一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法与流程

本发明属于免疫层析试纸条的制备技术领域，具体涉及一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法。

背景技术

新城疫(newcastledisease)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)引起的一种急性、热性、败血性和高触性禽类传染病，其发病率与死亡率都很高，严重危害着我国养禽业的发展。新城疫病毒属于副黏病毒科(paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属，单股负链rna病毒，有囊膜，其基因组全长为15186bp，编码6个结构蛋白，包括磷蛋白(p)、核蛋白(np)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、大蛋白(l)以及血凝素-神经氨酸蛋白(hn)六种蛋白。血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)具有血凝素活性(ha)及神经酸氨酶活性(na)并能协同f蛋白发挥作用，在病毒感染过程中，hn蛋白特异性地识别宿主细胞表面唾液酸受体，这是病毒感染宿主细胞所必须的，并且能够诱导机体产生保护性免疫抗体。

目前，常用的检测方法有血凝素反应(hemagglutinin，ha)、血凝抑制反应(hemagglutinininhibition，hi)、酶联免疫吸附试验法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)和实时定量pcr等检测方法，然而这些方法都比较耗时费力，需要实验室特殊的设备才能检测，并且不能及时地对鸡新城疫病毒的流行传播做出诊断。现有的ndv免疫胶体金检测方法是通过小鼠骨髓瘤细胞制备ndv单克隆抗体，然后标记胶体金制备ndv快速检测试纸条，此方法需要制备纯化的抗原、免疫小鼠及饲养动物细胞等繁琐的过程。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法，根据鸡新城疫病毒hn蛋白设计合成13条多肽，分别与鸡新城疫病毒临床抗体进行elisa检测，筛选到多肽p25(其氨基酸序列为tcpdeqdyqlrma)能够与鸡新城疫病毒发生特异性反应，将多肽p25吸附于亲和层析柱，从鸡新城疫高免血清中筛选针对多肽p25的表位抗体，再将多肽p25表位抗体标记胶体金后制备快速检测试纸条用于快速检测鸡新城疫病毒。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条的底层为pvc板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽p25表位抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有新城疫病毒mab溶液印制的检测线和兔抗鸡igg溶液印制的质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm，多肽p25的氨基酸序列为tcpdeqdyqlrma。

进一步优选，所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2mm，金标抗体结合垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm，吸收垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm。

本发明所述的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其特征在于具体步骤为：

(1)鸡新城疫病毒高免血清的制备

将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获新城疫病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化新城疫病毒，以1mg/ml的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清，用多肽p25通过elisa方法检测抗体滴度，并将收集到的血清于56℃灭活30min，于-70℃保存备用；

(2)多肽p25表位抗体的制备

根据immobilizationkit试剂盒将多肽p25稀释至500μg/ml并标记免疫亲和层析柱，将制备的鸡新城疫病毒高免血清通过免疫亲和层析柱，最后用洗脱液洗脱多肽p25表位抗体，重复2-3次，将收集到的多肽p25表位抗体于-20℃保存备用；

(3)金标抗体结合垫的制备

将多肽p25表位抗体于4℃经15000rpm离心30min除去沉淀物，在离心管中依次加入胶体金溶液和多肽p25表位抗体，室温下避光静置30min，再加入1/10胶体金溶液体积的含10wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液，于4℃经13000rpm离心30min，弃去上清，用与胶体金溶液等体积的含2wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液重悬胶体金，于4℃经13000rpm离心30min，弃去上清，用1/2胶体金溶液体积的含1wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液悬浮胶体金，完成胶体金标记多肽p25表位抗体工作，置于4℃保存备用；

(4)硝酸纤维素膜的制备

将新城疫病毒mab和兔抗鸡igg分别用pbs稀释到1mg/ml按1μl/cm均匀喷涂到硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，检测线和质控线相距5mm位于硝酸纤维素膜的中心，室温自然干燥，封装后于4℃保存备用；

(5)试纸条的组装

将胶体金标记多肽p25表位抗体吸附于结合垫上得到金标抗体结合垫，再将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至pvc板构成的支撑层上，然后裁切为宽度为4mm的长条状试纸条，再将试纸条装入试纸卡中，放入烘烤箱中干燥保存备用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：采用胶体金标记的多肽p25表位抗体成功制备了ndv抗原快速检测试纸条，该ndv抗原快速检测试纸条显示出较高的灵敏度和特异性，与其它家禽疾病如ibdv和aiv无交叉反应性，与血细胞凝集实验结果高度一致；与ha实验相比，ndv快速检测试纸条可以检测5undv，并能能够在3-5min内检测ndv，而且不依赖于其它仪器和试剂，因此便于在现场快速检测ndv病毒。

附图说明

图1是本发明鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；

图2是本发明鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的检测示意图；

图3是本发明鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条灵敏性检测图；

图4是本发明鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条特异性检测图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

如图1所示，鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条，所述试纸条的底层为pvc板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽p25表位抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有新城疫病毒mab溶液印制的检测线和兔抗鸡igg溶液印制的质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm，多肽p25的氨基酸序列为tcpdeqdyqlrma。

鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法为：

(1)鸡新城疫病毒高免血清的制备

将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获新城疫病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化新城疫病毒，以1mg/ml的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清，用多肽p25通过elisa方法检测抗体滴度，并将收集到的血清于56℃灭活30min，于-70℃保存备用；

(2)多肽p25表位抗体的制备

根据immobilizationkit试剂盒将多肽p25稀释至500μg/ml并标记免疫亲和层析柱，将制备的鸡新城疫病毒高免血清通过免疫亲和层析柱，最后用洗脱液洗脱多肽p25表位抗体，重复2-3次，将收集到的多肽p25表位抗体于-20℃保存备用；

(3)金标抗体结合垫的制备

将多肽p25表位抗体于4℃经15000rpm离心30min除去沉淀物，在离心管中依次加入胶体金溶液和多肽p25表位抗体，室温下避光静置30min，再加入1/10胶体金溶液体积的含10wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液，于4℃经13000rpm离心30min，弃去上清，用与胶体金溶液等体积的含2wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液重悬胶体金，于4℃经13000rpm离心30min，弃去上清，用1/2胶体金溶液体积的含1wt％bsa的20mmol/l四硼酸钠溶液悬浮胶体金，完成胶体金标记多肽p25表位抗体工作，置于4℃保存备用；

(4)硝酸纤维素膜的制备

将新城疫病毒mab和兔抗鸡igg分别用pbs稀释到1mg/ml按1μl/cm均匀喷涂到硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，检测线和质控线相距5mm位于硝酸纤维素膜的中心，室温自然干燥，封装后于4℃保存备用；

(5)试纸条的组装

将胶体金标记多肽p25表位抗体吸附于结合垫上得到金标抗体结合垫，再将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至pvc板构成的支撑层上，然后裁切为宽度为4mm的长条状试纸条，再将试纸条装入试纸卡中，放入烘烤箱中干燥保存备用。

免疫层析试纸检测原理如图2所示，用生理盐水稀释的待检血清样品滴至样品垫上后，在毛细作用下，从样品垫一端往吸收垫一端流动，若样品中含有ndv，金标抗体会与之结合形成抗原-抗体-胶体金复合物，形成的复合物在移动至检测线和质控线处时，样品中的ndv与检测线上的新城疫病毒mab结合并形成一条红线即为检测线(t线)，质控线上的兔抗鸡igg则将会与多肽p25的金标抗体结合形成另一条红线即为质控线(c线)。由于阴性ndv不含有ndv病毒，因此检测线上的新城疫病毒mab不能与抗原-抗体-胶体金复合物结合而拦截金标抗体，所以检测线处无条带，但是质控线上的兔抗鸡igg却能始终与多肽p25金标抗体结合而形成一条红线，因此通过质控线能判断试纸条是否有效。

血凝试验检测ndv病毒

根据所有新城疫病毒株都可以凝集鸡红细胞，并且是肉眼可见的，血细胞凝集试验检测ndv病毒颗粒是新城疫检测的金标准。首先分别在v形底微孔板中加入25μlpbs，然后将25μl的测试样品置于第一孔中，依次将ndv稀释至2^-1-2^-9。向每个孔中加入25μl的1％红细胞，然后在室温下轻轻敲打板的侧面15min，读取并记录每个孔中的结果。

室温15min后，红细胞完全凝集，结果表明2^-8稀释的病毒液可以完全凝集鸡红细胞。因此，ndv毒株的ha效价是2^-8，即ndv毒株的血细胞凝集中病毒滴度的1u是2^-8。

试纸条的灵敏度和特异性检测

用血细胞凝集试验(ha)测定ndv毒株的样品的病毒滴度，然后用ndv检测试纸条检测含有ndv病毒1-50u的连续稀释度。血细胞凝集素检测的病毒滴度中的1u指的是可以引起红细胞完全凝集的最小量的病毒。同时，感传染性法氏囊病毒(ibdv)和禽流感病毒(aiv)用作阴性对照。

来自不同批次的ndv抗原检测试纸条分别检测ndv病毒的灵敏度，与血凝集相比，ndv抗原快速检测试纸条能够检测到5undv(图3)。通过对2个阳性ndv样品进行检测，ibdv毒株和aiv毒株用作阴性对照。结果表明，2个ndv样品在测试线和对照线出现了红色的条带，而阴性对照在对照线处仅出现了1个条带(图4)。

临床样品检测

收集不同地区疑是感染ndv病毒病鸡组织86份，包括气管，盲肠扁桃体，口腔拭子，肠等，分别取少许组织样品，加入1mlpbs研磨，反复冻融3次后，12000rpm离心1min。分别用ha和ndv抗原检测试纸条检测。

分别用ndv抗原快速检测试纸条和ha测试来自不同地区的86个ndv样品(表1)。结果显示：ndv抗原快速检测试纸条与ha检测结果高度一致，其准确率达到98.8％(85/86)。

表1ndv临床检测结果

新城疫是危害我国养禽业最严重的疫病之一，与高致病性禽流感并列为世界公认的最重要的2个禽类疫病。该病为oie规定的必须报告的疾病，也是我国规定的一类动物疫病，世界各国对新城疫的防制和研究一直十分重视。hn蛋白是ndv病毒一种重要的多功能表面糖蛋白，由细胞质结构域、跨膜区、茎区和球状头组成，其中存在受体结合表位、神经氨酸酶活性位点和抗原表位。前期试验表明，新城疫病毒hn蛋白的肽p25可以与ndv超免疫血清反应。在本发明中利用亲和层析的方法从ndv超免疫血清中筛选针对多肽p25的表位抗体。

本发明采用胶体金标记的多肽p25表位抗体成功制备了ndv抗原快速检测试纸条，该ndv抗原快速检测试纸条显示出较高的灵敏度和特异性，与其它家禽疾病如ibdv和aiv无交叉反应性，与血细胞凝集实验结果高度一致；与ha实验相比，ndv快速检测试纸条可以检测5undv，并能能够在3-5min内检测ndv，而且不依赖于其它仪器和试剂，因此便于在现场快速检测ndv病毒。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110>新乡学院

<120>一种应用表位抗体建立的鸡新城疫病毒免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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1510