本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种测定植物组织中生长素的方法。
背景技术：
植物激素是植物体内产生的一系列天然小分子化合物，参与调控植物的株型建成，光合作用及水分营养利用等重要生理过程。植物激素根据它们的结构和生理功能主要分为以下几类，包括生长素，细胞分裂素，脱落酸，赤霉素，乙烯五大类。生长素是迄今为止研究最多的一组植物激素，这是因为它们是第一个被发现的植物激素，它们被广泛地应用于植物繁殖草案中。它调节植物细胞分裂、伸长、分化，并呈浓度依赖性的方式。生长素在植物生长和发育的每一个方面都是必不可少的。植物激素在植物体内含量极低，通常在鲜重0.1-50ug/kg的范围内，且植物体内化合物种类复杂多样，因此，植物激素的定性和定量分析一直是植物激素研究领域的难点之一。
植物激素检测方法主要有放射免疫法，酶联免疫法，气相色谱法，高效液相色谱法，气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法等。随着高灵敏质谱技术的发展，越来越多基于高效液相色谱一质谱联用技术的方法建立了起来。高效液相色谱一质谱联用技术可以同时提供目标激素的保留时间以及分子结构信息，具有灵敏度高，适合多组分分析，可靠稳定等优点，可以实现定性和定量分析的同时完成。
植物激素检测前需要对材料中的激素进行提取。溶剂提取方法是目前植物激素研究中最常用的方法。从植物材料中将待测的目标植物激素充分地提取，主要由两方面决定:在液氮冷冻的条件下充分的研磨植物样品；合适的溶剂提取目标物。通过有机溶剂初步提取的植物粗提液中含有大量的干扰物质，这些干扰测定的物质会影响植物激素的准确定性定量分析。因此需要对植物粗提液进行预处理，对待分析的目标植物激素进行纯化富集，尽可能地降低或者消除样品中复杂的背景干扰，从而使样品适合定性定量分析。植物激素的纯化富集方法包括液一液萃取、固相萃取,薄层层析、半制备高效液相色谱纯化及近年来发展起来的新技术，例如固相微萃取和膜萃取技术等。其中液一液萃取基质中存在大量的磷脂等干扰物，产生乳化现象；固相萃取可降低样品基质干扰，提高检测的灵敏度，但所用到的萃取小柱价格较高；固相微萃取所使用的涂有萃取介质的纤维头价格昂贵，易折断，且由于其有限的体积和表面积决定了它有限的富集能力。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明实施例提供了一种测定植物组织中生长素的方法，主要利用液相色谱三重四级杆精确测定植物组织中生长素iaa，解决了检测成本高和操作繁琐的问题。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种测定植物组织中生长素的方法，包括激素提取过程和激素检测过程；其特征在于，所述激素提取过程包括以下步骤：
将新鲜植物样品在液氮中研磨至碎，得到待提取样品；
向所述待提取样品中加入甲醇、丙醇及醋酸的混合提取液和0.5ppm的d5-iaa标样后进行超声处理和离心处理，将得到的上清液置于棕色玻璃瓶中氮吹至干，得到处理物；
对所述处理物进行甲醇重悬后再进行膜过滤，得到的滤液为提取物，对所述提取物进行lc-ms检测。
作为优选，所述新鲜植物、所述混合提取液及所述d5-iaa的比例为100mg：1ml：20μl。
作为优选，所述甲醇、所述丙醇及所述醋酸的体积比为20:79:1。
作为优选，所述超声处理的过程为：4℃超声15min。
作为优选，所述离心处理的过程为：4℃条件下，15000rpm离心15min。
作为优选，所述膜过滤选用0.22μm滤膜。
作为优选，所述激素检测过程是采用液相色谱-质谱联用方法。
作为优选，所述液相色谱检测条件：
色谱柱：thermohypersilgoldc18色谱柱(2.1×100,3um)；
柱温：35℃；
流动相：a:0.1％乙酸水，b:甲醇；
洗脱梯度：0-0.2min，a＝90％；0.2-6min，a递减至10％；6-8min，a＝10％；8.1min，a递增至90％；8.1-10min,a＝90％
进样体积：7μl。
作为优选，所述质谱检测条件：
喷雾电压：3000v；
鞘气：35arb；
辅助气：10arb；
雾化温度：275℃；
离子传输管温度：325℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明在植物材料中仅采用一种提取液(甲醇、丙醇及醋酸的混合提取液，并设计三者合理体积比)直接萃取生长素(iaa)，不使用萃取小柱材料，操作简单且成本低。本发明采用液相色谱三重四级杆技术结合本发明的上述提取方法可精确测定植物组织中生长素iaa。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
激素提取：准确称量约100mg新鲜植物样品，于液氮中研磨至粉碎；向磨碎后样品中加入1ml甲醇/丙醇/醋酸(20/79/1v/v/v)提取液，20ul0.5ppm的d5-iaa标样，4℃超声15min；4℃条件下，15000rpm离心15min；取上清移入棕色玻璃小瓶中，氮吹至干；60ul甲醇重悬；过0.22μm滤膜，对过滤得到的滤液进行lc-ms检测；
液相条件：
色谱柱：thermohypersilgoldc18色谱柱(2.1×100,3um)；
柱温：35℃；
流动相：a:0.1％乙酸水，b:甲醇；
洗脱梯度：0-0.2min，a＝90％；0.2-6min，a递减至10％；6-8min，a＝10％；8.1min，a递增至90％；8.1-10min,a＝90％
进样体积：7μl；
质谱条件：
喷雾电压：3000v；
鞘气：35arb；
辅助气：10arb；
雾化温度：275℃；
离子传输管温度：325℃；
采用本发明实施例1的方法检测iaa结果如表1所示。
表1.iaa及d5-iaa质谱参数列表
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。