测定动物组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的方法与流程

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种测定动物组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的方法。

背景技术：

寄生虫感染是危害畜禽生产和畜牧业发展的重要疾病，其防治以药物为主。抗药性是畜禽寄生虫病防治中面临的日益严峻的问题，因此寻找和开发新的抗寄生虫药尤为必要。莫奈太尔(monepantel，mop)是一种新型氨基乙腈衍生物类驱虫药，其化学名称为：n－[(1s)－1－氰基－2－(5－氰基－2－三氟甲基－苯氧基)－1－甲基－乙基]－4－三氟甲基磺酰基－苯甲酰胺。cas登记号：887148－69－8，分子式是c20h13f6n3o2s，分子量为473.39。莫奈太尔口服液(商品名)2009年9月首先在欧洲批准上市，用于治疗和控制羊肠道蠕虫感染。随后，该药在澳大利亚、新西兰和巴西等国家上市。国外已有大量研究表明该药具有较好的驱虫效果，同时还制定了莫奈太尔的最大残留限量。欧盟37/2010规定：莫奈太尔的标志物为莫奈太尔砜，其最大残留限量为：牛羊肌肉0.7mg/kg,牛羊肝脏5mg/kg,牛羊肾脏2mg/kg。该法规已于2013年6月29日生效。2015年cac在第38次会议通过了新增莫奈太尔药物列入《食品中兽药残留的最大残留限量和风险管理建议》。cac规定了：莫奈太尔的最大残留限量分别为：羊肌肉0.5mg/kg,羊肝脏7mg/kg,羊肾脏1.7mg/kg。我国尚未对该药进行系统研究，也未制定出动物性食品中的莫奈太尔的最大残留限量。经查阅，我国在国家标准和各行业标准中未有关于动物性食品中莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的检测方法标准，尚未发现有关莫奈太尔和莫奈太尔砜残留检测的公开文献。因此，建立快速准确测定动物组织中的莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的检测方法已迫在眉睫，以保障食品安全。

技术实现要素：

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、快速、灵敏、定性定量准确的测定动物组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的方法。

莫奈太尔的化学结构式如下：

莫奈太尔砜的化学结构式如下：

为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：

一种测定动物组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜残留量的方法，其包括以下步骤：

步骤1：配制标准溶液；

步骤2：处理并净化动物组织样品；

步骤3：使用液相色谱进行测定。

作为一种优选的实施方式，所述动物组织为动物肌肉、肝脏、肾脏组织。

作为一种优选的实施方式，所述步骤1包括配制标准储备液、混合标准中间液、标准工作液和定容液。

进一步，配制所述标准储备液的步骤为：分别配制莫奈太尔和莫奈太尔砜标准溶液；分别准确称取莫奈太尔和莫奈太尔砜标准品，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的标准储备液。

进一步，配制所述标准中间液的步骤为：分别吸取所述标准储备液至50ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为20mg/l的标准中间液。

进一步，所述标准工作液的浓度包括0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l、10mg/l。

进一步，配制所述定容液的步骤为：将70ml甲醇和30ml水溶液混合摇匀。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2的具体操作如下：称取试样5.00g至50ml的离心管a中，加入15ml乙腈，超声10min,均质提取30s，提取液以4000r/min离心5min；上清液转移至吹氮管中；取一50ml离心管b,加入10ml乙腈以洗涤匀浆捣10s。洗涤液转入离心管a中，用玻棒捣碎下层残渣，超声10min,在涡旋振荡器上振荡2min，4000r/min离心5min，上清液合并至所述吹氮管中，50℃吹氮浓缩至干；残渣用1.0ml所述定容液溶解，涡旋振荡1min，超声5min。加入3ml正己烷涡旋振荡0.5min，3000r/min离心5min，弃去上层溶液，再用正己烷重复脱脂一次，下层溶液在12000r/min下离心5min，经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱测定。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中的液相色谱条件如下：色谱柱条件为：inertsilc8-3，4.6mm×150mm，5μm；流动相：a相为甲醇，b相为水溶液；梯度洗脱条件为：0～10min,60％～70％a相；10～12min,70～90％a相；12～13min,90～60％a相；流速为：1.0ml/min；柱温为：40℃；进样量为：40μl。

作为一种优选的实施方式，所述动物肌肉中莫奈太尔和莫奈太尔砜的检测定量限为0.05mg/kg。

作为一种优选的实施方式，所述动物肝脏中莫奈太尔和莫奈太尔砜的检测定量限为0.1mg/kg。

优选地，所述莫奈太尔和所述莫奈太尔砜在动物肌肉组织中被检测到的质量浓度为0.1～10mg/l。

优选地，所述莫奈太尔和所述莫奈太尔砜在动物肝脏组织中被检测到的质量浓度为0.1～10mg/l。

优选地，液相色谱检测中，莫奈太尔的回归方程为y＝22375.4x-450.732，其中x为浓度，y为峰面积。

优选地，液相色谱检测中，莫奈太尔砜的回归方程为y＝24661.8x-324.691，其中x为浓度，y为峰面积。

本发明的方法以动物肌肉、肝脏、肾脏组织为试样，采用乙腈提取，液液萃取净化后，经inertsilc8-3(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱分离，以甲醇-水溶液为流动相，采用二极管阵列检测器，液相色谱法检测，外标法定量。结果表明：动物肌肉中莫奈太尔和莫奈太尔砜在0.1～10mg/l质量浓度范围内线性关系良好，定量限为0.05；动物肝脏中莫奈太尔和莫奈太尔砜在0.1～10mg/l质量浓度范围内线性关系良好，定量限为0.1mg/kg。在三个加标水平下的平均回收率为83.2％～94.1％，相对标准偏差为3.5％～7.4％。该方法操作简便，快速，灵敏度高，抗干扰能力强，回收率和重复性良好，定性定量准确，适用于动物肌肉、肝脏组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜的测定。

附图说明

图1是莫奈太尔的回归方程。

图2是莫奈太尔砜的回归方程。

图3为牛肉空白的色谱图。

图4为牛肉空白标准添加样品的色谱图。

图5为羊肝空白的色谱图。

图6为羊肝空白标准添加样品的色谱图。

图7为标准溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

1材料与方法

1.1材料与试剂

牛肉；羊肝和牛肾由广州市农贸市场购买。

莫奈太尔和莫奈太尔砜(美国witega公司)；乙腈(色谱纯)(美国tedia公司)；乙酸铵(优级纯)(印度fluka公司)；去离子水由millipore公司超纯水机制得。

1.2仪器与设备

uflclc-20a超高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器(日本岛津公司)；吹氮浓缩仪(美国zymarkturbovap.lv公司)；涡旋振荡器(德国ika公司)；t25型均质器(德国ika公司)；3-16k型高速离心机(德国sigma公司)。

1.3方法

1.3.1标准溶液配制

标准储备液的配制：分别准确称取适量莫奈太尔和莫奈太尔砜标准品置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的标准储备液，-18℃冰箱保存。

混合标准中间液(10mg/l)：分别吸取适量的标准储备液至50ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为20mg/l标准中间液。

标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10mg/l系列标准溶液。

定容液：量取70ml甲醇和30ml水溶液，摇匀备用。

1.3.2样品处理与净化

称取试样5g(精确至0.01g)至50ml的离心管a中，加入15ml乙腈，超声10min,均质提取30s，提取液以4000r/min离心5min。上清液转移至吹氮管中。取一50ml离心管b,加入10ml乙腈以洗涤匀浆刀10s。洗涤液转入离心管a中，用玻棒捣碎下层残渣，超声10min,在涡旋振荡器上振荡2min，4000r/min离心5min，上清液合并至吹氮管中，50℃吹氮浓缩至干。残渣用1.0ml定容液溶解，涡旋振荡1min，超声5min。加入3ml正己烷涡旋振荡0.5min，3000r/min离心5min，弃去上层溶液，再用正己烷重复脱脂一次，下层溶液在12000r/min下离心5min，经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱仪测定。

1.3.3液相色谱测定条件

色谱柱：inertsilc8-3(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：a:甲醇+b:水溶液,梯度洗脱：0～10min,60％～70％a；10～12min,70～90％a；12～13min,90～60％a；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；进样量：40μl。

1.3.4液相色谱测定

按照1.3.3液相色谱测定条件对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。

1.3.5空白试验

除不加试样外，均按上述操作步骤进行。

1.3.6结果计算和表述

用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：。

式中：

xi——试样中被测组分含量，单位为微克每千克(mg/kg)；

c——由标准曲线得到的样液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

c0——由标准曲线得到的空白试验中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

v——样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；

m——最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)。

计算结果保留两位有效数字。

2结果与分析

2.1提取溶剂的选择

莫奈太尔几乎不溶于水，微溶于丙二醇和正辛醇，溶于乙醇，易溶于二氯甲烷和聚乙二醇，发明人发现，使用二氯甲烷提取出的脂肪、脂类物质最多，乙酸乙酯次之，但两者的提取效率稍差，干扰较多；使用乙腈的提取效率最高，同时，还具有沉淀蛋白的作用，能有效去除部分杂质。因此，本方法选择乙腈作为动物肌肉、肝脏和肾脏的提取溶剂。

2.2净化方法的选择

提取液的净化是样品前处理过程中关键的一步,直接关系到方法的定量限和回收率。净化的方式主要有液液分配和固相萃取(spe)两种方式。发明人发现，用乙腈饱和正己烷液液分配净化后可得到较理想、干扰少的色谱图，各药物的回收率为74.0％-101.1％；固相萃取净化方式中hlb和mcx虽然也能净化杂质，但对被测物质保留时间附近的杂质没有明显的净化作用，反而带入了其他的杂质干扰。因此，本发明采用乙腈饱和正己烷液液分配进行净化，同时保证了较高的回收。

2.3线性范围和定量限

在上述实验条件下，取一系列不同浓度的莫奈太尔和莫奈太尔砜标准溶液，以莫奈太尔和莫奈太尔砜响应峰面积与内标响应峰面积之比对莫奈太尔和莫奈太尔砜的浓度进行线性回归，结果表明，当莫奈太尔和莫奈太尔砜的浓度在0～10mg/l范围内，线性关系良好。莫奈太尔的回归方程、相关系数见图1。莫奈太尔砜的回归方程、相关系数见图2。

本实验选择空白的动物组织样品，当肌肉、肝脏和肾脏样品中添加水平为0.05、0.1和0.1mg/kg时，信噪比大于10，表明肌肉的定量限(loq)可达到0.05mg/kg，肝脏和肾脏的定量限(loq)可达到0.1mg/kg，空白样品及定量限色谱图见图3-图6。当样品中的莫奈太尔和莫奈太尔砜浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。其中，图3为牛肉空白的色谱图，图4为牛肉空白标准添加样品(添加水平0.05mg/kg)的色谱图，图5为羊肝空白的色谱图，图6为羊肝空白标准添加样品(添加水平0.1mg/kg)的色谱图。

图7为标准溶液的色谱图，其中峰1为莫奈太尔砜,保留时间7.0min；峰2为莫奈太尔，保留时间8.3min。

2.4方法的回收率和精密度

选用未含有莫奈太尔和莫奈太尔砜的牛肉和羊肝样品分别进行添加回收率和精密度实验，添加水平分别为0.05、0.1、0.5和0.1、0.2、1.0mg/kg，按1.3节方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率。回收率和精密度结果见以下表1。三个添加水平的平均回收率在83.2％～94.1％之间，相对标准偏差为3.5％～7.4％。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。

表1动物组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜的加标回收率与精密度(n＝6)

2.5实际样品的测定

按照本研究所建立的方法对目前市场销售的10份牛肉、10份羊肝和10份牛肾样品进行了测定，均没有检出。

由以上可见，本发明的方法操作简便，快速，灵敏，测定结果准确可靠，适用于动物肌肉、肝脏和肾脏组织中莫奈太尔和莫奈太尔砜的定性定量测定。