电泳沉积碳纳米管修饰碳纤维电极及其在活体抗坏血酸的检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种电泳沉积碳纳米管修饰碳纤维电极及其在活体抗坏血酸的检测中的应用。

背景技术：

抗坏血酸，又名维他命c，是脑内重要的神经化学分子，在脑内主要作为抗氧化剂和神经调质发挥功能作用，因此抗坏血酸浓度的变化及精准测定对于一系列生理病理过程的研究具有重要意义。在抗坏血酸的各类检测方法中，电化学方法由于其时空分辨率高、灵敏度高、选择性好等优势备受关注。利用电化学方法进行活体原位检测时多选用7μm左右的碳纤维电极作为探针，在实时原位检测的同时对于生物体的损伤较小，且具有一定的生物相容性。然而，由于活体检测环境复杂，脑内存在很多小分子电化学活性干扰物质，例如多巴胺、五羟色胺等，使得抗坏血酸的脑内的原位选择性检测受到极大的挑战。抗坏血酸是一种内壳层分子，在电极上的氧化行为十分依赖电极表面性质，早期主要通过对裸碳纤维电极进行表面处理，如电化学方法活化，来实现对脑内抗坏血酸的选择性检测。但是该方法处理的碳纤维电极在活体检测过程中，对抗坏血酸的检测灵敏度明显下降，并不能完全满足脑内抗坏血酸高灵敏度高选择性检测的需求。

碳纳米管是一种新型的碳材料，其对于抗坏血酸电化学氧化具有优异的催化性能，能够大大降低抗坏血酸在电极上氧化的过电位，因此，碳纳米管修饰的电极对于抗坏血酸的检测具有较高的灵敏度和特异的选择性。目前，碳纳米管修饰碳纤维电极常采用手工滴涂的方法，即将碳纳米管分散液少量滴涂在玻璃玻片表面，然后再手工反复滚动碳纤维电极尖端使碳纳米管吸附在碳纤维表面，从而获得碳纳米管修饰的碳纤维电极。但碳纳米管很难吸附在碳纤维表面，并且该方法对于操作精度要求较高，需要长时间反复操作才能将碳纳米管成功修饰到电极表面，很难得到碳纳米管厚度控制均匀的电极，导致滴涂修饰的方法无法简便快速地获得对抗坏血酸检测具有高选择性和重现性的电极。同时，碳纤维在修饰过程中极易被折断，造成了修饰碳纳米管的电极成品率很低。因此，急需一种新的修饰方法来提高碳纳米管在碳纤维电极上修饰的成功率。

技术实现要素：

针对现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种用于碳纳米管在碳纤维电极上修饰的新方法。

所述用于碳纳米管在碳纤维电极上修饰的新方法，包括下述步骤：采用电泳沉积的方法将单壁碳纳米管沉积在碳纤维电极上。

为了提高碳纳米管在水相中的分散性，所述碳纳米管在使用前需进行酸处理。

所述酸处理的具体方法如下：将单壁碳纳米管置于hno3和h2so4组成的混酸溶液中，并在20-50℃以400-600w的功率超声处理2-4h，然后用去离子水将酸处理后的碳纳米管洗涤至中性，烘干，并将其分散于去离子水中，得到单壁碳纳米管的水分散液，其中单壁碳纳米管的浓度为0.5-2mg/ml。

所述hno3的质量分数为65-70％；所述h2so4的质量分数为95-98％。所述混酸溶液中hno3和h2so4的体积比为1:3。

所述电泳沉积是通过两电极体系实现的。其中，电泳通过电化学工作站实现；在所述两电极体系中，阳极即工作电极，其电极端接碳纤维电极；将参比电极和对电极短接形成阴极，其电极端接pt丝。所述碳纤维电极与pt丝之间的距离保持为1-3mm。

所述电泳沉积的具体方法如下：将碳纤维电极和pt丝插入到碳纳米管分散液中，安培法施加电压1.9-2.5v进行电泳沉积，持续时间为10-100s，即可得到均匀沉积的碳纳米管修饰的碳纤维电极。

试验中采用其他近似电压和电泳时间也能将单壁碳纳米管电泳至电极表面，以能成功将单壁碳纳米管电泳到电极上并形成一层修饰层为准。

本发明所使用的碳纤维微电极可按照现有的方法制备得到，具体方法如下：

将碳纤维用导电胶黏附于导电金属丝上，并穿入已拉制好的两端开口的玻璃毛细管中，玻璃管前端露出一定长度的碳纤维。然后将玻璃管前后两端用绝缘胶封住，然后浸入溶液中进行超声清洗，即得。

所述的导电金属丝具体可为铜丝或铁丝。

所述超声清洗依次在丙酮、乙醇、1.0～3.0mhno3溶液、1.0～2.0mkoh溶液和二次水中进行。

更进一步的，上述方法还包括对制备得到的碳纳米管修饰的碳纤维电极进行后处理的步骤。

所述后处理包括下述步骤：

1)高温处理：在惰性气氛下，将碳纳米管修饰的碳纤维电极在300-500℃下处理0.5-2h；

所述高温处理具体可在管式炉内进行；

2)电化学处理

将高温处理后的碳纳米管修饰的碳纤维电极进入0.5m的硫酸中，首先在2v电压下安培法处理30-50s，然后在-1v电压下安培法处理10-20s，最后以0.1-0.5v/s的扫描速度在0-1v电压范围内进行循环伏安处理10-20圈；其中，所述安倍法处理和循环伏安处理均在三电极体系中进行，工作电极为所述高温处理后的碳纳米管修饰的碳纤维电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

经上述方法处理后的电极即对抗坏血酸表现出高选择性和高灵敏度的响应。

上述方法制备得到的碳纳米管修饰的碳纤维电极也属于本发明的保护范围。

本发明还保护该碳纳米管修饰的碳纤维电极的应用。

所述应用是该碳纳米管修饰的碳纤维电极在体外和/或活体实时监测抗坏血酸中的应用，尤其是在活体脑内原位测定抗坏血酸浓度变化中的应用。

本发明所述的碳纳米管修饰的碳纤维电极在制备体外和/或活体实时监测抗坏血酸产品中的应用，同样属于本发明的保护范围。

在进行活体分析前，将碳纤维电极进行高温和电化学简单处理，即可使电极对抗坏血酸具有很高的选择性和灵敏度，可用于活体脑内原位测定抗坏血酸的浓度变化。进一步，我们发现该方法对于不同来源的单壁碳纳米管均具有相同的效果，说明该方法具有很好的普适性。因此，该方法避免了手工修饰过程中电极重现性低和对操作精度要求高且耗时的缺点，大大降低了活体抗坏血酸检测的复杂程度。

综上所述，根据本发明实施例的电极修饰方法，具有以下优点的至少之一：

1)通过简单可控的电泳沉积方法，将碳纳米管电泳沉积到碳纤维电极上，相对于手工操作，该方法重现性高，得到的修饰层厚度均匀可控，整个过程简单省时；

2)通过将不同来源的碳纳米管电泳修饰的电极对抗坏血酸的响应进行比较，得出该方法不依赖于碳纳米管的来源，具有很好的普适性；

3)电泳沉积的碳纳米管与电极吸附较为紧密，在整个活体实验过程中不易脱落，因此提高了电极检测的稳定性。

附图说明

图1为本发明提供的单壁碳纳米管修饰的碳纤维电极制备方法的流程示意图；

图2为实施例1中获得的电泳沉积单壁碳纳米管修饰的碳纤维的扫描电镜图；

图3为实施例1中电泳沉积不同来源的单壁碳纳米管获得的电极对抗坏血酸循环伏安扫描图；

图4为实施例1中获得的电极对抗坏血酸选择性电流图；

图5为实施例1中获得的十个不同的电极对抗坏血酸重现性的循环伏安扫描图；

图6为实施例1中获得的电极在脑内稳定性实验的光学显微镜图；

图7为实施例1中获得的电极在脑内电流稳定性图；

图8为实施例1中获得活体检测后对抗坏血酸的浓度梯度电流图；

图9为实施例1中获得活体检测后对抗坏血酸的浓度校正图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的抗坏血酸(aa)购于sigma-aldrich公司，三种不同来源的单壁碳纳米管(swnts)分别购于深圳纳米港公司，北京德科岛津公司，和美国buckyusa公司。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。

实施例1

碳纤维电极的制备：碳纤维电极采用现有方法进行制备，具体如下：首先将玻璃毛细管(外径:1.5mm；内径:0.89mm；长度:10cm)在微电极拉制仪(wd-1型，成都仪器厂)上拉制成两个尖端很细的锥形毛细管，在光学显微镜下，使用手术刀将玻璃尖端切断，保留的端口内径约为30-50μm。随后通过导电银胶将约2cm长的碳纤维粘在一根约10cm的铜丝上，并将其穿入拉好的毛细管中，使碳纤维在毛细管的尖端外暴露出约3mm的长度。再使用环氧树脂(乙二胺作为固化剂)封住尖端的空隙，防止测试溶液进入毛细管内。毛细管和碳纤维上多余的环氧树脂用丙酮除去，放置过夜，使环氧树脂固化。用绝缘胶将毛细管的另外一端封住，使铜丝和毛细管固定在一起。然后在光学显微镜下，用手术刀将碳纤维突出毛细管部分截为0.5mm左右，即制成碳纤维微电极(cfe)。制备好的cfe依次在丙酮、3.0mol/l的hno3和1.0mol/l的koh溶液中超声2min。即可制备好用于电泳沉积的碳纤维电极(cfe)。

电泳沉积碳纳米管修饰的碳纤维电极的制备：

参考图1，该方法包括：

s100：制备酸处理的单壁碳纳米管分散液

在该步骤中，用于实验的swnts需要提前进行酸预处理才能进行用于电泳沉积，主要是由于工业生产的swnts长度较长，因此在水相中分散性很差，影响电泳沉积效果。常用的方法是将swnts在混酸溶液中进行预处理，将swnts分散在hno3(质量分数为65％)和h2so4(质量分数为98％)(1:3，体积比)的混酸溶液中超声处理3h，将swnts进行切割，即可得到长度较小(0.5-2μm)的利于分散的碳纳米管。采用去离子水多次洗涤至中性后烘干，该方法处理的swnts即可均匀分散在水溶液中。所述的swnts分散液浓度一般为2mg/ml。

需要说明的是，本发明所提出的电泳沉积swnts方法，其具体酸处理技术不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体类型进行选择。

s200：进行电泳沉积

在该步骤中，对cfe进行电泳沉积修饰swnts。具体的，将cfe和pt丝电极插入到均相的2mg/ml的swnts分散液中进行电泳沉积，且使二者距离为1.5mm，采用恒电位安培法对cfe施加阳极电压为2.5v,pt丝电极作为阴极进行电泳，持续时间为30s，即可得到均匀沉积的swnts修饰的cfe。参考图2，扫描电镜图显示经过30s电泳沉积后，cfe表面均匀沉积swnts修饰层。三种不同来源swnts均能电泳沉积至电极表面形成修饰层。试验中采用其他近似电压和电泳时间也能将swnts电泳至电极表面，以能成功将swnts电泳到电极上并形成一层修饰层为准。根据本发明的实施例，所述进行电泳沉积通过两电极体系实现的。其中，所述两电极体系中，阳极为所述cfe工作电极，阴极为pt丝，可将电化学工作站的对电极和参比电极短接形成。

s300：对电泳沉积的碳管电极后处理

对步骤2中的电极进行下一步处理。据本发明的实施例，在该步骤中，通过高温对swnts修饰的cfe进行处理是在氩气的保护下，采用管式炉程序升温至300℃，对电泳的swnts修饰的cfe维持高温处理2h，随后进行程序降温即可。根据本发明的实施例，对高温处理后的电极电化学处理在0.5m的硫酸中进行，具体步骤是首先在2v电压下安培法处理30s，然后-1v电压下安培法处理10s，最后0-1v电压下进行循环伏安处理10圈，扫描速度0.1v/s.电极即对抗坏血酸具有高选择性和灵敏度的响应。参考图3，aa循环伏安曲线显示经过处理之后，电泳沉积三种不同来源的swnts修饰的cfe对aa均具有很好的响应。其中，所述电化学循环伏安过程在三电极体系中，所述电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

为了证实上述方法获得的电极对aa具有很好的选择性，我们对比检测了脑内常见的电化学干扰物质在电极上的响应。参考图4，对工作电极施加0.05v的电压，待背景电流稳定后，向电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为nacl(126mm),kcl(2.4mm),kh2po4(0.5mm),mgcl2(0.85mm),nahco3(27.5mm),na2so4(0.5mm),cacl2(1.1mm)，用于模拟脑脊液环境)中依次加入20μmol/l的多巴胺(da)溶液、20μmol/l的肾上腺素(e)溶液、20μmol/l的去甲肾上腺素(ne)溶液、50μmol/l的尿酸(ua)溶液、50μmol/l的五羟色胺(5-ht)溶液、50μmol/l二羟基苯乙酸(dopac)溶液，均没有产生明显的电流响应，当加入脑内基础浓度200μmol/l的aa后，电流显著升高，说明电极对aa具有优异的选择性。其中，所述电化学安培法测定电流过程是在三电极体系中，所述电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

为了证实上述方法获得的电极对aa具有很好的重现性，我们随机检测了十个采用电泳方法制备的swnts修饰的cfe对aa的响应。参考图5，十个不同电极的aa循环伏安曲线显示采用电泳方法制备的电极对200μmol/l的aa具有很好的响应，且起峰电位和达到极限电流的电位均非常接近。因此采用该方法制备的电极具有非常好的重现性，避免了手工修饰操作难度高，电极重性差等缺点。其中，所述电化学循环伏安过程是在三电极体系中，所述电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

为了证实上述方法获得的电极在活体检测的稳定性，我们首先检测了电极在活体试验前后swnts在电极上的稳定性，验证电泳修饰的swnts是否会在活体实验过程中脱落，导致电极对aa响应不稳定。参考图6，我们首先获取了电泳沉积的swnts电极植入鼠脑前的光学显微照片，然后将电极植入到大鼠纹状体中两个小时后取出，对植入活体后取出的电极再次观察，可以看到活体前后电极的外形基本保持一致，说明swnts紧密的吸附在cfe表面。同时我们采用恒电位法测定了电极在鼠脑内一个小时的电流稳定性响应，参考图7，对工作电极施加0.05v的电压，电极在鼠脑内电流响应基本保持不变，说明该电极在活体实验过程中保持很好的稳定性。其中，所述电化学安培法测定电流过程是在三电极体系中，所述电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，对电极为pt电极。

为了证实上述方法获得的电极在活体检测后对aa浓度依然存在线性关系，该电极按照活体后校正曲线的步骤，绘制活体后的aa的浓度校正曲线。首先将swnts修饰的cfe植入鼠脑纹状体中进行实验，两个小时后取出。然后制备50mmol/l的抗坏血酸(aa)溶液，取10ml的acsf溶液于烧杯中作为电解液，然后将电极置于烧杯中并以pt为对电极，ag/agcl为参比电极构成三电极体系。然后对工作电极施加0.05v的电压，待背景电流稳定后，向电解液中每隔100s加入10μl的aa溶液共5次，调节电解液中aa的浓度按照50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l以及250μmol/l的梯度变化，同时实时检测上述过程中的电极电流。参考图8，活体后获得的电极电流能够随aa浓度上升呈梯度增长。说明进行活体检测后的电极在对aa依然存在良好的电流响应。参考图9，根据浓度和对应的电流响应绘制的活体后校正曲线说明该电极对aa的浓度具有良好的线性响应关系，因此可以通过后校准准确得到脑内aa的浓度变化。

从上述实施例可以看出，本发明采用电泳沉积碳纳米管的方法修饰的碳纤维电极对脑内抗坏血酸的测定具有良好的重现性和稳定性。该方法避免了手工修饰电极对操作精度要求高，电极重现性低等缺点，从而本发明有望发展成为一种简单便捷的碳纳米管修饰方法应用于活体内抗坏血酸的定量分析。对于研究脑内抗坏血酸变化及其相关的生理、病理过程具有重要意义。