本发明涉及一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法。
背景技术：
近年来随着二胎政策的放开，高龄产妇不断增加，出生缺陷率更是呈上升趋势。在出生缺陷的三级预防中，第二级“产前筛查和诊断”是预防出生缺陷中最为重要的手段。羊膜腔穿刺术是高危产妇产前排畸的主要手段，但侵入性强、感染、流产等风险较高。基于胎儿游离dna的无创产前检测，已广泛应用于常染色体非整倍体的筛查，但存在假阳性率高、无法排除父母染色体异常等不足。于1969年发现的母体外周血中的胎儿细胞，具有完整的胎儿遗传信息，且取样方便，侵入性小，是最具潜力的非侵入性产前诊断对象。但是胎儿细胞一直未真正用到产前诊断最大的挑战在于外周血中胎儿细胞含量稀少(1～10个胎儿细胞/毫升，109个红细胞，106个白细胞)，背景干扰强，很难实现其高特异性捕获。如何从成千上万个背景细胞存在的复杂血液环境中准确的分离出胎儿细胞，建立高效、快速、经济的外周血胎儿细胞富集方法是实现无创、准确产前诊断的瓶颈问题。
目前胎儿细胞分离捕获主要存在的问题包括：1、捕获效率非常低。现今胎儿细胞获取的主要方法是磁珠分离法、流式细胞法和细胞涂片法。磁珠分离法及流式细胞术细胞丢失率非常高，对于胎儿细胞的捕获往往需要10毫升以上的外周血，最高甚至需要30毫升，如此高的样本需求量很难让所有孕妇都接受，并且其胎儿细胞的捕获数量却仍在10个以下，富集率过低。而细胞涂片法是借鉴传统有核红细胞检测方法对外周血中胎儿细胞进行分析，细胞涂片法主要依靠人眼识别，需要大量的时间和人力，一个样本的工作时间过长、效率低，并且只能识别而无法实现靶细胞分离。2、细胞活性低，这些方法都涉及到对细胞进行固定等后处理，单细胞无活性或者活性低，难以进行有效的单细胞分析。
微流控芯片具有高通量、体积小、消耗小等特点，近年来，微流控芯片已在循环肿瘤细胞分离富集、单细胞测序等领域大放异彩，可实现外周血中循环肿瘤细胞的高效分离、富集、释放、测序等。目前利用微流控芯片进行细胞分离的方法主要基于两种原理：1)利用亲和性识别捕获；2)利用物理分离，采用微孔过滤或流体力学、超声分离等方法。但是不同于循环肿瘤细胞尺寸大的优势，胎儿细胞尺寸较小，难以通过过滤等手段对细胞进行分离，而且部分胎儿细胞表面标志物不明确，难以进行特异性的胎儿细胞的分离富集。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：
一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法，包括如下步骤：
1)制备用于胎儿细胞捕获的微流控芯片；该微流控芯片设计含有至少一个进样口和至少一个出样口；进样口和出样口之间为具有特定几何排布的微阵列，微阵列样式包含圆形或者三角形；微阵列之间的距离为0-50微米，作为优选，可以为10/20/30/40微米)，后一个柱子较于前一个柱子的偏移角度为0-50°，作为优选，可以为10/20/30/40°；
作为优选，微流控芯片的整体临界尺寸设为dc，其由公式dc＝1.4×g×(δλ/λ)0.48设定，其中，柱子间的水平间距设为g，其大小在0到50微米之间；同一行中三角形垂心之间的距离设为λ，其大小在100-150微米之间；同一行中第二个三角形相较于第一个三角形的向上偏移值设为δλ，其大小在0到20微米之间；微流控芯片的整体临界尺寸设为dc。
2)在所述微阵列表面修饰胎儿细胞特异性识分子；
3)调控微阵列的临界直径为0-50微米，作为优选，可以为10/20/30/40微米、流速为0-10ml/h，作为优选，可以为1/2/3/4/5/6/7/8/9ml/h，使得微流控芯片的细胞捕获效率达到最优；
4)将2-10毫升孕妇外周血进行梯度离心分离，获得单核细胞；
5)将步骤4)得到的单核细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，注入到微流控芯片中进行胎儿细胞的捕获。
本发明的优选实施方案中，所述微流控芯片整体尺寸大小为长约1到5厘米，宽约0.5到2厘米之间，其大小设计根据所需分离的细胞总量大小而具体设定。
本发明的优选实施方案中，微阵列柱子可以是圆柱体，也可以是三角形柱子，其直径或边长大小在10到200微米之间，作为优选，可以为20/40/60/80/100微米等。
本发明的优选实施方案中，其中柱子间的水平间距设为g，其大小在0到50微米之间，可以是10微米、20微米、30微米等；同一行中三角形垂心之间的距离设为λ，其大小在100-150微米之间，可以是100微米、120微米、130微米等；同一行中第二个三角形相较于第一个三角形的向上偏移值设为δλ，其大小在0到20微米之间，可以是1微米、3.5微米、6.5微米、7.5微米等；微流控芯片的整体临界尺寸设为dc，其由公式dc＝1.4×g×(δλ/λ)0.48得到。
本发明的优选实施方案中，所述特异性识别分子，包括抗体、核酸适体或者亲和多肽；其中抗体优选为转铁蛋白(cd71)抗体，或者人白细胞抗原-g(hla-g)抗体；亲和多肽优选为转铁蛋白(cd71)亲和多肽y1；核酸适体优选为通过selex技术筛选出来，对cd71或者hla-g具有高亲和力的核酸适体。
本发明的一个优选实施方式中，所用微流控芯片材料可以为聚二甲基硅氧烷(pdms)，载片材料可以为玻璃。
本发明的一个优选实施方式中，所用微流控芯片采用等离子体键合的方式与载片进行封装。
本发明的一个优选实施方案中，进样口流速为0.1ml/h-10ml/h，例如0.1ml/h、0.3ml/h、0.5ml/h、1ml/h等。
本发明的一个优选实施方案中，胎儿细胞释放可以选择采用化学键断裂，抗体从微阵列柱子表面脱落，造成细胞从芯片中释放出来。
本发明的一个优选实施方案中，胎儿细胞释放可以选择使用激光切割或机械手进行细胞挑取的方式进行。
采用上述技术方案，本发明的技术效果如下：
1)根据细胞尺寸，调节临界尺寸(dc)的大小，结合确定性侧向位移实现细胞的空间分离,增加细胞与微阵列柱子的碰撞频率，进而提高了捕获效率；
2)微阵列柱子设计有旋转角度，使得柱子周围呈现三面梯度剪应力，均利于提高靶标细胞捕获效率以及捕获纯度；
3)结合流体力学与特异性识别两种原理在微流控芯片中对胎儿细胞进行捕获，既提高了捕获效率，又降低了非特异性吸附，该发明方法大大降低了血液的需求量，大大提高了不同样本间胎儿细胞获取的概率；
附图说明
图1为芯片整体结构俯视图。其中(1)为细胞悬液进样口，(2)(3)为缓冲液进样口，(4)(5)(6)为出样口。
图2为微阵列柱子排布及参数示意图，柱子间的水平间距设为g，同一行中三角形垂心之间的距离设为λ，同一行中第二个三角形相较于第一个三角形的向上偏移值设为δλ。
图3a为人b淋巴癌细胞(ramos)细胞在不同临界值芯片中，与微阵列柱子的碰撞概率统计图；图3b为不同细胞在芯片中的捕获效率统计图，左三个柱子为修饰有抗体cd71芯片中，人b淋巴癌细胞(ramos)、人慢性粒细胞白血病细胞(k562)和白细胞的捕获效率，右两个柱子为没有修饰抗体的对照芯片中，上述三种细胞的捕获效率；图3c为不同流速下，细胞的捕获效率统计；图3d为不同个数的胎儿细胞在芯片中的捕获效率统计。
图4a为胎儿细胞在芯片中的分布统计，从统计数据上来看，大部分细胞在芯片的前半部已经被捕获；图4b为芯片中细胞捕获的成像图，白色亮点为捕获的细胞。
图5为孕妇外周血梯度离心示意图。
图6为细胞免疫荧光成像图，第一行和第二行所示鉴定为胎儿细胞，第三行所示鉴定为背景吸附细胞-白细胞。
图7为细胞挑取图示，第一行为芯片中捕获的细胞，第二行为对应该细胞通过显微挑取得到的细胞。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，将不再详细说明。
实施例1胎儿细胞捕获微流控芯片的制备
参见图1，制作微流控芯片，芯片由下至上包括两层pdms，一层玻璃芯片，将pdms厚块、pdms通道层、载片玻璃依次使用等离子键合成完整芯片。芯片设有三个进样口(1)、(2)、(3)和三个出样口(4)、(5)、(6)，进样口与出样口之间为三角形微阵列，其中微阵列排布采用dld设计原理排列，如图1所示。
本实施例中，三个进样口位于芯片的左侧，三个出样口位于芯片的右侧，采用0.7mm打孔笔制备进出样口。
本实施例中，芯片尺寸设计为宽1厘米，长4.5厘米。
在本实施例中，柱子间的水平间距g，设为32微米，同一行中三角形垂心之间的距离λ，设为122.5微米，同一行中第二个三角形相较于第一个三角形的向上偏移值δλ，设为3.5微米，则该微流控芯片的整体临界尺寸dc为8微米。
本实施例中，抗体的修饰采用化学修饰的方法进行，在上述通过等离子键合后的芯片中，通入溶于乙醇的4％(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mpts)，每隔5分钟通一次，持续1小时，用乙醇冲洗通道，放入100°烘箱加热1小时；取出通入溶于乙醇的0.01％4-马来酰亚胺丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(gmbs)，每隔5分钟通一次，持续30分钟，之后先用超纯水冲洗通道，再用1×pbs冲洗，通入20μg/ml链霉亲和素，孵育1小时，用pbs冲洗再通入20μg/ml生物素化的cd71或hla-g抗体，孵育1小时，用pbs冲洗，放4°冰箱待用。以此，得到含有抗体修饰的微流控芯片。
实施例2模拟胎儿细胞捕获表征
所述条件参数及具体步骤如下：
1)荧光预染色的靶细胞(ramos&k562)或者对照细胞(wbcs)通过细胞计数后重悬到pbs缓冲溶液；
2)将样品通过进样系统从进样孔(1)注入，缓冲溶液通过(2)、(3)注入；
3)通过进样口(1、2、3)注入pbs缓冲液清洗芯片；
4)细胞通过计数统计，与注入的细胞数相除，计算捕获效率；
芯片上结合转铁蛋白cd-71抗体，捕获靶标细胞效率均大于80％，白细胞0.016％。
本实施例中，结果如图3所示。
图3为微流控芯片对模拟胎儿细胞捕获效率的统计。图5a为不同临界值的芯片中，ramos细胞的碰撞效率的统计图，碰撞效率越高，能得到越好的捕获效率；图5b为细胞实际捕获情况；图5c为不同流速对细胞效率的影响；图5d为不同细胞个数在芯片中的捕获效率的考察。
图4a为模拟胎儿细胞在芯片中的分布统计，从统计数据上来看，大部分细胞在芯片的前半部已经被捕获；图4b为芯片中细胞捕获的成像图，白色亮点为捕获的细胞。
实施例3含有胎儿细胞的单核细胞悬液的制备
取孕妇外周血两毫升，加入pbs缓冲液稀释成4毫升，采用percoll梯度离心处理上述样本，取得单核细胞层，洗涤，重悬得到单核细胞悬液。其中percoll密度采用1.090，离心力为400g，时间为30分钟。图5为孕妇外周血梯度离心示意图。
实施例4胎儿细胞的捕获及鉴定
将实施例3中的单核细胞悬液，通过注射泵通入实施例1中的微流控芯片，其中流速设为0.3ml/h，通完单核细胞悬液后，利用pbs缓冲液清洗3次，最大程度上去除非特异性吸附的背景细胞。在本实施例中，配置细胞固定液，利用注射器通过上述捕获有胎儿的细胞的微流控芯片中。静置15分钟，用pbs清洗；再加入芯片封闭液进行封闭，静置30分钟后，用pbs清洗。
在本实施例中，采用荧光抗体染色方法对胎儿细胞进行鉴定，所述抗体组成为：1)有核红细胞：红色荧光cd-45抗体+绿色荧光gpa抗体；2)滋养层细胞：红色荧光cd-45抗体+蓝色荧光hla-g抗体+绿色荧光ck抗体。往芯片中通入抗体混合液后，避光静置1小时，用pbs清洗掉多余的染料后，加入细胞核染色液，复染细胞核10分钟，pbs清洗后，置于荧光显微镜下观察细胞染色结果，结合细胞形态学，分析和记录胎儿细胞个数。图6为细胞免疫荧光成像图，第一行和第二行所示鉴定为胎儿细胞，第三行所示鉴定为背景吸附细胞-白细胞。
实施例5胎儿细胞释放及扩增测序
将实施例4中所鉴定的胎儿细胞进行毛细显微挑取，获得单个胎儿细胞，图7为细胞挑取图示，第一行为芯片中捕获的细胞，第二行为对应该细胞通过显微挑取得到的细胞。将所得胎儿细胞进行单细胞扩增，可采用商品化试剂进行扩增(可为mda或malbac方法)，扩增后凝胶电泳表征，纯化(柱纯化或磁珠纯化)，送样测序分析。