生物分子的提取方法、提取系统以及提取容器与流程

本发明涉及对用胶带采集的皮肤组织中所含的生物分子进行提取的方法以及系统。

背景技术：

在皮肤科学的领域中，用于评价皮肤的状态的方法之一有蛋白质分析。分析皮肤的蛋白质的方法已知例如染色法、抗原抗体法等(非专利文献1、2)。为了分析蛋白质，需要从皮肤组织采集蛋白质。从皮肤组织采集蛋白质的方法之一有胶带剥离法(专利文献1)。胶带剥离法是使用贴附于肌肤的粘合带将皮肤组织的一部分剥离从而非侵袭性地采集皮肤组织的方法。其后，从采集的皮肤组织提取蛋白质。胶带剥离法能够较简便地进行皮肤组织的采集。另外，陔方法在受试者的负担小的方面优异。因此，使用胶带剥离法的皮肤组织的采集在不易对受试者的肌肤强加负担的面向一般消费者的肌肤检查等中，近年来受到关注。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-249429号公报

非专利文献

非专利文献1：i.l.a.boxman，p.j.hensbergen，r.c.vanderschors，d.p.bruynzeel，c.p.tensenandm.ponec，br.j.dermatol.，146，777-785(2002)

非专利文献2：stephenm.keyseandrexm.tyrrell，proc.natl.acad.sci.，86，99-103(1989)

技术实现要素：

然而，从通过胶带剥离法采集的皮肤组织提取蛋白质的方法存在进行提取的使用者的工艺复杂、蛋白质的提取量存在偏差的课题。本发明的目的在于，提供能够使用通过胶带剥离法采集的皮肤组织简便且稳定地进行蛋白质的提取的方法以及系统。

本发明的生物分子的提取方法是使用提取容器内的提取试剂和磁性体来提取皮肤组织中所含的生物分子的方法，特征如下。即，使采集了皮肤组织的胶带接触提取试剂和磁性体，使提取容器内的磁性体凭借设置于由提取容器的外部的磁石产生的磁力而移动，通过磁性体与附着有皮肤组织的胶带的机械摩擦而将生物分子从皮肤组织提取到提取试剂中。

本发明的生物分子的提取方法能够从使用胶带采集的皮肤组织简便且稳定地提取生物分子。

附图说明

图1为示意性地表示本实施方式中的蛋白质的提取装置的立体图。

图2为示意性地表示本实施方式中的蛋白质的提取系统的截面图。

图3为示意性地表示本实施方式中的蛋白质的提取系统的俯视图。

图4为示意性地表示本实施方式中的蛋白质的提取容器的俯视立体图。

图5为表示本实施方式中的蛋白质的提取方法的流程图。

图6为表示显示实施例1中的聚乳酸珠的sem图像的图。

图7为表示实施例1中的蛋白质的提取量的图表。

图8为表示显示实施例2中的磁性铁素体不锈钢的sem图像的图。

图9为表示实施例2中的蛋白质的提取量的图表。

图10为表示实施例3中的蛋白质的提取量的图表。

图11为表示本实施方式中的蛋白质的提取系统的另一例的截面图。

图12为表示本实施方式中的蛋白质的提取系统的另一例的截面图。

具体实施方式

以下，对于本发明的实施方式涉及的生物分子的提取方法和提取系统，使用附图进行详细说明。需要说明的是，以下说明的实施方式均为表示本发明的优选的一个具体例的实施方式。因此，用以下的实施方式表示的数值、形状、材料、构成要素、构成要素的配置和连接方式等为一例，并不限定本发明。因此，以下的实施方式中的构成要素之中，对于表示本发明的最上位概念的独立技术方案中没有记载的构成要素，作为任意的构成要素进行说明。

另外，各图为示意图，并非严格进行图示的图。各图中，对于实质上同一结构赋予同一符号，省略或简化重复的说明。

(实施方式)

图1为示意性地表示本实施方式中的生物分子的提取系统的立体图。图2为示意性地表示本实施方式中的生物分子的提取系统的截面图。图3为示意性地表示本实施方式中的生物分子的提取系统的俯视图。

生物分子的提取系统100包括提取容器20和提取装置50。

需要说明的是，生物分子是指例如从角质层中提取的蛋白质、脂质或常驻菌的脱氧核糖核酸(dna)等。以下，以生物分子为角质层中所含的蛋白质为例进行说明。

图4为示意性地表示本实施方式中的提取容器20的立体图。

提取容器20具有提取部21、在提取部21配置的磁性体22、和贴附采集了皮肤组织的采集胶带40的贴附面23。还具有与提取部21连接的注入通路24和回收通路25。提取试剂通过注入通路24向提取部21注入。另外，提取了蛋白质的提取溶液通过回收通路25被回收。

提取容器20可以使用树脂材料、玻璃或金属材料的基板28等来制作。树脂材料例如为聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate、简称pmma)、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiroxane、简称pdms)。金属材料可以使用不锈钢等。需要说明的是，金属材料可以使用例如钛、医疗用不锈钢等生物体适配性高的金属等。提取容器的材料可以是与提取试剂不显示显著的反应的其它材料。

提取部21例如为在构成提取容器20的基板28上设置的凹部。提取部21在俯视下具有圆形。提取部21设置于提取容器20的贴附面23。也就是说，提取部21在被贴附于贴附面23的采集胶带40覆盖的位置形成。凹部中导入有角质层蛋白质的提取试剂。另外，在凹部配置有磁性体22。需要说明的是，提取部21的形状不限于圆形。例如，提取部21的形状在俯视下可以是四边形、液滴型。

磁性体22例如为磁性珠。磁性体22的直径例如为50μm以上且2mm以下。磁性体22的直径根据提取部21的深度适当决定。

磁性体22为对于磁石的接近具有磁性的材料即可，可以使用强磁性体、顺磁性体。但是，为了不影响后面的生化分析，磁性体22优选生物实验用的磁性珠或医疗用的磁性不锈钢粒子等。这些材料具有耐腐蚀性，在生理ph的水溶液中不产生金属离子。另外，磁性体22优选为对于提取的角质层蛋白质难以发生非特异性吸附的材料。需要说明的是，磁性体22可以是被聚合物等高分子材料覆盖的磁性珠。

磁性体22在提取部21的底面或侧面担载。磁性体22期望固定于提取部21。作为将磁性体22担载于提取部21的底面或侧面的担载部的方法，有利用磁力进行担载的方法、将水溶性物质作为接合剂担载的方法等。在此，水溶性物质为淀粉、壳聚糖、纤维素或盐等。固定于担载部的磁性体22在提取过程中从担载部剥离，在提取试剂中悬浮。

贴附面23是在提取容器20形成开口的面。在贴附面23贴附采集皮肤组织的采集胶带40。

采集胶带40具有采集皮肤组织的角质层采集部41、和将采集胶带40贴附于提取容器20的贴附面23的粘接部42。采集胶带40至少一面具有粘合力，为了从皮肤的表面采集角质层而使用。采集胶带40按照覆盖提取部21的开口的整面的方式贴附。角质层采集部41设置于面向提取部21的位置。

采集胶带40是能够将皮肤组织附着于表面的载体的一例。作为载体的其它形态，也可以是在表面没有粘合面的片材、板。该情况下，由于皮肤组织另外采集并附着于载体，在载体的表面形成粘合层即可。然后，使皮肤组织附着于载体后，与上述的采集胶带40同样地贴附提取容器20即可。需要说明的是，载体优选平坦。

注入通路24和回收通路25在提取容器20形成。注入通路24和回收通路25与提取部21连接。

回收通路25在排出口具有栓26。另外，回收通路25具有过滤器27。

栓26按照提取溶液不会从提取部21泄露的方式设置。

过滤器27可以从提取了角质层蛋白质的提取溶液中分离磁性体22。过滤器27可以使用例如无纺布、多孔体等。过滤器27的空隙的大小小于磁性体22的直径。通过在回收通路25设置过滤器27，能够从提取溶液容易地分离磁性体22。因此，能够容易地进行其后的蛋白质的分析。

另外，过滤器27可以为了除去蛋白质提取时产生的接合剂的渣滓和角质层样品中的不溶组分而设置。该情况下，过滤器27的原材从不锈钢、聚丙烯、特氟龙(注册商标)、硅等中适当选择目标蛋白质的吸附少的原材来使用。孔径也根据磁性体22的分离来选择。另外，过滤器27还可以用制作提取容器20时相同的材料来制作。

需要说明的是，磁性体22可以通过使用提取装置50的磁石52使其靠近到提取部21的单侧，从而不利用过滤器27地从提取溶液除去。

提取装置50具有用于放置提取容器20的配置部51、在与配置于配置部51的提取容器20的贴附面23对置的位置设置的磁石52、驱动磁石52的驱动部53、以及控制磁石52和驱动部53的动作的控制部54。驱动部53具有支承部58。磁石52在支承部58的下面设置。

磁石52使配置于提取容器20内的磁性体22移动。也就是说，磁性体22按照通过磁石52的运动在提取部21的内部移动的方式控制。提取装置50通过根据磁石52的运动而在附着有皮肤组织的采集胶带40与接触采集胶带的磁性体22之间产生的机械摩擦，从附着于采集胶带40的皮肤组织中提取角质层中所含的蛋白质。

配置部51是配置贴附采集胶带40的提取容器20的位置。配置部51可以是例如在板55上放置提取容器20的槽。

磁石52用于控制配置于提取部21的磁性体22的运动。磁石52为具有磁力的磁石即可。磁石52优选使用例如具有强磁力的钕磁石。另外，磁石52可以是电磁石。电磁石能够凭借通过电控制而产生的磁场的变化而使磁性体22移动。该情况下，电磁石可以不移动。

驱动部53使磁石52移动。磁石52例如设置于支承部58。支承部58与驱动部53连接。驱动部53为例如马达或致动器。

驱动部53的动作通过控制部54被控制。也就是说，控制部54通过磁石52来控制磁性体22的运动。需要说明的是，使用电磁石作为磁石52的情况下，控制部54控制电磁石的磁场的变化。

需要说明的是，在提取系统100中，提取容器20可以固定于提取装置50的配置部51。此时，提取容器20是构成提取装置50的一部分。提取容器20是提取装置50的构成的一部分的情况下，提取容器20可以不是一次性的，而清洗并反复使用。

试剂罐56可以加入向提取部21注入的提取试剂。试剂罐56经由流路57和注入通路24与提取部21连接。提取试剂通过流路57和注入通路24注入提取部21。试剂罐56的材料为对于提取试剂具有耐腐蚀性的材料即可。

需要说明的是，在蛋白质的提取过程中，将磁性体22放入提取部21的情况下，磁性体22可以不事先担载于提取部21。另外，在蛋白质的提取过程中，使用者手动进行提取试剂和提取溶液的注入和回收的情况下，提取容器20可以不具有注入通路24和回收通路25。

以下，对角质层中所含的蛋白质的提取方法进行说明。

图5为表示蛋白质的提取方法的流程图。

使用者将覆盖角质层采集部41的保护胶带剥落并粘贴于肌肤。此时，期望事先将涂抹于肌肤的化妆品洗去，用70％乙醇等清洁肌肤。使用者在肌肤的分析对象部位贴附采集胶带40。其后，以均匀的力擦拭采集胶带40的角质层采集部41整体30秒钟左右后，静静地剥离。包含角质层蛋白质的皮肤组织附着于采集胶带40的角质层采集部41。由此，使用者能够非侵袭性地采集肌肤表面的角质层(s01)。

接着，将采集了皮肤组织的采集胶带40贴附于提取容器20的贴附面23(s02)。采集胶带40将提取容器20的提取部21的开口密封。附着有皮肤组织的角质层采集部41位于形成于贴附面23的开口，面向提取部21。

然后，在将采集胶带40贴附于提取容器20的状态下，向提取部21注入提取试剂(s03)。此时，提取试剂加入到与采集胶带40的角质层采集部41和皮肤组织接触为止。提取部21期望被提取溶液完全充满。此时，固定于提取部21的磁性体22从担载部解离。

其后，使提取装置50的磁石52接近提取容器20的采集胶带40地运动(s04)。此时，放入提取部21的磁性体22在提取试剂中移动，靠近磁石52。磁石52例如相对于采集胶带40平行地移动。需要说明的是，磁石52的运动是例如图中箭头所示那样的直线动作。另外，磁石52的运动可以是画圆的动作、蛇行的动作或3维的动作。

磁石52相对于采集胶带40配置于磁性体22的相反侧。因此，靠近磁石52的磁性体22与采集胶带40接触。通过使磁石52移动，磁性体22在与采集胶带40接触的状态下沿着采集胶带40的附着有皮肤组织的面移动。此时，在磁性体22与采集胶带40之间产生机械摩擦。通过该机械摩擦力，使角质层蛋白质从附着于采集胶带40的皮肤组织剥离，溶解于提取试剂中。按照这种方式，能够提取角质层蛋白质。

需要说明的是，采集胶带40可以放入例如提取部21内。例如，可以将采集胶带40的与设有角质层采集部41的面相反侧的面贴附于提取部21的侧面、或底面。该情况下，可以通过将磁石52从贴附了采集胶带40的提取容器20的面的外侧靠近地移动，使提取部21内的磁性体22与采集胶带40接触。因此，在磁性体22与采集胶带40之间产生机械摩擦，能够从附着于采集胶带40的皮肤组织提取角质层蛋白质。

提取试剂可以在向提取容器20贴附采集胶带40前注入。此时，可以与提取试剂同时将磁性体22放入提取部21。该情况下，也优选提取试剂被提取部21完全充满。

以下，一边示出具体的实施例一边进一步说明本发明。需要说明的是，以下的实施例是为了进一步详细说明本发明的一例，实施方式不受以下的实施例限定。

(实施例1)

对于使用磁性聚乳酸珠作为磁性体的蛋白质的提取试验，在以下进行叙述。

以下，对于实施例1进行说明。实施例1中使用不具有注入通路24和回收通路25的提取容器20进行角质层蛋白质的提取。作为采集胶带40，使用promotool公司制的角质检测仪(产品名)。提取容器20使用聚苯乙烯制的96孔微孔滴定板。提取部21为板的容池(直径约7mm)。磁石52使用具有纵1cm、横1cm、高2cm(1cm×1cm×2cm)的长方体形状的钕磁石。磁性体22使用平均粒径为100μm的磁性聚乳酸珠。图6为表示本实施例中使用的磁性聚乳酸珠的sem图像。磁性体22通过磁力担载于提取部21的内部，填充提取试剂后在提取试剂中解离。

导入提取部21的提取试剂使用添加了氯化钠(nacl)和十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate、简称sds)的三盐酸缓冲液(tris-hcl)(ph8.0)。需要说明的是，提取试剂的最终浓度是tris-hc为150mm、nacl为120mm、sds为1％(w/v)。磁性聚乳酸珠按照成为10⁴个/容池的方式担载。

首先，向用70％(v/v)的乙醇溶液擦拭清洁过的肘内侧的皮肤贴附遮蔽了的采集胶带40，对胶带表面摩擦10秒钟左右。其后，将采集胶带40从皮肤剥离，贴附在事先填充了提取试剂和磁性体22的板上，将容池密封。此时，可以从采集胶带40之上贴附其它粘合带等，来提高粘接强度。需要说明的是，上文中，mm为mmol/l的简称，表示每1升的物质的量(毫摩尔数)。另外，w/v表示(溶质的质量)/(溶液的体积)，v/v表示(溶质的体积)/(溶液的体积)。

接着，将钕磁石从被采集胶带40密封的容池上，与采集胶带40平行地以约100往返/分钟的速度直线运动。由此，按照使提取部21内的磁性体22与采集胶带40接触的方式运动。使磁石52运动的时间设为1分钟、3分钟和5分钟。

提取角质层蛋白质后，从板静静地剥离采集胶带40，用微型吸移管回收蛋白质的提取溶液。提取的角质层蛋白质的量利用二辛可宁酸(bicinchoninicacid、简称bca)法，以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin、简称bsa)换算进行定量。

图7为表示本实施例中的实验结果的图表。根据图7，在1片采集胶带40中能够提取2～4μg的角质层蛋白质。另外，随着使磁石52运动的时间变长，蛋白质的提取量变多。

(实施例2)

在以下叙述使用磁性铁素体不锈钢作为磁性体的蛋白质的提取试验。

实施例2也按照实施例1进行。但是，使用磁性铁素体不锈钢粒子(平均粒径70μm)作为磁性体22。图8为表示本实施例中使用的磁性铁素体不锈钢粒子的sem图像。

在提取部21，按照磁性铁素体不锈钢粒子成为10％(w/v)的方式填充。移动磁石52的时间设为1分钟、3分钟和5分钟。

图9中示出实验结果。根据图9，随着移动磁石的时间变长，蛋白质的提取量变多。另外，由图7与图9的比较可知，与磁性聚乳酸珠相比，使用磁性铁素体不锈钢粒子时，成为提取量多的结果。由图6和图8所示的sem图像可知，聚乳酸珠为圆形，与此相对，磁性铁素体不锈钢粒子为在表面具有突起的形状。磁性铁素体不锈钢粒子的表面的突起还有锐利的形状的突起。因此，认为磁性铁素体不锈钢粒子的这样的形状产生将角质层的细胞高效地从胶带剥落的效果，结果成为得到大的提取量的要因之一。

(实施例3)

在以下叙述使用pmma的提取腔的蛋白质的提取试验。

实施例3按照实施例2进行。但是，使用asahibiomed公司的角质检测仪作为采集胶带40。另外，使用pmma的提取腔作为提取容器20。pmma的提取腔通过对厚度2mm的pmma的板进行切削加工，并用二氯甲烷的接合剂贴附来制作。提取部21的形状是开口部直径2cm、高度2mm。需要说明的是，腔的形状不限于此，可以根据提取液的体积、制作的微流体芯片的设计来适当变更。

图10中示出本实施例中的实验结果。根据图10，随着移动磁石的时间变长，蛋白质的提取量变多。提取量在提取时间为3分钟和5分钟下基本相同。因此，认为在本条件下以3分钟以上的处理能够提取充分量的蛋白质。另外，实施例3的蛋白质的提取量与实施例2相比平均来说变多。这是由于，若增大提取部21的开口部，则能够增大角质层采集胶带面积，因此蛋白质的提取量变多。

需要说明的是，为了检测微量的蛋白质，在进行检测之前优选将提取溶液浓缩。另外，通过减小提取部21的体积，即使不进行浓缩的操作，也能高灵敏度地检测微量的蛋白质。作为减小提取部21的体积的方法，例如使提取部21的深度变浅即可。

接着，对角质层蛋白质的提取系统的另一例进行说明。

对于与角质层蛋白质的提取系统100同样的构成赋予同一符号，省略其详细说明。

图11为示意性地表示本实施方式中的角质层蛋白质的提取系统的另一例的截面图。

提取系统130中使用的提取容器120还具有分析部121。分析部121与提取部21经由回收通路25连接。回收通路25具有用于将磁性体22或杂质从提取溶液分离的过滤器27。通过设为这样的构成，能够将提取部21中提取的包含角质层蛋白质的提取溶液容易地导入分析部121。

图12为示意性地表示本实施方式中的角质层蛋白质的提取系统的再一例的截面图。

提取系统150中，提取容器20将贴附面23设为下侧配置于提取装置140。

提取装置140中，磁石142设于配置部141的下侧。配置提取容器20的面具有开口。通过具有开口，能够使磁石142更接近采集胶带40。

通过将提取容器20的贴附面23设为下侧，采集胶带40位于提取部21的下侧。因此，流入提取部21的提取试剂确实地与采集胶带40和附着于采集胶带40的皮肤组织接触。因此，即使在提取部21没有被提取试剂完全充满的状态下，也能从皮肤组织高效地提取角质层蛋白质。

以上，对于一个或多个方案的角质层蛋白质的提取方法和提取系统，基于实施方式进行了说明，但本发明不限于该实施方式。只要不脱离本发明的主旨，将本领域技术人员可以想到的各种变形施用于本实施方式的形态、将不同实施方式中的构成要素组合而构筑的形态也可以包含在一个或多个方案的范围内。

产业上的可利用性

本发明在作为用于进行肌肤的角质层中所含的蛋白质的分析等的前处理进行的角质层蛋白质的提取中特别有用。

符号说明

20、120提取容器

21提取部

22磁性体

23贴附面

24注入通路

25回收通路

26栓

27过滤器

28基板

40采集胶带

41角质层采集部

42接着部

50、140提取装置

51、141配置部

52、142磁石

53驱动部

54控制部

55板

56试剂罐

57流路

58支承部

100、130、150提取系统