本发明涉及质量控制技术领域，尤其涉及伤科黄水制剂的质量控制方法。
背景技术：
伤科黄水是申请人开发的产品，于2000年获得相关专利(专利公告号：96123078.9)，但是因其是临床验方，一直以来有关该品种质量评价的研究工作并未深入开展，导致制剂生产工艺相对粗放，质量标准较低，临床疗效难以控制。尤其值得注意的是，该制剂复方组成复杂，物质基础不明，在质量标准方面目前仍以外观感官判断和定性鉴别(薄层色谱)为主，尚缺乏特征明确的指标性成分，质量评价体系亟待完善。
我们结合伤科黄水的药理作用与理化性质等，利用液相色谱、质谱等技术对伤科黄水的主要组成成分及含量进行了研究。通过液相色谱串联傅里叶变换质谱(LC-FTICR-MS)技术，我们分析了伤科黄水主要成分的一级质谱和二级质谱，根据一级母离子分子量(极高分辨率为0.0001Da)，以及相应的二级碎裂数据与对照品、数据库或文献对比，对该制剂进行了定性检测。结果共发现并确证了复方中20种成分，还有大量物质母离子分子量能够匹配，但是由于色谱图不够理想，未收录进结果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出采用LC-MS和HPLC技术，建立了小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱、黄连碱、黄柏碱、绿原酸和栀子苷成分的含量测定方法，并进行了方法学考察。经过反复比较，发现LC-MS可以同时测定伤科黄水中的小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱、黄连碱、黄柏碱、绿原酸、栀子苷等共8种成分含量，结果稳定可靠，可以作为伤科黄水的质控指标
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
伤科黄水制剂的质量控制方法，伤科黄水制剂的成份包括：黄连、黄柏、栀子、紫草、薄荷和白矾；所述质量控制方法包括以下步骤：
(1)称取盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、栀子苷和绿原酸，加无水甲醇或甲醇水溶液，制成对照品溶液；
(2)取待测定的伤科黄水制剂的内容物，加入无水甲醇或甲醇水溶液溶解，过滤并取续滤液作为供试品溶液；
(3)分别取所述对照品溶液与所述供试品溶液1～5μL，注入液相色谱-质谱的联用仪器进行检测，分别获得对所述对照品溶液和所述供试品溶液中黄柏碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、栀子苷和绿原酸共8种成份的定量色谱图；所述对照品溶液与所述供试品溶液在相同的位置上出峰；并通过计算得出包括黄柏碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、栀子苷和绿原酸的含量。
更进一步说明，质谱的条件中，黄柏碱质荷比为342.3→192.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
药根碱的质荷比为339.3→323.2或339.3→295.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
表小檗碱的质荷比为336.1→320.2或336.1→292.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
黄连碱的质荷比为320.2→292.0，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
巴马汀的质荷比为352.→336.1或352.→308.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
小檗碱的质荷比为336.1→320.1或336.1→292.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
栀子苷的质荷比为411.2→217.4，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
绿原酸的质荷比为355.2→163.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50。
更进一步说明，液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相A包括甲酸水溶液；流动相B包括甲醇；
利用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱：
0～15min，所述流动相A:70％，所述流动相B:30％；
15～20min，所述流动相A:60～70％，所述流动相B:30～40％；
20min以后，所述流动相A:60～85％，所述流动相B:15～40％；
所述甲酸水溶液体积百分比浓度为：0.1～0.4％；液相色谱的流动相流速条件为：0.1～1.0mL/min，液相色谱柱温的条件为：25～35℃。
更进一步说明，质谱中的电喷雾离子源(ESI)温度条件为300～380℃；质谱中雾化气N2流速条件为7.0～11.0L/min。
更进一步说明，所述对照品溶液中盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、栀子苷、绿原酸浓度均为100μg/mL。
更进一步说明，所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为：75％～100％。
更进一步说明，其特征在于，还包括黄连的薄层鉴别方法；黄连的薄层鉴别方法包括以下步骤：
(1)取伤科黄水10mL，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，作为薄层色谱鉴别供试品；
(2)取黄连的对照药材并添加水；加热回流；冷却并过滤；滤液中加正丁醇稀释溶解，作为黄连对照样品；
(3)按伤科黄水制剂的配比称取黄柏、栀子、紫草、薄荷和白矾，加热提取1.5小时后过滤；浓缩，定容,即得药液；取10ml药液，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇溶液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，制备成黄连阴性对照样品；
(4)照薄层色谱法试验，吸取步骤(1)薄层色谱鉴别供试品、步骤(2)所述黄连对照样品和步骤(3)所述黄连阴性对照样品各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，待薄层色谱鉴别供试品、黄连对照样品和黄连阴性对照样品在硅胶G薄层板展开，展距10cm取出，晾干；
(5)将步骤(4)的硅胶G薄层板置于365nm的紫外光灯下检视；
在硅胶G薄层板上,薄层色谱鉴别供试品，分别对比在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；黄连阴性对照样品色谱中，在黄连对照样品的色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层色谱鉴别供试品中含有黄连成分。
更进一步说明，所述甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液的比例关系为6:3:1.5:1.5:0.6。
更进一步说明，还包括栀子及栀子苷的薄层鉴别方法；栀子及栀子苷的薄层鉴别方法包括以下步骤：
(1)取伤科黄水10mL，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，作为薄层色谱鉴别供试品；
(2)取栀子的对照药材加水；加热回流；冷却并滤过；在滤液中添加正丁醇稀释溶解，作为栀子对照药材溶液；
(3)取栀子苷的对照品，加乙醇溶解，作为栀子苷对照品溶液；
(4)按伤科黄水制剂的配比取黄连、黄柏、紫草、薄荷和白矾，加热提取1.5小时后过滤；浓缩，定容,即得药液；取10ml药液，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇溶液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，制得不含栀子的栀子阴性对照样品；
(5)照薄层色谱法试验，吸取上述薄层色谱鉴别供试品、栀子对照药材溶液、栀子苷对照品溶液和栀子阴性对照样品各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-水的上层溶液为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，待上述薄层色谱鉴别供试品、栀子对照药材溶液、栀子苷对照品溶液和栀子阴性对照样品在硅胶G薄层板上展开，展距约10cm，取出，晾干；
(6)将步骤(5)的硅胶G薄层板喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰；
其中，在硅胶G薄层板上,薄层色谱鉴别供试品，分别对比在与栀子对照药材溶液及栀子苷对照品溶液的位置，显相同颜色的斑点；而栀子阴性对照样品色谱中，在栀子对照药材溶液及栀子苷对照品溶液的色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层色谱鉴别供试品中含有栀子成分。
更进一步说明，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的比例关系为1:2:1。
本发明的有益效果：
1、本发明使原本欠缺的定量评价指标，能够用一次定量测定来完成；
2、本发明中对照品溶液与供试品溶液的色谱图中在相同的位置上出峰；分别检测和计算所得8种成分的定量色谱图，表明该波峰分离良好，因而方法鉴别、快捷、准确、重现，易于普及掌握，有效提高了检测效率
附图说明
图1是本发明的黄连的薄层鉴别方法的色谱图；
其中，1～3为薄层色谱鉴别供试品；4为黄连对照品溶液；5为黄连阴性对照样品；
图2是本发明栀子及栀子苷的薄层鉴别方法的色谱图；
其中1～3为薄层色谱鉴别供试品；4为栀子对照药材溶液；5为栀子苷对照品溶液；6为栀子阴性对照样品；
图3a测试黄柏碱的色谱图；
图3b测试药根碱的色谱图；
图3c测试表小檗碱和小檗碱的色谱图；
图3d测试黄连碱的色谱图；
图3e测试巴马汀的色谱图；
图3f测试栀子苷的色谱图；
图3g测试绿原酸的色谱图；
其中，3a～3g中，A阴性对照；B对照品溶液；C供试品溶液。
J溶剂前沿。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
伤科黄水制剂的质量控制方法，伤科黄水制剂的成份包括：黄连、黄柏、栀子、紫草、薄荷和白矾；所述质量控制方法包括以下步骤：
(1)称取盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、栀子苷和绿原酸，加无水甲醇或甲醇水溶液，制成对照品溶液；
(2)取待测定的伤科黄水制剂的内容物，加入无水甲醇或甲醇水溶液溶解，过滤并取续滤液作为供试品溶液；
(3)分别取所述对照品溶液与所述供试品溶液1～5μL，注入液相色谱-质谱的联用仪器进行检测，分别获得对所述对照品溶液和所述供试品溶液中黄柏碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、栀子苷和绿原酸共8种成份的定量色谱图；所述对照品溶液与所述供试品溶液在相同的位置上出峰；并通过计算得出包括黄柏碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、栀子苷和绿原酸的含量。
更进一步说明，如图该方法通过液质联用技术(LC-MS)同时测定所述对照品溶液与所述供试品溶液中小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱、黄连碱、黄柏碱、绿原酸和栀子苷共8种成分含量，使原本欠缺的定量评价指标，能够用一次定量测定来完成；该方法的实验结果为：所述对照品溶液与所述供试品溶液的色谱图中在相同的位置上出峰，检测和计算所得8种成分的定量色谱图，表明该波峰分离良好，因而方法鉴别、快捷、准确、重现，易于普及掌握，有效提高了检测效率。
更进一步说明，质谱的条件中，黄柏碱质荷比为342.3→192.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
药根碱的质荷比为339.3→323.2或339.3→295.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
表小檗碱的质荷比为336.1→320.2或336.1→292.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
黄连碱的质荷比为320.2→292.0，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
巴马汀的质荷比为352.→336.1或352.→308.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
小檗碱的质荷比为336.1→320.1或336.1→292.1，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
栀子苷的质荷比为411.2→217.4，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50；
绿原酸的质荷比为355.2→163.2，其中去簇电压80～120，碰撞能30～50。
更进一步说明，其中“→”为质谱中待测物的质荷比的值变化符号。
上述参数可以影响分子离子的丰度，因为在离子传输的过程中，随着温度的下降，离子化好的离子可能再次聚集在一次，这样我们就会检测不到，从而减低灵敏度；其中，去簇电压不能过大，过大可能导致源内裂解，同样会减低分子离子峰的丰度。
更进一步说明，液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相A包括甲酸水溶液；流动相B包括甲醇；
利用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱：
0～15min，所述流动相A:70％，所述流动相B:30％；
15～20min，所述流动相A:60～70％，所述流动相B:30～40％；
20min以后，所述流动相A:60～85％，所述流动相B:15～40％；
所述甲酸水溶液体积百分比浓度为：0.1～0.4％；液相色谱的流动相流速条件为：0.1～1.0mL/min，液相色谱柱温的条件为：25～35℃。
更进一步说明，进行梯度洗脱有利于提高液相色谱的分离度和检测灵敏度。
更进一步说明，质谱中的电喷雾离子源(ESI)温度条件为300～380℃；质谱中雾化气N2流速条件为7.0～11.0L/min。
更进一步说明，所述对照品溶液中盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、栀子苷、绿原酸浓度均为100μg/mL。
更进一步说明，所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为：75％～100％。
更进一步说明，其特征在于，还包括黄连的薄层鉴别方法；黄连的薄层鉴别方法包括以下步骤：
(1)取伤科黄水10mL，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，作为薄层色谱鉴别供试品；
(2)取黄连的对照药材并添加水；加热回流；冷却并过滤；滤液中加正丁醇稀释溶解，作为黄连对照样品；
(3)按伤科黄水制剂的配比称取黄柏、栀子、紫草、薄荷和白矾，加热提取1.5小时后过滤；浓缩，定容,即得药液；取10ml药液，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇溶液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，制备成黄连阴性对照样品；
(4)照薄层色谱法试验，吸取步骤(1)薄层色谱鉴别供试品、步骤(2)所述黄连对照样品和步骤(3)所述黄连阴性对照样品各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，待薄层色谱鉴别供试品、黄连对照样品和黄连阴性对照样品在硅胶G薄层板展开，展距10cm取出，晾干；
(5)将步骤(4)的硅胶G薄层板置于365nm的紫外光灯下检视；
在硅胶G薄层板上,薄层色谱鉴别供试品，分别对比在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；黄连阴性对照样品色谱中，在黄连对照样品的色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层色谱鉴别供试品中含有黄连成分，如图1。
更进一步说明，步骤(1)中进行了加正丁醇振摇并提取2次的操作；因为伤科黄水制剂为不纯的混合药物，加入正丁醇并提取2次有利于将伤科黄水制的杂质溶于正丁醇并分离。
更进一步说明，所述甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液的比例关系为6:3:1.5:1.5:0.6。
更进一步说明，还包括栀子及栀子苷的薄层鉴别方法；栀子及栀子苷的薄层鉴别方法包括以下步骤：
(1)取伤科黄水10mL，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，作为薄层色谱鉴别供试品；
(2)取栀子的对照药材加水；加热回流；冷却并滤过；在滤液中添加正丁醇稀释溶解，作为栀子对照药材溶液；
(3)取栀子苷的对照品，加乙醇溶解，作为栀子苷对照品溶液；
(4)按伤科黄水制剂的配比取黄连、黄柏、紫草、薄荷和白矾，加热提取1.5小时后过滤；浓缩，定容,即得药液；取10ml药液，加正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇溶液，置水浴上蒸干；在残渣添加乙醇10mL并使其溶解，制得不含栀子的栀子阴性对照样品；
(5)照薄层色谱法试验，吸取上述薄层色谱鉴别供试品、栀子对照药材溶液、栀子苷对照品溶液和栀子阴性对照样品各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-水的上层溶液为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，待上述薄层色谱鉴别供试品、栀子对照药材溶液、栀子苷对照品溶液和栀子阴性对照样品在硅胶G薄层板上展开，展距约10cm，取出，晾干；
(6)将步骤(5)的硅胶G薄层板喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰；
其中，在硅胶G薄层板上,薄层色谱鉴别供试品，分别对比在与栀子对照药材溶液及栀子苷对照品溶液的位置，显相同颜色的斑点；而栀子阴性对照样品色谱中，在栀子对照药材溶液及栀子苷对照品溶液的色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层色谱鉴别供试品中含有栀子成分，如图2。
更进一步说明，所述乙酸乙酯-正丁醇-水的比例关系为1:2:1。
实施例1：
试样制备
(1)：称取盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、栀子苷和绿原酸，加无水甲醇或甲醇水溶液，制成对照品溶液。
(2)：取伤科黄水制剂内容物，加入无水甲醇或甲醇水溶液溶解，过滤并取续滤液作为供试品溶液。
试验验证
(1)专属性试验
取同一浓度(相当于100％浓度水平)的步骤(2)供试品溶液1份、步骤(1)对照品溶液1份和阴性对照溶液1份进行测定。记录色谱图，说明方法的专属性。结果如图3a～3g所示，在同一检测条件下，阴性对照无明显干扰，专属性强。对照品与供试品在同一出峰时间分别出现了黄柏碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、栀子苷、绿原酸等共8种成分的色谱峰，出峰时间合适，峰形对称，分离度高。
(2)线性关系考察
取所述对照品溶液，经精密稀释制备成1、10、50、100、200、500、1000ng/mL的系列对照品工作溶液。以对照品浓度为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归。实验结果如表1所示，各生物碱浓度在1～1000ng/mL线性关系良好，R2(可决系数)均大于0.999，可以用于样品中黄柏碱等8种有效成分的含量测定。
表1 黄柏碱等8种成分的标准曲线表
(3)准确度试验
取同一浓度(相当于100％浓度水平)的所述供试品溶液，用至少测定6份样品的结果进行评价，所述对照品溶液的加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右。制备供试品溶液，记录各待测成分的峰面积值。实验结果如表2所示，6份供试品各成分的加样回收率均在95～115％之间，RSD％均小于5％，说明样品处理过程影响较小，测定准确度较高。
表2 准确度试验结果
(4)精密度试验
a重复性:
在相同条件下，由同一个分析人员取同一份均匀供试品(相当于100％浓度水平)，用至少测定6份的结果进行评价，对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右。制备供试品溶液，记录各待测成分的峰面积值。实验结果如表3所示，同一供试品各成分连续测定6次的加样回收率均在95～115％之间，RSD％均小于5％，说明本研究的样品处理方法和建立的仪器参数重复性良好。
表3 重复性试验结果
b中间精密度:
在同一个实验室，两个不同的分析人员，各按照前述“重复性”实验操作，用同一台仪器进行含量测定。实验结果如表4所示，不同操作人员对同一供试品各成分连续测定6次的加样回收率均在95～115％之间，RSD％均小于5％，说明本研究的样品处理方法和建立的仪器参数中间精密度较高。
表4 中间精密度试验结果
(5)耐用性考察:
a稳定性试验:
同一份供试品溶液(相当于100％浓度水平)，同一个分析人员，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样，记录各待测成分的峰面积值。实验结果如表5所示，供试品中8种成分在24h内性质稳定，RSD％均小于5％，说明在24h内可用本研究建立的LC-MS分析方法进行测量。
表5 稳定性试验结果
b色谱柱的影响
取同一浓度(相当于100％浓度水平)的供试品，分别采用XBridge C18、Welch XtimateTM C18、Waters MS C18色谱柱进行测定，记录各待测成分的峰面积值。实验结果如表6所示，采用本研究的样品处理方法和建立的色谱条件，可使用不同厂家同一类型的色谱柱对伤科黄水中的8种成分同时进行测定，RSD％小于5％，系统适用性良好。
表6色谱柱的影响
(6)LC-MS同时测定3批次伤科黄水样品中8种成分的含量
采用上述建立的LC-MS含量测定方法，测定伤科黄水3个不同批次(批号：1721506、1721614、1721724)的供试品，每个样品平行3份，记录各待测成分的峰面积值。实验结果如表7所示，3个不同批次样品各成分的测定结果较一致，RSD％值均小于5％。
表7 3批次伤科黄水样品中8种成分的测定结果
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。