oh)连接的肽-染料结合物

步骤a：

将h-aapva-rbb(52mg；实例40)溶解在dmf(1ml)中，并与二异丙胺乙酯(10μl)合并。添加氯乙酸酐(10.8mg)。将混合物搅拌1小时，然后添加额外的氯乙酸酐(8.5mg)。再搅拌2小时后，ms表明主要转化率。将500μl此溶液与聚(n-丙酰基-boc-lys-oh)-co-(丙酰基-cys(trt)-oh)(104mg；表1中的条目4)和乙基二异丙胺(70μl)合并。将混合物加热至60℃过夜，然后加热至80℃保持40分钟。将反应混合物应用于sephadexlh柱上进行纯化；分离出前洗脱的蓝色区域以得到85mg产物。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。如通过ms-分析(m/z＝571，负模式)所发现的，用弹性蛋白酶进行的处理释放ala-rbb。

步骤b:

用dcm(1ml)和甲醇(0.5ml)溶解步骤a的产物，并用三氟乙酸(0.5ml)处理40分钟。在真空中除去所有挥发物，并且通过添加二乙醚(100ml)使产物沉淀。所述产物是蓝色聚合物固体，在m/z＝1200以下的负模式下没有可观察到的质量。如通过ms分析(m/z＝571，负模式)所发现的，用弹性蛋白酶进行的处理释放a-rbb。

步骤c：

将聚-n-丙酰基半胱氨酸和530mg聚-n-酰基-三苯甲基-l-半胱氨酸溶于18ml二氯甲烷、1ml三异丙基硅烷和2ml三氟乙酸的混合物中。添加0.5ml水并将混合物搅拌过夜。蒸发混合物并用水和二乙醚洗涤。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的)。

实例63.与聚合物连接的高负荷氨基-肽-染料结合物的示例性构造

a)用dmf(1ml)溶解h-aapva-rbb(68mg；实例40)。添加氯乙酸酐(16mg)，随后添加乙基二异丙胺(100μl)。搅拌1个小时后，添加900(80mg)，并将此混合物温热至70℃保持4小时。添加聚对硝基苯基丙烯酸酯(75mg)和二异丙胺(100μl)。搅拌2小时后，用正丁胺淬灭聚合物的残存反应性位点。通过凝胶色谱法在sephadexlh上分离(150μl)蓝色聚合产物以得到105mg。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接。

b)将500μl的58mm氯乙酰氨基-aapva-rbb溶液(在步骤a中制备)和4μl乙二胺合并，加热到60℃过夜并加热到80℃保持1小时。将72mg的聚(4-硝基苯基)丙烯酸酯溶于500μl的dmf中，并且添加70μl的三乙胺并将混合物搅拌过夜。添加300μl的1mkoh水溶液，将混合物翻转额外45分钟。通过离心分离沉淀物，随后用0.1mkoh进行溶解并用甲酸沉淀。用1ml饱和水性nahco3溶解沉淀物并通过6gsephadexlh20柱。在真空中干燥得到84mg蓝色固体。

c)r＝h，ch2c(＝o)-aaapv-rbb。将190mg的h-aaapv-rbb(实例68c)溶于3ml的dmf中，并添加40mg的氯乙酸酐。添加40μl的二异丙基乙胺，并将混合物在室温下搅拌15分钟。分别添加第²批氯乙酸酐(17mg)和二异丙基乙胺(20μl)，持续搅拌1小时。将反应混合物施加到硅胶上，用含有0.2％甲酸的16-3-3到3-1-1的环己烷-甲醇-二氯甲烷梯度进行色谱分析。产物级分含有用1ml的dmf溶解的69mg。添加20μl的二异丙基乙胺，然后添加12μl的聚醚胺edr176。将反应混合物在室温下搅拌72小时。用质谱仪进行的分析揭示出烷基化产物与肽的混合物以1倍、2倍或3倍添加到胺中(负模式，m/z＝1125＝单烷基，单电荷；m/z＝1038＝双烷基，双电荷；m/z＝1513＝三重烷基，双电荷；以及m/z＝1009＝三重烷基，三重电荷)。向反应混合物供应38mg的聚-对-硝基苯基丙烯酸酯，在室温下搅拌1小时，并且然后在54℃下保持90分钟。添加250μl的n,n-二辛基胺，并将混合物保持在54℃下以偶尔摇动另外3小时。通过用丙酮沉淀来分离产物，并且在甲醇中的溶液通过6g的sephadexlh20柱之后，用水-甲醇3-1(收集最高分子量级分)对沉淀物进行色谱分析以得到31mg的水溶性材料。相同过程可以应用于h-aaapvv-rbb(实例68c)。

实例64.fmoc-aaapv-(二氨基苯甲酸)

用dmf(5ml)溶解fmoc-aaapv-oh(710mg)。随后添加hobt(210mg)和dcc(240mg)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。用dmf(1ml)溶解3,4-二氨基苯甲酸(160mg)和吡啶(100μl)并在搅拌下添加到反应混合物中。14小时后，蒸发溶剂，并通过硅胶色谱法用含有0.5％甲酸的环己烷/dcm/甲醇(4/2/1)纯化残余物，以得到400mg产物。esi-ms(正)[m+h]＝784。

实例65.h-aaapv-(二氨基苯甲酸)

将哌啶(0.5ml)添加到dmf(3ml)中fmoc-aaapv-(二氨基苯甲酸)(400mg；实例64)的溶液中。将混合物搅拌过夜，并通过蒸发(1毫巴，55℃)浓缩。将残余物与二乙醚(25ml)一起搅拌2次并进行中间过滤。所形成的产物的纯度足以后续使用。esi-ms(正)[m+h]＝562。

实例66.聚(aaapv-{二氨基苯甲酸}丙烯酰胺)

将半胱胺盐酸盐(11mg)溶于用氩气预处理的dmf(5ml)中。添加聚-4-硝基苯基丙烯酸酯(120mg)和三乙胺(200μl)。注意在整个过程中排除氧气。将混合物在55℃下搅拌1小时。用dmf(3ml)溶解h-aaapv-(二氨基苯甲酸)(230mg；实例65)，用氩气处理并添加到反应混合物中。将混合物在65℃下搅拌过夜。在氩气流下，用含有0.5％甲酸的甲醇(100ml)沉淀产物。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接。)

实例67.聚-co-[(n-巯基乙基丙烯酰胺)-(aaapv-{rbb}-丙烯酰胺)]

a)将半胱胺盐酸盐(2mg)溶于用氩气预处理的dmf(5ml)中。添加聚-4-硝基苯基丙烯酸酯(36mg)和三乙胺(50μl)。注意在整个过程中排除氧气。将混合物在55℃下搅拌1小时。用dmf(2ml)溶解h-aaapv-rbb(125mg；实例68c)，用氩气处理并添加到反应混合物中。将混合物在65℃下搅拌过夜。通过使1ml的反应混合物与水和甲醇(4/1；用氩气预处理)的混合物通过sephadexlh(6g)柱来洗脱产物；收集最前面的蓝色洗脱液并在真空中浓缩。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。

b)用氩气冲洗2.2ml的95mg聚-对-硝基苯基丙烯酸酯在9.5mldmf中的溶液，并与46μl的32mg巯基乙胺盐酸盐和45μl三甲胺在739μl氩气冲洗dmf中的溶液合并。搅拌30分钟后，添加45mg的h-aaapv-rbb(实例68c)和100μl的三乙胺，并将混合物在室温下搅拌16小时。在将混合物在54℃下保持90分钟后，添加100μl的乙醇胺并将反应在54℃下进一步保持90分钟。通过使混合物通过6gsepahdexlh20柱，用水-甲醇3-1分离产物。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。

相同过程可以应用于h-aaapvv-rbb(实例68c)。

聚-co-[(n-2-{3-(4-叠氮基苯基)丙酰基}丙烯酰胺)-(aaapv-{rbb}-丙烯酰胺)]

c)将2.2ml的95mg聚-对-硝基苯基丙烯酸酯在9.5ml的dmf中的溶液与2.2mg的4-叠氮基苯丙氨酸和5.8μl的三甲胺合并。在室温下搅拌30分钟后，将43mg的h-aaapv-rbb与100μl的三乙胺一起添加，并将混合物在室温下搅拌16小时。在将混合物在54℃下保持90分钟后，添加100μl的乙醇胺并将反应在54℃下进一步保持90分钟。通过使混合物通过6gsephadexlh20柱，用水-甲醇3-1分离产物。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。

相同过程可以应用于h-aaapvv-rbb。(如上所述的结构具有r＝ala-ala-ala-pro-val-val-rbb)。

aaapv-rbb与珠子

结合d)将30mg的h-aaapv-rbb与93mg的sephabeadsecep(环氧活化)和dmf的50μl组合。将混合物在54℃下保持72小时，并且用二氯甲烷-甲醇混合物(3-1)洗涤，并且然后用dmf洗涤，直到不再洗脱蓝色。

相同过程可以应用于h-aaapvv-rbb而非h-aaapv-rbb

e)用dmf洗涤50mg的chemicellsicoreamin珠子4次并悬浮在800μl的dmf中。添加90mg的聚-对-硝基苯基丙烯酸酯，并将混合物在60℃下摇动3小时。添加32mg的h-aaapvv-rbb(实例68c)和50μl的三乙胺。在60℃下持续摇动16小时。使珠子离心，倾析并使用例如67g上清液，并用10μl的乙醇胺在100μl的dmf中处理珠子。用1.5ml的dmf洗涤5次后，用1.5ml的水洗涤珠子2次。珠子已经获得了不能被洗掉的蓝色。

f)将33mg的h-aaapvv-rbb和19mg的聚-对-硝基苯基丙烯酸酯在0.5ml的dmf中与50μl的三乙胺合并，并在60℃下搅拌3小时。在e)中制备珠子：添加(50mg)，并在60℃下持续摇动16小时。使珠子离心，倾析并使用例如67g上清液，并用10μl的乙醇胺在100μl的dmf中处理珠子。用1.5ml的dmf洗涤珠子5次，随后用1.5ml的水洗涤2次。珠子已经获得了不能被洗掉的蓝色。

分离非珠子结合的聚合物材料

g)将120的μl乙醇胺添加到e)和f)的合并上清液中。将混合物在54℃下保持过夜。在倒入含有1％甲酸的250ml二乙醚后，通过离心分离不溶物，用2ml的dmf进行溶解，并用水-甲醇(4-1)使其通过6gsephadexlh20柱。可以分离出2mg的蓝色高分子量级分。

实例68.具有疏水性锚和弹性蛋白酶的裂解位点的聚合物结合染料

r1＝ala-ala-ala-pro-val-(rbb和r2＝h或

r1＝正辛基，r2＝h或

r1＝r2＝正辛基

a)将h-aaapv-rbb(240mg；实例68c)和聚(4-硝基苯基)丙烯酸酯(103mg)合并，并溶于dmf(5ml)中。添加三乙胺(600μl)，并将混合物搅拌过夜。添加n,n-二辛基胺(130μl)，并将混合物保持在54℃，偶尔摇动5小时。添加正丁胺(150μl)，并将混合物在54℃下保持过夜。

将混合物倒入含有1％甲酸的水(50ml)中。通过离心收集沉淀的材料并用温热的甲醇(10ml)再溶解。在用水(200ml，含有0.5％甲酸)进行第二次沉淀后，出现沉淀并通过过滤分离。将蓝色物质干燥，用温热的甲醇(10ml)再溶解，并用乙醚沉淀。过滤并干燥后，留下蓝色粉末。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的)。

b)合成fmoc-aaapv-rbb：在环境温度下用dcc(198mg)处理10mldmf中的四肽fmoc-aaap-oh(740mg)和hobt·h2o(200mg)的搅拌混合物15分钟。一次性添加h-v-rbb(680mg；实例42)并在室温下搅拌反应混合物直到通过esi-ms(负模式)进行的反应监测表明原材料消耗(约15小时，过夜)。将所有挥发物在减压下去除。将固体残余物施加到10g硅胶上，用并7-2-1到11-6-5(各自含0.1％甲酸)的环己烷-乙酸乙酯-甲醇梯度进行色谱分析。产率：342mg。esi-ms(负模式)[m-h]^-：1131。

使用与实施例68b类似的过程，从fmoc-aaapvv-oh开始制备fmoc-aaapvv-rbb。esi-ms(负模式)[m-h]-：1230。

c)合成h-aaapv-rbb：用dmf(约12ml)溶解fmoc-aaapv-rbb(342mg，实例68b)。添加哌啶(0.5ml)。将混合物在室温下搅拌1小时，直到用ms监测的反应表明原材料消耗(m/z＝1131，负模式)和产物形成(m/z＝909，负模式)。将所有挥发物在减压下去除，并将残余物与dcm和甲醇(5:1，5ml)的混合物搅拌30分钟，并且然后通过添加二乙醚(20ml)使其沉淀。通过过滤分离沉淀物，并在剧烈搅拌下用二乙醚(25ml)处理60分钟。通过抽滤并在54℃下干燥3小时后，分离出288mg浓蓝色细粉末。esi-ms(负模式)[m-h]-：909。

使用如实例68c中所述的类似过程制备h-aaapvv-rbb的合成。esi-ms(负模式)[m-h]^-：1008。

d)将40mg的aaapv-rbb和14mg的聚-对-硝基苯基丙烯酸酯合并在1ml的dmf中。当所有物质溶解时，添加100μl三甲胺，并将混合物搅拌30分钟。添加20μl的n,n-二正辛胺，并将混合物在室温下搅拌过夜。使用甲醇-水混合物(1+3)使反应混合物通过6gsephadexlh20柱两次以得到13mg深蓝色聚合物粉末。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接)。

e)合成n-[(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基]-n'-[aaapvv-rbb]脲并且随后将化合物与硅胶结合：用干燥dmf(2ml)溶解h-aaapvv-rbb(49mg；实例68c)。添加(异氰酸根合丙基)三乙氧基硅烷(80μl；干燥dmf中10％溶液)并将混合物在环境温度下搅拌。2小时后，添加第二部分(异氰酸根合丙基)三乙氧基硅烷(80μl；干燥dmf中10％溶液)并将混合物搅拌过夜。当通过esi-ms监测的反应表明完全转化(负模式)[m-h]^-：1255)时，35mg硅胶(reprosil100，dr.maisch，5μm，孔径100规格表面280m²/g)与100μl的反应混合物合并，并在75℃下摇动孵育过夜。通过离心分离产物，并用dmf(5×1ml)和水(2×1ml)洗涤。它由深蓝色粉末组成，在5小时内用水或dmf浸不出任何蓝色。

实例69.fmoc-a-(n-苯基哌嗪基)酰胺

将fmoc-a-oh(1.69g)和hobt(1.2g)悬浮在dcm(25ml)中。添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)(1.12g)并将混合物搅拌10分钟。添加n-苯基哌嗪(605mg)并将混合物在室温下搅拌另外60分钟。用1n水性hcl和1n水性k2co3(各2次)提取混合物，然后用盐水提取，并用硫酸钠干燥。蒸发产生1.3g足够纯的产物。esi-ms(正)[m+h]＝456。

实例70.双-(4-二甲基氨基苯基)-(4-[4-n-{n-fmoc-丙氨酰}]哌嗪基苯基)-碳鎓离子[fmoc-a-(cv)](a)和双-(4-二甲基氨基苯基)-(4-[n-哌嗪基]苯基)-碳鎓离子(cv)(b)

将磷酰氯(v)(1.6ml)添加到粗制fmoc-a-n-苯基哌嗪酰胺(2.52g，实例69)和4,4'-双(n,n-二甲基氨基)二苯甲酮(米蚩酮，1.92g)的混合物中，并混合试剂直到所有物质均匀湿润。将混合物加热到100℃并保持2小时，冷却并用丙酮和水(1:1)的混合物溶解。将硅胶(8g)应用于黑蓝色溶液中，并将混合物蒸发至干燥。用环己烷-乙酸乙酯-甲醇梯度(8/1/1，含有0.5％甲酸至3/1/1，不含酸；然后0/1/1，含有3％三乙胺)洗脱，得到作为盐的1.22g(a)(m/z＝706)和720mg(b)(m/z＝413)。esi-ms(正)[m]分别为706和413。

实例71.4-([4-{h-ala-ala-pro-val-ala}酰氨基n-哌嗪基]苯基)-双-(4-二甲基氨基苯基)-碳鎓离子(h-aapva-cv)和4-([4-{h-ala-ala-pro-val-ala}酰氨基n-哌嗪基]苯基)-双-(4-二甲基氨基苯基)-碳鎓离子聚丙烯酰胺

a.用dcm(40ml)溶解fmoc-a-cv(980mg；实例70a)。添加过量的哌啶(2ml)，并将混合物搅拌过夜。在真空中除去所有挥发物，在<30毫巴/50℃下在真空中除去残余哌啶。用环己烷(3x)洗涤残余物、干燥并用dcm(10ml)溶解。通过ms识别产物(m/z＝484)。

b.添加fmoc-val-pfp(870mg)，并将混合物搅拌15分钟。在真空中除去所有挥发物，并用哌啶(2ml)在dcm(20ml)中处理残余物。除去所有挥发物，并用环己烷(3x)洗涤混合物，并在<30毫巴/50℃下在真空中干燥。通过hplc纯化混合物以得到110mg期望中间体。

c。将fmoc-aap-oh(110mg)与hobt(50mg)合并，并悬浮在dmf(20ml)中。添加edci(50mg)，并将混合物另外搅拌10分钟。添加来自步骤b的中间体(110mg)，并将混合物另外搅拌2小时。用ms(m/z＝1044)监测的反应表明形成了预期的产物。

d.用哌啶(0.5ml)处理反应混合物并搅拌过夜。ms表明形成目标化合物(esi-ms(正)[m]＝822)。在<30毫巴/50℃下在真空中除去所有挥发物。如通过ms分析发现的(m/z＝484，正模式)，用弹性蛋白酶处理材料释放a-cv。

e.用6mldmf溶解579mg的聚-对-硝基苯基丙烯酸酯。添加d的残余物，并将混合物在室温下搅拌72小时。ms表示在m/z＝822处峰的消失。添加500μl乙醇胺，并将混合物在室温下搅拌7小时。cv-阳离子的蓝色可以通过酸处理重新建立。使1ml制剂通过sephadexlh20柱(20ml，水/甲醇2+1)。收集在前面洗脱的蓝绿色级分并干燥i.v.如在m/z＝484处出现质量峰所证明的，用猪和人弹性蛋白酶进行的处理释放a-cv。(由于材料的聚合性质，没有特定的表征是可能的。然而，通过sephadex的材料具有高分子量并且是蓝色的，因此证明染料与聚合物的连接。此外，在反应过程中质谱中m/z＝822处峰的消失支持了这一点。

实例72.双-(4-二甲基氨基苯基)-(4-[4-n-{6-n-缬氨酰基)氨基己酰基}]哌嗪基苯基)-碳鎓离子(fmoc-val-二乙基-cv或fmoc-v-ahx-cv)

将fmoc-6-氨基己酸五氟苯酯(1.18g)添加到dcm(15ml)中的cv(720mg；实例70b)的溶液中。在添加哌啶(1ml)之前，将混合物搅拌1小时。搅拌1天后，在真空中除去所有挥发物，并用环己烷(3x)提取残余物，并用dcm(15ml)再溶解。添加fmoc-val-pfp(1.13g)，并将混合物搅拌1小时。除去所有挥发物，并用甲醇(22ml)和水(3ml)(含有3％甲酸)的混合物溶解残余物。用含3％甲酸(50ml)的水沉淀制剂并离心。通过制备型hplc分离残余物以得到160mg黑蓝色物质。用dcm(5ml)溶解所述材料并用哌啶(250μl)处理过夜。用hplc浓缩和纯化以得到40mg期望产物。esi-ms(正)[m]＝847。

实例73.h-aapv-ahx-cv

如实施例42中所描述的，步骤d对fmoc-v-ahx-cv(实例71)进行的处理产生h-aapv-ahx-cv。esi-ms(正)[m]＝864

如通过ms分析发现的(无m/z＝526，正模式)，用弹性蛋白酶处理实例72的产物不释放ahx-cv。

实例74.聚醚胺edr176修饰的羟丙甲纤维素

将羟丙甲纤维素(89kda，5g)溶解在nmp(150ml)中。溶解后，添加甲苯(100ml)。用迪安-斯达克分水器使混合物回流1小时以通过共沸蒸馏除去水。将干燥溶液冷却至0℃。在此温度下，添加甲苯磺酰氯(1.45g)，随后添加吡啶(30ml)。将混合物在此温度下保持1小时。最后添加到聚醚胺edr176(15g)，并将混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物加热到90℃保持1小时。反应完成后，通过蒸发除去挥发物。将所产生的溶液对水透析(mwco10.000-20.000da)。将溶液蒸发至干燥。将所产生的产物溶解在乙醇中并用乙酸乙酯/环己烷(3x)沉淀。产物是深棕色聚合物薄膜。产率：1.7g；0.34mmol/gn。

实例75.eda修饰的羟丙甲纤维素

将羟丙甲纤维素(89kda，5g)溶解在nmp(120ml)中。溶解后，添加甲苯(50ml)。用迪安-斯达克分水器使混合物回流1小时以通过共沸蒸馏除去水。将干燥溶液冷却至0℃。在此温度下，添加甲磺酰氯(1.9ml)，随后添加吡啶(20ml)。将混合物在此温度下保持1小时。最后，添加乙二胺(eda，100ml)，并将混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物加热到90℃保持1小时。反应完成后，通过蒸发除去挥发物。将所产生的溶液对水透析(mwco10.000-20.000da)。将溶液蒸发至干燥，并用乙酸乙酯(5x)提取所产生的产物。略带黄色的薄膜产率：2.9g；0.67mmol/gn.

实例76.eda修饰的羟乙基纤维素

将羟乙基纤维素(90kda，10g)溶解在nmp(250ml)中。溶解后，添加甲苯(200ml)。用迪安-斯达克分水器使混合物回流1小时以通过共沸蒸馏除去水。将干燥溶液冷却至0℃。在此温度下添加甲苯磺酰氯(8.8g)，随后添加吡啶(3.75g)。将混合物在此温度下保持2小时并在室温下保持5小时。最后添加乙二胺(30ml)，并将混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物加热到90℃保持2小时。反应完成后，通过过滤除去不溶物。然后通过蒸发除去挥发物。将所产生的溶液对水透析(mwco10.000-20.000da)。将溶液蒸发至干燥，并用乙酸乙酯/乙醇(3:1，3x)提取所产生的产物。黄色薄膜产率：3.85g；0.45mmol/gn.

实例77.聚醚胺edr176修饰的羟乙基纤维素

将羟乙基纤维素(250kda，5g)溶解在nmp(160ml)中。溶解后，添加甲苯(100ml)。用迪安-斯达克分水器使混合物回流2小时以通过共沸蒸馏除去水。将干燥溶液冷却至0℃。在此温度下，添加甲苯磺酰氯(4.2g)，随后添加吡啶(1.75g)。将混合物在此温度下保持2小时并在室温下保持2小时。最后，添加聚醚胺edr176(20ml)，并将混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物加热到90℃保持2小时。反应完成后，通过过滤除去不溶物。然后通过蒸发除去挥发物。将所产生的溶液对水透析(mwco10.000-20.000da)。将溶液蒸发至干燥，并用乙酸乙酯(3x)提取所产生的产物。黄色薄膜产率：高mw级分中4.1g，0.99mmol/gn

实例78.三氧杂三氰胺修饰的羟乙基纤维素

将羟乙基纤维素(90kda，5g)溶解在nmp(200ml)中。溶解后，添加甲苯(150ml)。用迪安-斯达克分水器使混合物回流2小时以通过共沸蒸馏除去水。将干燥溶液冷却至0℃。在此温度下，添加甲苯磺酰氯(4.2g)，随后添加吡啶(1.75g)。将混合物在此温度下保持3小时并在室温下保持4小时。最后，添加o,oal双(3-氨基丙基)二甘醇(50g)并将混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物加热到90℃保持3小时。反应完成后，通过过滤除去不溶物。然后通过蒸发除去挥发物。在添加水(100ml)后，将所产生的溶液对水透析(mwco10.000-20.000da)。将溶液蒸发至干燥，并用乙酸乙酯(3x)提取所产生的产物。用p4o10干燥粘性棕色物质，并再次用乙酸乙酯/乙醇(3:1)提取。深棕色薄膜产率：高mw级分中5.6g；0.98mmol/gn

实例79.hec-edr176-n-丙酰基-aapva-rbb

将聚醚胺edr176修饰的羟乙基纤维素(0.05g；实例77)溶解在h2o(10ml)和meoh(10ml)中。将meoh(3ml)中丙烯酰胺-aapva-rbb(实例49)(21mg)添加到此溶液中。用nahco3将混合物调节到ph8.0并在室温下搅拌18小时。形成蓝色沉淀物。将此混合物对nahco3和水(2x)透析(mwco12-14kda)。过滤后，蒸发浅蓝色溶液以得到蓝色薄膜。产率：45mg，高mw级分中的蓝色。

实例80.hec-peg200-n-丙酰-aapf-rbb

将三氧杂三氰胺修饰的羟乙基纤维素(0.22g；实例78)溶解在h2o(20ml)和meoh(10ml)中。将meoh(5ml)中丙烯酰胺-aapf-rbb(实例47，0.085g)添加到此溶液中。用nahco3将混合物调节到ph8.0并在室温下搅拌18小时。形成蓝色沉淀物。将此混合物对nahco3和水(2x)透析。过滤后，蒸发浅蓝色溶液以得到蓝色薄膜。产率：137mg，高mw级分中的蓝色。

实例81.hec-eda-n-丙酰-aapf-rbb

将eda修饰的羟乙基纤维素(0.54g；实例76)溶解在h2o(50ml)中。将acn(30ml)中丙烯酰胺-aapf-rbb(实例47，0.085g)添加到此溶液中。用nahco3将混合物调节到ph8.0并在室温下搅拌48小时。将溶剂在减压下蒸发。形成蓝色沉淀物。将此混合物对nahco3和水透析。过滤后，蒸发浅蓝色溶液以得到淡蓝色薄膜，所述淡蓝色薄膜在洗涤后不会释放颜色。产率：400mg。

实例82.pei-n-丙酰-aapf-rbb

将聚乙烯亚胺(0.2g；mw60-75kda)溶解在h2o(10ml)中。将acn(1ml)中丙烯酰胺-aapf-rbb(15mg)(实例47)添加到此溶液中。将混合物搅拌18小时。然后将溶液对nahco3和水透析(mwco12-14kda)。过滤后，对溶剂进行蒸发。获得蓝色粘性残余物。产率：140mg。

实例83.丙烯酰胺基-aapv-rbb

合成：将420mg的h-aapv-rbb(实例44)和200mg的碳酸氢钠悬浮在25mldmf中。添加45μl的丙烯酰氯。2小时后，另外添加40μl的丙烯酰氯。在完成反应过夜后，将混合物浓缩并用乙酸乙酯在硅胶上进行色谱分析以除去副产物和杂质，并且然后用甲醇洗脱产物。产率：125mg，esi-ms(负模式)[m-h]^-：892。

实例84.α,ω-双(n-丙酰基-aapv-rbb)peg(24k)

将α,ω-双-氨基peg(0.3g；mw24kda，0,106mmol/gn)溶解在h2o(5ml)中。将acn(20ml)中丙烯酰胺-aapv-rbb(33mg)(实例83)添加到此溶液中。将混合物在室温下搅拌24小时。然后将溶液在水/乙醇(9:1，2x)和水(2x)中对nahco3透析(mwco12-14kda)。过滤后，对溶剂进行蒸发。获得蓝色水溶性固体聚合物，其中染料与高分子量级分结合。产率：140mg。

实例85.α,ω-双(n-丙酰基-aapv-rbb)peg(11k)

将α,ω-双-氨基peg(0.25g；mw11,4kda，0,190mmol/gn)溶解在h2o(5ml)中。将acn(20ml)中丙烯酰胺-aapv-rbb(30mg)(实例83)添加到此溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时。然后将溶液在水/乙醇(9:1，2x)和水(2x)中对nahco3透析(mwco12-14kda)。过滤后，对溶剂进行蒸发。获得蓝色水溶性固体，其中蓝色与高mw级分相关联。产率：120mg。

实例86.前列腺素普鲁兰多糖

将氰乙基普鲁兰(3.5g)溶解在h2o(200ml)中。添加thf(200ml)。将6.0g的cocl2*6h2o添加到此溶液中。将紫色溶液在冰浴中冷却。在此温度下，在6小时内添加6.8g的nabh4。形成黑色沉淀物。将反应混合物在室温下另外搅拌12小时。用乙酸(10ml)酸化混合物。1天后，黑色沉淀物溶解，并且使所产生的紫色溶液经受透析(mwco12-14kda，水3×)。形成白色粘性悬浮液。为了将产物分离为游离胺，添加naoh(约2g)。对粘度较低的产物进行透析。蒸发后，形成不溶于水的棕色固体。棕色固体，1.85mmol/gn产率：2.4g。

实例87.丙胺基hec

将hec(5.0g；90kda)溶解在h2o(50ml)中。添加naoh(0.16g)。在4小时内(以0.2ml部分)将丙烯腈(0.8ml)添加到此溶液中并在室温下搅拌另外12小时。将黄色溶液对水透析(mwco10-20kda，2x)。用thf(75ml)稀释所产生的溶液(150ml)。添加cocl2·6h2o(6.3g)。通过在4小时内添加nabh4(6.8g)实现还原。形成黑色沉淀物。用乙酸(5ml)酸化混合物。在沉淀物溶解(2天)后，将溶液对水透析(mwco10-20kda，2×)。蒸发后，得到黄色水溶性固体。产率：3.5g，1.02mmol/gn

实例88.n-(丙酰基-aapv-rbb)-丙氨基hec

将丙胺基hec(500mg；实例87)溶解在h2o(50ml)中。将丙烯酰胺-aapv-rbb(75mg)(实例83)溶解于acn(25ml)中。合并溶液并搅拌24小时。然后将反应混合物在54℃下保持2天。将所产生的深蓝色溶液在水/etoh(9:1，2x)和水(2x)中对nahco3透析。在部分蒸发至15ml后，得到高粘度的蓝色溶液。在剧烈搅拌下，将此溶液添加到acn(80ml)中。用acn提取所产生的蓝色沉淀物，直到在上清液中不再检测到未反应的染料。产物储存在acn中，并且是可溶于水/meoh的蓝色橡胶状固体。

实例89.丙胺基hec(实例87的放大，具有较低浓度的钴和催化剂)

将羟乙基纤维素(50g；90kda)溶解在h2o(500ml)中。添加naoh(1.6g)。在6小时内(以2.0ml部分)将丙烯腈(9.0ml)添加到此溶液中并在室温下搅拌另外12小时。用水/thf(1:1；200ml)稀释混合物，并另外添加丙烯腈(2ml)。在室温下搅拌1小时后，将黄色溶液对水透析(mwco10-20kda，2x，36小时)。用thf(250ml)稀释此溶液(1160ml)。添加cocl2·6h2o(25g)。通过在0到5℃下在18小时内添加nabh4(44g)来实现还原。形成黑色沉淀物。用乙酸(50ml)酸化混合物。在3天内，溶解黑色沉淀物。在溶解沉淀物后，将溶液对水透析(mwco10-20kda，2×)。在部分蒸发溶剂后，得到粘稠的黄色溶液。固含量：约30g。产率：30克；干物质中0.85mmol/gn

实例90.丙烯酰化长链peg(2000)-aapv-rbb接头

将100mg双-氨基peg2000溶解在dmf(10ml)中。添加dmf(1ml)中12mg丙烯酰化aapv-rbb(实例83)并将混合物搅拌1小时。然后将反应混合物在54℃下保持18小时。在蒸发溶剂后，添加二乙醚以提取过量的双-氨基peg并沉淀产物。用乙醚(2x)洗涤沉淀物、干燥并重新溶解在acn(25ml)中。添加nahco3(50mg)和丙烯酰氯(20μl)并将混合物搅拌2小时。过滤混合物并蒸发至干燥。在用乙醚提取后，将残余物溶于水/acn(1:1，1ml)中。产物深紫色溶液无需进一步纯化即可使用。

实例91.[n-3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基氨基羰基]-aapv-rbb

将211mg的h-aapv-rbb(实例44)溶解在10mldmf中。一次性添加63μl的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基异氰酸酯并持续搅拌10分钟。除去溶剂并用乙醚沉淀产物。在用乙醚洗涤后，得到深紫色粉末。产率：120mg；m/z＝1085(m-h)。

实例92.aapv-rbb标记的硅胶

将14mg的[n-3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基氨基羰基]-aapv-rbb(实例91)溶于1.2mldmf中。将100mg的硅胶分散在此溶液中。然后添加1μl硫酸并将反应混合物加热至75℃。将混合物在此温度下保持2天。将深蓝色硅胶转移到柱中并用乙腈(200ml)、水/乙腈(1:1；500ml)、水/甲醇(1:1；500ml)和水(500ml)洗涤。结果：65mg深蓝色粉末(参见进一步表征的酶测定)。

实例93.肽标记的带有长链接头的珠球胺微球

将丙烯酰化的长链peg(2000)-aapv-rbb接头(0.5ml；实例90)添加1-ml珠球胺微球分散体中。反应在60℃下进行2.5天。然后将微球离心并用水/acn(1:1，8×)和水(2x)洗涤。将所产生的淡紫色沉淀重新悬浮在水(1ml)中以得到淡紫色分散体。

实例94.用邻联茴香胺使fmoc-aapv酰胺化

将fmoc-aapv(116mg)和hobt(40mg)溶解在dcm(20ml)中。将溶液置于冰浴中并添加dcc(45mg)。在0℃下持续搅拌30分钟并在室温下另外搅拌30分钟。然后添加五倍过量的邻联茴香胺(250mg)。在121小时的反应时间后，通过esi-ms(正模式)[m+h]⁺：805，[m+na]⁺：827)观察产物。

实例95：合成o-烯丙基氯酚红

将氯酚红(2.76g)、烯丙基溴(1.29ml)和碳酸钾(1.8g)合并在干燥丙酮(50ml)中并加热96小时至回流。在冷却至室温后，滤出所有固体并用丙酮洗涤。在剧烈搅拌下将合并的滤液(约70ml)倒入二乙醚(350ml)中。持续搅拌20分钟，然后通过过滤收集沉淀物并重新溶解(50ml的丙酮)并沉淀(400ml的二乙醚)。搅拌30分钟后，通过过滤来收集沉淀物并在54℃下干燥以得到2.72g。esi-ms(负模式)[m-h]^-：461；材料不再随ph变色。

用溴酚红的相同过程得到类似产物。(esi-ms(负模式)[m-h]^-：551，2br的同位素模式，64％)

实例96：合成c-烯丙基氯酚红

将o-烯丙基氯酚红(2g，实例95)悬浮在硝基苯(10ml)中并在210℃下在油浴中加热70分钟。当tlc对照(硅胶，氯仿-甲醇10-3，2％甲酸)表明完全转化(离析物：rf＝0.65，产物：rf＝0.55，原材料在暴露于氨时不变色，产物在暴露于氨时颜色变为深紫色)时，将反应冷却至室温，并且然后用乙醚(50ml)稀释。通过倾析来收集沉淀物、用甲醇(25ml)再溶解并通过倒入剧烈搅拌的二乙醚(300ml)中沉淀。重复溶液-沉淀过程直到检测不到硝基苯的气味(2-3x)。将产物在54℃下干燥以得到目标化合物(1.39g)。esi-ms(负模式)[m-h]^-：461；当用碱基处理至深紫色时，材料变色。

实例97：合成c-烯丙基溴酚红

将o-烯丙基溴酚红(690mg，实例95)悬浮在硝基苯(10ml)中并在210℃下在油浴中加热60分钟。当tlc对照(硅胶，氯仿-甲醇10-3，2％甲酸)表明完全转化(离析物：rf＝0.59，产物：rf＝0.45，离析物在暴露于氨时不变色，产物在暴露于氨时颜色变为深紫色)时，将反应冷却至室温，并且然后用乙醚(50ml)稀释。用氯仿-甲醇-环己烷(6-1-4)在硅胶上对沉淀物进行色谱分离以产生210mg的目标化合物。esi-ms(负模式)[m-h]^-：551(2br的同位素模式)；颜色随氨变为紫色。

实例98：含有ph敏感部分的化学实体

包括ph敏感部分的化学实体选自：溴百里酚蓝、酚红、溴酚红、氯酚红、百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫；并且使用本领域已知的方法将其它磺基酞菁染料与锚区连接。例如，ph敏感部分通过单键与锚区连接(选自聚苯乙烯珠、硅胶珠、多糖珠、聚丙烯酰胺珠、纤维素珠、多糖、衍生化纤维素、聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、uv可活化基团、和肽聚糖衍生物及其组合)、与亚烷基接头、亚烯基接头、和亚炔基接头、酰胺接头或胺接头连接。

实例99：ela和catg底物的酶水解的测试

测试前述实例底物的水解速率和在ela和cat活性检测试验中的实用性。

弹性蛋白酶：用来自白细胞的胰腺猪弹性蛋白酶和人弹性蛋白酶进行的总体积为25μl的测定是在ph为7、含有1u/ml酶、1mg/ml到5mg/ml底物(取决于分子量和负载染料的量)的100mm磷酸钾缓冲液(或可替代地ph为7的500mm的nacl、100mm的硫酸钠)中进行的。取决于酶底物的性质，测定混合物的外观是澄清溶液、悬浮液或凝胶。在37℃下进行孵育。3小时和20小时后，取10μl样品，并且通过将10μl的meoh添加到每个样品中来使酶变性。在混合并在-20℃下孵育20分钟后，以13.000rpm使样品离心10分钟。每个测定包含不含酶的对照、含有1mg/ml到5mg/ml的底物，并且以相同方式并且与含酶测定并行地进行分析。根据分子和预期切割产物的性质，通过离子阱ms[m+h]+或[m-h]-来分析meoh沉淀后的上清液。

组织蛋白酶：用组织蛋白酶g进行总体积为25μl的测定，并且如果观察到切割，则在ph为7的含有0.5u/ml、0.1u/ml酶、1mg/ml到5mg/ml底物(取决于分子量和负载染料在固定相上的量)的100mmtris-hcl中(或可替代地ph为7的500mmnacl、100mm醋酸钠混合物)中进行另外的测定中。取决于酶底物的性质，测定混合物的外观是澄清溶液、悬浮液或凝胶。孵育、对照、取样和分析如上。

这些研究的结果总结在表2中。

表2：弹性蛋白酶和组织蛋白酶g对特异性底物的切割速率的总结

n.t.＝未经测试。

实例100：交联阱

根据制备法，将如聚dadmac等季胺聚合物与聚乙烯亚胺聚合物以19:1到5:1的比例混合。溶剂是水和乙腈(1:1v/v)的混合物，并且聚胺聚合物的最终浓度为20％。根据制备法，将对应于3％、6％、9％或12％v/v中任何一种的表氯醇体积添加到其中。允许混合物在60℃回流下反应过夜。然后在没有冷凝器的情况下加热混合物以除去未反应的表氯醇。向其中添加过量的氨水并进一步反应以淬灭所有未起皱的环氧化物(后一步骤也可以针对反应性结合阱材料省略)。将混合物在真空中浓缩以除去乙腈和表氯醇(如果不淬灭的话)并更换蒸发的水。最终混合物含有10％到40％的多胺w/v.粘度与交联度成比例。

实例101：uv引发的阳离子超吸收剂作为水槽或染料阱

将如聚dadmac等季胺聚合物与含有季铵基团如氯化(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵、[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵、或[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵的单体以5:1、7.5:1、10:1或15:1的比例混合。向此混合物中添加选自二苯甲酮、菲醌或过氧化苯甲酰的自由基引发剂。另外，以1％摩尔当量的丙烯酸胆碱单体添加交联剂如二(三羟甲基)丙烷四丙烯酸酯。用高达25％的异丙醇稀释溶液。对于染料阱，使用橡胶印模将约1μl的溶液施加到15mm2纸到无纺布区域。然后在254nm的uv辐射下照射20分钟。使用含有0.5％w/v亮蓝的水溶液证明了功能，所述溶液沿着纸或无纺布被拉伸并陷于季胺基团中。

作为水槽或超吸收剂，形成较厚的聚合物床。将4mm或4μl的点或直径沉积在疏水表面如玻璃、泡沫或纸上。使用手持式uv灯在254nm处将沉积物uv硬化30分钟。然后将它们置于亮黑色染料或溴酚蓝染料的水悬浮液中。膨胀度和染料结合表明作为超吸收剂或染料捕集剂的潜力。超吸收剂通过吸收其在水中的干重超过100倍的能力来指定。

使用所述组合物：1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的2-丙醇中的二苯甲酮溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和0.3ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)，在玻璃表面上沉积和后续照射结果在平盘中。施加4μl、6μl、10μl、20μl或30μl产生大致相似重量的圆盘。吸水率如下表所示：

实例102：uv引发的交联阱和超吸收剂

通过使丙烯酸酯聚合来合成阳离子阱

1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和1.77ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰胺基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和1.77ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和3.54ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰胺基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和3.54ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)和60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰胺基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)，70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯，50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)和60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、120μl的甘油1,3-二甘油二丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和1.77ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰氨基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)、500μl的三羟甲基丙烷乙氧基化物三丙烯酸酯(平均mn为约692)、200μl的4,4'-二羟基二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(10％w/v)和60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、150μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、40μl的2-丙醇中的二苯甲酮溶液(20％w/v)和30mg的三乙醇胺合并，用350μl的2-丙醇稀释并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰氨基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)、300μl的甘油1,3-二甘油二丙烯酸酯、200μl的4,4'-二羟基二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(10％w/v)和90μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

将1ml的(丙烯酰氨基)丙基三甲基氯化铵(75％水溶液)、1ml的三羟甲基丙烷乙氧基化物三丙烯酸酯(平均mn为约692)、200μl的4,4'-二羟基二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(10％w/v)、150μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和2ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，水中20％)合并并剧烈混合。将1μl的此混合物施加到固体载剂(玻璃板、滤纸、非织造物)上，并用254nm的光照射20分钟。

作为染料阱，使用印模将如上所述约1μl的溶液施加到15mm2纸到无纺布区域。然后在254nm的uv辐射下照射20分钟。使用含有0.5％w/v亮蓝的水溶液证明了功能，所述溶液沿着纸或无纺布被拉伸并陷于季胺基团中。

使用足以捕获可见量化合物同时仍允许水或蛋白质溶液通过阱区域的沉积程度获得最佳捕获效应。使用所述组合物，1ml的丙烯酸胆碱(80％水溶液)、70μl的二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、50μl的二苯甲酮在2-丙醇中的溶液(20％w/v)、60μl的hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)溶液(50％w/v)和0.3ml的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(分子量400,000-500,000，20％在水中)是有效的但倾向于过载。在含有非织造物的粘胶上稀释到20％或40％并且每12mm2沉积0.2μl到0.6μl，随后用手动uv灯在254nm下照射30分钟，导致适当的流体转移的适当捕获。这些季胺最理想地用作粘性印刷溶液。为此，它们可以如下配制：在软化水中制备15g的3.3％exilva悬浮液。在连续搅拌下在软化水中逐步添加12.5g的4％聚dadmac溶液。然后在连续搅拌下逐步添加10.0g的软化水。然后，通过在软化水(10％w/w)中水合aerosil200来制备50gaerosil200水凝胶。将软化水中5g的4％聚dadmac溶液逐步添加到aerosil凝胶中。将aerosil/聚dadmac凝胶以小等分试样添加到exilva/聚dadmac凝胶中并混合。最后，将另外7.5g的4％聚dadmac添加到混合物中。所产生的100g溶液含有5％aerosil200、0.5％exilva和1％聚dadmac。此油墨配方可以用0.002％荧光素w/w标记以在uv254nm下显色。

实例103.5-(对氨基甲基)苯基-4-氯-3-吲哚酚-β-d吡喃半乳糖苷

将5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-d-吡喃半乳糖苷(xgal，100mg，0.25mmol)与对-氨基苄基硼酸(38mg，0.25mmol)一起置于圆底烧瓶中。在环境温度下将样品部分溶解在乙腈(3ml)和水(约0.5ml)中，同时进行搅拌(磁力搅拌器，300rpm)。添加二异丙基胺(dipa，78yl，0.55mmol)，随后添加乙酸钯(ii)(pd(oac)23mg，0.0125mmol)和三苯基膦物质(tppts，21.3mg，0.0375mmol)，同时进行搅拌。将系统加热到80℃并继续处理48小时。通过esi-ms监测反应过程。在冷却至室温后，滤出任何沉淀物(期望产物保持在溶液中)，并且反应混合物直接用于进一步处理ω-溴烷基化肽聚糖衍生物。

实例104：5-(对氨基甲基)苯基-4-氯-3-吲哚氧基-β-d-吡喃半乳糖苷pg加合物

在环境温度下，将干燥的ω-溴烷基化肽聚糖(55mg)置于eppendorf管中并悬浮在5-(对-氨基甲基-)苯基-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(1.5ml，过量)的乙腈/水(6:1)溶液中。将反应系统摇动72小时。之后依次用水和乙醇洗涤沉淀物，随后进行透析纯化(水，72小时)以确保除去小分子xgal样品。透析后，将产物冷冻干燥以产生黄色粉末。

实例105：肽聚糖与表溴醇的o-烷基化

将干燥的肽聚糖(pg)(1.0g)置于3颈圆底烧瓶中并在环境温度下悬浮在1,4-二恶烷(3ml)中，同时缓慢搅拌(磁力搅拌器)。添加表溴醇(300μl，3.5mmol)，随后添加70％高氯酸(30μl)。在环境条件下继续处理3小时。之后将反应混合物倒入纸过滤器中，并且随后用水、1,4-二恶烷和乙醚洗涤。过滤后，将烷基化的pg在真空中干燥并保存在冰箱中以进行进一步处理。产率：>1,06g。(总产率不能精确确定)。

用于制备的用途包含固定生色底物，如实例104和图7a到7c中的生色底物。可替代地，活化的pg可以用于结合次级酶，如葡糖苷酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、酯酶或磷酸酶。

用于形成这种材料的一般方法是取pg和外淀粉的新鲜活性产物，并且然后用几次更换的水和缓冲液洗涤。然后将其与有限量的葡糖苷酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、过氧化物酶、酯酶或磷酸酶混合并允许在搅拌下反应。反应后，将其在乙酸铵缓冲液中洗涤，以淬灭剩余的br基团并除去未固定的酶。

为了进行溶菌酶的测定，将含有共价结合底物的pg与结合于同源辅酶的pg混合。在通过溶菌酶降解时，辅酶变得可用于活化结合底物，所述结合底物也通过溶菌酶的作用而变得更易溶解。因此，pg-x-gal结合物与结合b-半乳糖苷酶的pg混合。

实例106：形成氯化β-内酰胺前体

在室温下一次性添加3-氯甲基-7-(2-苯基乙酰氨基)-3-头孢烯-4-羧酸酯(1.04g，2.14mmol)悬浮于dcm(干燥，40ml)和间氯过苯甲酸(77％，1.09g，4.88mmol)。将混合物在室温下搅拌过周末。滤出固体并用dcm(30ml)洗涤；将滤液浓缩至干燥。将粗产物溶于et2o(40ml)中并在冰浴中搅拌2小时。然后滤出固体并用et2o(50ml)洗涤。得到作为白色固体的产物(811mg，73％)。

esi-ms(正)：[m+na]⁺＝541

实例107：形成β-内酰胺吲哚醚

在室温下将3-氯甲基-7-(2-苯基乙酰氨基)-3-头孢烯-4-羧酸酯(488mg，2.00mmol)悬浮在丙酮(干燥，5ml)中，并将混合物在室温下搅拌，同时使氩气流过所述混合物持续10分钟。然后在室温下一次性添加5-溴-4-氯吲哚基(231mg，1mmol)。在室温下一次性添加碳酸钾(278mg，2mmol)之前，继续与氩气流搅拌5分钟。将混合物在室温下搅拌，同时使氩气通过另外10分钟。然后添加另外的丙酮(干燥，2ml)。在室温下与氩气流搅拌另外两分钟后，将混合物在氩气氛下在室温下搅拌过夜。添加dcm(50ml)和水(40ml)；提取后，通过槽纹过滤器过滤整个混合物。过滤后，分离有机相和水相，将有机相干燥(na2so4)并浓缩至干燥。通过柱色谱(硅胶，洗脱液：dcm中2％meoh)纯化粗产物。收集含有产物的级分以产生228mg的深棕色固体。

esi-ms(正)：[m+na]⁺＝718

实例108：甲氧基苯胺衍生物盐

实例10的物质可以是mpo的直接底物，然而，当它被配制成烷基化反应产物和甲氧基苯胺和二价阴离子的离子对时，它提供最快速的反应(参见图12)。理想的质量比为约2:8苯胺:实例10的产物。当二价阴离子是硫酸时，发生最有效的反应，然而，二磺酸取代的芳族体系和磷酸也可以以降低的速率使用。hcl仅提供有限的反应。在反应中，mpo氧化产物之一似乎是两种苯胺组分的二聚体(参见图13)。

这种底物的主要要求是它们不与血红素反应。各种甲氧基苯胺可以用作固蓝的替代品，然而，它们(3,4-二甲氧基苯胺2,5-二甲氧基苯胺)倾向于仅与血红素和过氧化物反应生色团。为避免这种情况，需要通过酰胺进行失活。多种各样的取代基是可行的。通过直接烷基化或实例10的环氧化反应的变异体，烷基锚定部分可以被其它类似的亲脂基团取代。类似地，酰胺基团可以变化

插入马库什图-固蓝

实例109：在固体材料如纸或非织造材料等上制备底物

弹性蛋白酶检测：使用浸渍分散混合物(0.25％(w/w)诺乃洗涤剂，2％(w/w)癸醇将滤纸圆圈(6mm)在ph为8的0.05m硼酸盐缓冲液中浸渍1到2分钟。之后将滤纸置于玻璃板上并在54℃下干燥1到2小时。干燥后，将来自实例1的弹性蛋白酶-底物fmocaapv吲哚氧基酯(甲醇中20mg/ml)以2μl步骤分2次移液至圆圈，直到对每个测试圆圈(20mm2)施加最终量80μg。

可替代地，弹性蛋白酶底物fmocaapv吲哚酯(实例1)可以在甲醇中与4-重氮-3-甲氧基二苯基硫酸盐和/或2-甲氧基-4-吗啉代苯重氮盐混合，最终浓度为10mg/mlfmocaapv吲哚酯和5到10mg/ml的对应重氮盐(或两者的组合)。将混合物以2μl步骤2次移液到浸渍的测试圆圈上。

mpo检测：通过移液2μl的实例108的材料的40mg/ml溶液将滤纸圆圈(直径6mm)浸渍在dmso:甲醇(1份dmso，2份meoh)中，随后进行干燥步骤(48小时，室温)。向其中添加10μg葡萄糖和3μl0.1％葡萄糖氧化酶(3μg)水溶液。

表明水分接触的阳性对照是基于含有戊二醛的脱乙酰壳多糖中溴百里酚蓝的制剂的ph指示剂。将混合物移液到报道分子区域中，干燥后得到暗黄色指示系统。

可替代地，可以使用乙醇中的0.1％溴甲酚紫溶液。因此，将1.4μl移液到滤纸盘(直径6mm)上，并在50℃到60℃下干燥1.5小时。

可以将这些各种滤纸放在棒上，以允许在护理点处同时评估体液。我们将这些称为量油尺。

实例110：气道抽吸物的临床评估

实例109的量油尺通过适当的储存保持在活动状态，并递送到临床设施以供测试。它们可以用于评估呼吸道吸出物的感染状态。为了测试它们检测这些材料中感染的能力，棒用于评估作为重症监护程序的一部分插管的患者的抽吸物。吸出物被作为日常护理的一部分。抽吸后，将所产生的材料与量油尺接触并允许其反应最多6分钟。取决于反应程度，可以获得指示生物标记物酶的推定浓度的各种截止值。在高于背景水平的吸出物中存在的弹性蛋白酶或mpo是潜在感染的指示剂。为了解释这些数据的效用，将对试纸的反应与临床上已知的样品进行比较。在一些情况下，已知样品取自正在接受感染治疗的患者。在其它情况下，患者被认为没有气道感染。在某些情况下，样品取自随后在两天内发生感染的患者。这些样品被认为是“未感染的”，因为它们是在临床诊断时获取的。然而，在未来的研究中，我们将来自将在两天内发生感染患者的样品分类为“感染的”。

通过117个样品评估了总共52名患者。可以根据对每种生物标记物的反应程度和用于指示感染的截止值将数据制成表格。这些数据总结在以下数据集中。

对所有117例患者样品中的弹性反应进行分析。

使用这两种生物标记物分析52名患者

这些数据是生物标记物响应的分析，其中报告生物标记物的反应时间和使用的截止值。因此，hne62,3表示观察反应6分钟，并且图10b中的实例的第4点的反应程度用于表明存在阳性样品。使用更高的mpo截止值(3,4)支持这一发现。

然而，许多患者在感染发展时被抽样并被归类为“未感染的”。下面说明了这种现象的实例。在下图中，诊断出临床感染的日期被表示为t0。t-1和t-2是在临床诊断感染之前的取样日期。

这些数据表明，生物标记物的反应可以表明在对icu工作人员临床上显现之前即将发生的感染。这些数据还表明，显色底物能够有效地指示气道吸出物中与其感染状态一致的酶标记物的异常水平。

实例111：负压伤口治疗液的临床评估

可以通过将真空施加到伤口区域来介导伤口愈合。这可能具有许多效果，包含通过伤口从体内吸取浆液，并且使其带有生长因子、免疫细胞和营养素。它还可以促进或刺激颗粒组织增殖。从此过程中出现的流体是伤口床状态的指示器。评估感染生物标记物的存在可以提供伤口是否处于良好状态而无需移除敷料或真空海绵的指示。

为了评估这种方法的有效性，我们从这种真空获得的流体采集样品并测试了量油尺的响应。结果与关于伤口和实例110中所述的观察结果的已知结果一致。即，在诊断的或疑似的感染的情况下存在明显的生物标记物响应(参见图10a)。

实例112：将指示剂材料置于医疗装置中使用的管中

在前两个实例中，从源中取出流体并使用量油尺系统分析以估计生物标记物响应。然而，也可以将含有标记物的材料原位放置在医疗装置中。这些材料可以被认为是一种监测系统的形式。对于这种应用，材料需要适合消毒，并且需要在适当的时间范围内作出响应。例如，对于许多用途，如伤口的真空治疗或呼吸机，24小时的时间足以表明状态的潜在变化。为此，不需要量油尺的快速反应。

格式也不同。在图9中，指示了各种格式。在图9b中，示出了可以容纳实例109中描述的滤纸圆圈的格式。然而，这种格式可以更简单，因为管子和圆柱形支架可以转换成容纳纸或非织造材料、聚烯烃或其它惰性材料的纤维素，所述惰性材料是反应性底物的载剂或固体支持物(见图9a、图9c和图9d)。

为了测试这个概念，我们准备了用实例109中所述的材料处理的具有一些改进的纸或非织造材料、聚烯烃或纤维素。具体地，没有印刷或用重氮盐涂覆弹性蛋白酶底物。这是因为在这种情况下不需要快速反应。吲哚氧基到发色团的转化通常是通过氧化进行的，并且重氮盐提供直接反应而不需要氧气。在监测设置中，反应时间并不重要。类似地，对于mpo，氧气是重要的，并且在这是限制的情况下，反应速率是有限的。

在这种格式中，流体的路径引起支持材料的润湿和底物的转换。转换后的基板然后作为条纹可见。在一定时间内条纹的存在用作流体源可能已被感染的事实的指示。这种颜色指示器可以放置在与体液接触的真空线中。它也可以放在抽吸管或呼吸机装置中。

实例113：生物标记物的电子监测

产生颜色的底物是允许在不使用装置的情况下允许解释生物标记物响应的手段。但是，在某些情况下，在线监测或定量可能需要进行电子评估。为此目的可以采用一系列模式。

颜色感测是一种可以放置传感器以读取反射光颜色并且因此读取试剂变化率的方法。然而，使用传感器的颜色测量依赖于相对于样品颜色仅具有有限背景颜色或高对比度的流体。为了实现颜色感测，将电子板放置成与量油尺或芯片系统上的试剂相对。所述板包含光源(例如具有红色、绿色和蓝色的小led)和感测芯片。记录随时间变化的信号以估计样品中的活性。

另一种模式是电流感测。这与产生或消耗redox活性产物如吲哚(溶菌酶、弹性蛋白酶)或过氧化物(mpo)的底物有关。底物的氧化产生可以通过适当电极测量的电流。由酶释放的redox活性剂的实例不仅包含本文多次提到的吲哚氧基，而且还包含如图11中所述的二茂铁。

实例114：指示剂底物的溶解度

酶底物与如纸等固相结合的能力对其功能很重要。为了测试干燥的底物抵抗再溶解到水相的程度，使用适当的溶剂(丙酮、甲醇、dmso等，参见实例109)将底物施加到固相上并使其在室温下干燥至多48小时。此后，将纸或非织造材料在50ml水或人工伤口流体(含有氯化钾的磷酸盐缓冲盐水中2％牛血清白蛋白，尿素ph为7.2)中孵育2分钟，同时旋转轻轻搅拌，之后使用连续更换的流体再次洗涤，例如，4次更换50ml。通过许多方法估计底物的溶液或损失。这些包含溶解溶液的lcmsms分析或通过酶促反应或通过lcuv或lcmsms直接分析固相材料的残余分析。lcms方法如下：

hplc级甲醇、乙腈、水dmso和thf用于制备原材料并且用作流动相。在agilent1260系列hplc系统上进行定量分析，其中absciexapi4000质谱仪用作检测器。所使用的柱是在45℃下操作的reprosilpurphenyl3μm60x2mm。流动相为：水+0.1％甲酸和乙腈。色谱运行是梯度，流速为500μl/min。注射体积为5μl。对于实例1的产物，检测到的亲本/片段种类为694/561，对于实例10的产物为485/467，对于固蓝为273/258。

对于每种分析物，分别为甲醇中的每种化合物制备10mg/ml的标准储备溶液，1:3的dmso:甲醇混合物和1:1的dmso:甲醇混合物。将原液以1:100溶解在thf中，并在thf中进一步制备1:10稀释液，校准范围为0.1-10000ng/ml。

根据实例109进行通过酶促反应的测定，其中在已经漂洗和干燥底物后，将其它所需试剂添加到材料中。一旦添加了所需的辅剂(缓冲液、活化剂)，就添加过量的酶。然后将反应与未洗涤的样品进行比较。理想的底物或底物制剂抵抗50ml水的2次或更多次变化而基本上没有反应性损失。

此实验系统定义了在滤纸上干燥时底物的“耐水性”。因此，耐水性1意味着在50ml人造伤口流体改变1次后仍可见的信号。耐水性2意味着在50ml人工伤口流体改变2次后仍可见的信号等等。

实例115：蛋白酶底物

组织蛋白酶的底物可以使用前面的肽吲哚基偶联实例的方法制备。序列变异用于改变酶选择性。

实例116：蛋白酶底物制备

可以通过偶联二肽最有效地制备肽底物，如本文所述的那些肽底物。以受保护形式制备二肽aa和pv允许它们随后直接偶联以形成期望的aapv产物。

实例117：病毒蛋白酶底物制备

在某些情况下，病原体不是细菌而是病毒。在上呼吸道中，大多数感染本质上是病毒性的。在某些情况下，病毒感染在不引起细菌超感染的情况下消退。然而，通常在病毒感染的情况下也促进细菌。这是因为病毒经常在感染期间抑制免疫系统，并且然后促进炎症反应以便更好地分布(粘液、咳嗽和打喷嚏)。

病毒使用自编码蛋白酶或宿主蛋白酶。编码其自身蛋白酶的病毒类型采用3c蛋白酶的类似物。

3c蛋白酶的共识识别是leu-glu-val-leu-phe-glnon基序或levlfqu-va。因此，评估病毒信号存在的粘液样品的一种方法是将显色底物用作病毒蛋白酶。一个这种实例是肽levlfq-吲哚基，其中c-末端被酯化成吲哚基。

相比之下，许多病毒类型不对其自身蛋白水解功能进行编码，但反而使用宿主功能。常见的是病毒使用弗林蛋白酶。共有弗林蛋白酶裂解位点(-rrrr-或-rrkr或rlgr或llgr或llar)是高度碱性的。不能由聚精氨酸方便地形成显色弗林蛋白酶底物，而是使用赖氨酸替代物。发色底物的一个实例是llar-吲哚氧基或llal-吲哚氧基。可替代地，精氨酸被tosyl基团保护，所述基团是可用于精氨酸的保护基团的空间上最不麻烦的。

虽然已经在本文示出并描述了所公开的技术的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见的是这样的实施例仅以举例方式提供。在不脱离所公开的技术的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以在实践所公开的技术时采用本文所述的公开技术的实施例的各种替代方案。所附权利要求旨在限定所公开技术的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。