本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于过氧化氢浓度检测的三氧化二铁纳米片及检测方法。
背景技术：
随着人们生活水平的日益提高，医疗健康问题也受到人们的普遍关注。尤其是近年来糖尿病等慢性疾病的发病率逐年上升，严重危害着人类的健康。对人体环境中的生物活性分子进行准确、连续的检测成为亟待解决的问题，这就为生物监测方法的应用提供了广阔的空间。过氧化氢是许多生理体系中蛋白酶反应的中间产物，对其进行准确检测是提升蛋白酶检测技术性能的关键。过氧化氢的检测是一类重要的生物医学检测技术，在生物医学领域有着重要的意义，过氧化氢浓度的准确测量一直是生物检测领域的重大难题。色谱法、光谱法和化学滴定法可以准确检测过氧化氢的浓度，但是手段复杂，人工操作繁杂，化学污染严重，检测速度较慢。电化学传感器的检测灵敏度很高，但是易受干扰，而且检测过程需要消耗一定的能量。近年来，比色检测技术发展迅速，它利用反应体系颜色及色度的变化实现对目标物的检测，成为生物检测领域研究的热点。由于可以用肉眼直接观测比色检测的结果，因此比色检测方法具有结果直观、操作简单等特点。一些贵金属粒子、多孔聚合物、无机多孔材料、金属氧化物等材料被用于比色检测过氧化氢。虽然这些材料可以实现比色检测过氧化氢，但是缺点同样明显。贵金属纳米材料成本高，难以推广；多孔材料活性中心数量较少，反应活性低；金属氧化物检测时间较长。因此，需要寻找新材料、新结构克服上述材料的缺点，推动过氧化氢比色检测的市场化发展。开发氧化铁基模拟酶材料可以提升过氧化氢比色检测的性能，成为生物检测领域研究的重要方向之一，发展非常迅速。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于过氧化氢浓度检测的三氧化二铁纳米片及检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于过氧化氢浓度检测的三氧化二铁纳米片，其特征在于，通过以下步骤制备得到：
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1mg/ml～5mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为0.01mm～10mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分；将上述混合溶液室温静止12小时，然后进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；
(4)将上述复合材料置于马弗炉中，在500～600℃煅烧2～3小时，从而制得三氧化二铁纳米片。
一种过氧化氢浓度检测方法，该方法基于权利要求1所述的三氧化二铁纳米片实现，包括以下步骤：
(1)将三氧化二铁纳米片分散到水中，得到浓度为1～10mg/ml的三氧化二铁纳米片分散液。
(2)将10μl～100μl三氧化二铁纳米片分散液加入到500μl～900μl、ph＝3.5～4.5的naac-hac缓冲溶液中；然后加入100μl～300μl、浓度为1mm～5mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入3.25μl～65μl浓度为0.01m的过氧化氢水溶液，在35℃～45℃培养15分钟～60分钟，得到过氧化氢终浓度为1μm～20μm的过氧化氢溶液；
(3)测定步骤(2)得到的已知过氧化氢浓度的溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线；
(4)按照步骤(2)中的方法，通过测定未知过氧化氢浓度溶液的吸光光度值，即可计算得到溶液中过氧化氢的浓度。
本发明的优点是：
1)采用自组装结合模板法制备三氧化二铁纳米片，方法简单，易于操作，成本低廉。
2)采用石墨烯氧化物作为模板，制备的三氧化二铁纳米材料由纳米尺度的粒子构成，以氧化石墨烯为模板，可以调控纳米粒子的尺寸以及纳米粒子组装的间距等参数；同时，石墨烯氧化物的存在又可以很好地阻止纳米粒子间的团聚，获得二维纳米片。
附图说明
图1是制备的三氧化二铁纳米片的x射线衍射图谱。
图2是不同溶液的紫外-可见吸收光谱(曲线1：tmb；曲线2：tmb+h2o2；曲线3：tmb+h2o2+fe2o3；曲线4：tmb+fe2o3；fe2o3)。
图3是三氧化二铁纳米片对低浓度过氧化氢的紫外-可见吸收吸光度值与过氧化氢浓度的关系曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为10mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.404；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在500℃煅烧2小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为1mg/ml。
(5)将10μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到500μl、ph＝3.5的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入100μl、浓度为1mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入6.1μl、12.6μl、30.5μl、91.5μl、122μl、浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在35℃培养15分钟，得到过氧化氢浓度为1μm、2μm、5μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线；
(8)按照步骤(5)中的方法，配制未知过氧化氢浓度的溶液，同时测定该溶液的吸光光度值；将该吸光光度值代入步骤(6)得到的浓度-吸光光度值标准曲线，从而计算未知溶液中过氧化氢的浓度。
实施例1制备的三氧化二铁纳米材料的x射线衍射图谱见图1。可以看出，材料给出了6个明显的衍射峰，它们归属于三氧化二铁的特征衍射峰，证明成功地制备了三氧化二铁材料。
实施例1制备的三氧化二铁模拟酶材料与酶反应底物在不同水溶液中的紫外-可见吸收光谱见图2。可以看出，三氧化二铁纳米材料在反应底物tmb和过氧化氢共存的条件下，溶液在651nm处具有很强的吸收，说明三氧化二铁可以催化过氧化氢分解，进而氧化tmb分子，进一步证明三氧化二铁具有模拟酶的活性。
实施例1制备的三氧化二铁纳米片对低浓度过氧化氢的紫外-可见吸收光度值与过氧化氢浓度的关系曲线见图3。可以看出，在1μm～20μm的低浓度范围内，溶液的紫外-吸收可见光谱的吸光度值与过氧化氢的浓度成线性，且方差小于0.05％，表明制备的三氧化二铁纳米片在比色检测过氧化氢应用中可以实现定量检测。
实施例2
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为5mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.0404；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在500℃煅烧2.5小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为1.5mg/ml。
(5)将25μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到600μl、ph＝3.5的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入100μl、浓度为2mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入7.25μl、14.5μl、36.25μl、108.75μl、145μl浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在35℃培养15分钟，得到过氧化氢浓度为1μm、2μm、5μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线，该标准曲线呈线性，且方差小于0.05％。
实施例3
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为1mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为1mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.00404；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在500℃煅烧3小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为2mg/ml。
(5)将50μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到700μl、ph＝4.0的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入200μl、浓度为3mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在40℃培养30分钟，得到过氧化氢溶液为1μm、3μm、5μm、7μm、9μm、11μm、13μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线，该标准曲线呈线性，且方差小于0.05％。
实施例4
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为2mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为0.5mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.00101；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在600℃煅烧2小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为2.5mg/ml。
(5)将50μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到800μl、ph＝4.0的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入200μl、浓度为4mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入10.5μl、21μl、52.5μl、63μl、210μl浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在40℃培养30分钟，得到过氧化氢浓度为1μm、2μm、5μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线，该标准曲线呈线性，且方差小于0.05％。
实施例5
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为3mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为0.1mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.000135；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在600℃煅烧2.5小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为5mg/ml。
(5)将75μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到800μl、ph＝4.0的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入200μl、浓度为4mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入10.75μl、21μl、53.75μl、161.25μl、210μl浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在40℃培养30分钟，得到过氧化氢浓度为1μm、2μm、5μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线，该标准曲线呈线性，且方差小于0.05％。
实施例6
(1)配制氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度为5mg/ml。
(2)配制硝酸铁水溶液，硝酸铁水溶液的浓度为0.01mm。
(3)将步骤(2)中的硝酸铁水溶液加入到步骤(1)的氧化石墨烯水溶液中，硝酸铁水溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1:1；超声分散使其混合充分，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合溶液，氧化石墨烯与硝酸铁的重量比为1：0.000808；将上述混合溶液室温静止12小时，制得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述溶液进行离心分离、水洗、烘干，获得氧化石墨烯/硝酸铁复合材料；将上述复合材料置于马弗炉中，在600℃煅烧3小时，从而制得三氧化二铁纳米材料。
(4)将步骤(3)制备的三氧化二铁纳米片分散到水中，复合材料水溶液的浓度为10mg/ml。
(5)将100μl步骤(4)制备的三氧化二铁纳米片分散液加入到900μl、ph＝4.5的naac-hac缓冲溶液中；然后向该反应体系中加入300μl、浓度为5mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)乙醇溶液作为比色反应底物；再加入13μl、26μl、65μl、195μl、260μl浓度为0.1mm的过氧化氢溶液，在45℃培养60分钟，得到过氧化氢浓度为1μm、2μm、5μm、15μm、20μm的过氧化氢溶液；
(6)测定步骤(5)得到的已知过氧化氢浓度溶液在紫外-可见光区域的吸光光度值，得到该浓度下溶液的吸光光度值；
(7)根据步骤(5)中过氧化氢的浓度和步骤(6)中得到的该浓度下溶液的吸光光度值，建立浓度-吸光光度值的标准曲线，该标准曲线呈线性，且方差小于0.05％。