生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法与流程

本发明涉及法医药品分析领域。更具体地，涉及一种生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法。

背景技术

植物生长调节剂是用于调节植物生长发育的一类农药，可在植物体内传导至作用部位，以促进或抑制其生命过程中的某些环节，使之向符合人类的需要发展。随着农业现代化进程的加速推进，运用植物生长调节剂调控植物的生长发育和产量形成(即作物化学控制技术)，已经逐渐成为农业生产中不可缺少的重要措施。与传统农药相比,植物生长调节剂具有许多优越性，它能够调控基因的表达，实现作物生长的“人为”调控。国内外已经把植物生长调节剂的应用作为21世纪农业实现超产的主要措施之一。

6-苄氨基嘌呤、多效唑是近年来案件中常出现较多的植物生长调节剂。6-苄氨基嘌呤和多效唑的物化性质及药物性质总结如下：

1、6-苄氨基嘌呤

6-苄氨基嘌呤又名6-苄基腺嘌呤，英文名称6-benzylaminopurine，简称6-ba，分子式为c12h11n5，分子量为225.2，熔点230-233℃，难溶于水，在醇中溶解度较大。

6-苄氨基嘌呤是一种人工合成的细胞分裂素,在植物体内含量甚微,但对植物的生长发育具有显著的影响,其主要作用是促进细胞的分裂和扩大,促进侧芽的发育,抑制衰老、保绿等,具有诱导同化物向施用部位定向运输的作用，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。6-苄氨基嘌呤属低毒类农药，ld50(口服)：大鼠(雄性)2965mg/kg，大鼠(雌性)1005mg/kg。

2、多效唑

多效唑，又名氟丁唑，英文名paclobutrazol，其化学名为：(2rs,3rs)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1h-1,2,4-三唑-1-基)-戊-3-醇，分子式c15h20cln3o，分子量为293.8，熔点165-166℃，易溶于水、甲醇。

这两种植物生长调节剂具有共同的特点：均为化学合成类农药，在生产上被作为生长促进剂广泛应用，尤其是可促进细胞分裂的“无根素”—6-苄氨基嘌呤，在豆芽生产过程中的添加滥用现象更为普遍。因此建立生物体液(血、尿)中两种植物生长调节剂的快速灵敏的检验方法，并利用简单的动物模型，反应其在血液中的代谢情况以解决案件中的检验难题，是法庭科学的实际工作中的现实需要。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种简便快速、灵敏度高、重现性好、结果准确可靠的生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，包括如下步骤：

(1)生物体液预处理；

(2)植物生长调节剂的检测。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，生物体液为血液或尿液。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，6-苄氨基嘌呤和多效唑采用液-液萃取法。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，所述液-液萃取法的萃取溶剂为环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、或氯仿和异丙醇按照体积比为3:1组成的混合溶液。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(1)中，所述液-液萃取法包括如下步骤：取含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液1ml，加入环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿和异丙醇按照体积比为3:1组成的混合溶液振荡提取，离心10min、转速为8000r/min，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μl甲醇溶解定容留待gc-ms检测；或者过0.22μm的有机微孔滤膜，所得物即为液-液萃取法预处理液，留待gc-ms检测。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，步骤(2)中，利用气相色谱质谱gc/ms检验方法检测含6-苄氨基嘌呤和多效唑生物体液中6-苄氨基嘌呤和多效唑含量时的色谱条件及质谱条件如下：

气相色谱条件：色谱柱：db-5ms弹性石英毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm；程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度280℃；载气：氦气；流速：1ml/min；分流比：10:1；进样量1μl；

质谱条件：传输线温度200℃；离子源温度200℃；离子源：ei，电子轰击能量70ev；扫描方式：scan；扫描范围：40amu～450amu；溶剂延迟时间：2.5min。

上述生物体液中植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤和多效唑的检测方法，含6-ba和多效唑生物体液保存在-20℃条件下，保存时间小于或等于1个月；经冷冻的含6-ba和多效唑体液，冻融后72h内进行检测。

本发明的有益效果如下：

(1)生物体液中6-苄基腺嘌呤和多效唑在血液及尿液中，在10μg/ml添加水平上，方法的回收率可达80％，精密度小于11％。

(2)生物体液中6-苄基腺嘌呤、多效唑的gc-ms方法的检出限为0.3μg/ml，仪器检出限为0.5μg/ml。

(3)建立染毒动物模型，通过测定6-苄基腺嘌呤和多效唑两种植物生长调节剂在染毒大鼠血液中浓度，验证方法的可靠性,为植物生长调节剂相关中毒案件的检验提供科学依据。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图16-苄氨基嘌呤的化学结构；

图2多效唑的化学结构；

图36-ba标准工作曲线；

图4多效唑标准工作曲线；

图5空白血样6-ba的提取离子流图；

图6添加血样中6-ba的提取离子流图；

图7空白尿样6-ba的提取离子流图；

图8添加尿样中6-ba的提取离子流图；

图9空白血样多效唑的提取离子流图；

图10添加血样中多效唑的提取离子流图；

图11空白尿样多效唑的提取离子流图；

图12添加尿样中多效唑的提取离子流图；

图136-ba质谱图；

图14多效唑质谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

第一部分生物体液中6-苄氨基嘌呤多效唑检测方法

一、实验部分

1实验材料

1.1药品与试剂

6-苄基腺嘌呤购自dr.ehrenstorfer公司(德国)，纯度99.0％；

多效唑购自dr.ehrenstorfer公司(德国)，纯度99.0％；

甲醇(色谱纯，fisherscientific公司)；

乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、(分析纯，北京化学试剂公司)；

0.22μm过滤膜(北京八方公司)；

去离子水经milliporesimplicity纯水系统制备。

1.2生物样品

空白人全血购自北京市红十字血液中心；

空白尿采自一周内未服用任何药物的健康志愿者。

1.3标准溶液的配制

1.3.1储备液的配制：

6-苄氨基嘌呤储备液的配制：精确称取6-苄氨基嘌呤标准品10mg于10ml容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml的6-苄氨基嘌呤储备液，4℃冰箱中保存，备用。

多效唑储备液的配制：精确称取多效唑标准品10mg于10ml容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml的多效唑储备液，4℃冰箱中保存，备用。

1.3.2工作液的配制：

单一标准工作液的配置：移取各标准储备液一定量，稀释成浓度为100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml的6-苄氨基嘌呤的单一标准工作溶液、以及多效唑的单一标准工作溶液，避光4℃冰箱中保存。

混合标准物质工作液：移取一定量的标准物质储备液稀释成6-苄氨基嘌呤和多效唑浓度均为100μg/ml、50μg/ml10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml浓度的6-苄氨基嘌呤和多效唑的混合标准系列溶液，避光4℃冰箱中保存。

1.4仪器及参考条件

岛津2010gc-npd，2010gc-ms(日本)；

bp210s电子天平(德国sartorius公司)；

milliporesimlicity纯水净化系统(法国)；

scientificindustries漩涡振荡器(usa)；

sorvall高速冷冻离心机(德国)；

eyela高速振荡器(日本)；

dsy-ⅱ自动快速浓缩仪(北京精华苑科技有限公司)；

eyelacutemixercm100振荡器(日本京东)；

10～100μl，10～1000μl自动移液枪(德国eppendorf)。

2样品的制备方法

本发明用液-液萃取法对血液、尿液中植物生长调节剂的不同溶剂的萃取效率进行了比较，具体操作如下：

取血或尿液1ml，乙酸乙酯振荡提取，高速离心(8000r/min，10min)，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μl甲醇溶解定容，供gc-ms分析；或过0.22μm的有机微孔滤膜后，供gc-ms分析。

3仪器参考条件

3.1气相色谱质谱条件(gc/ms)条件：

色谱条件：

a)色谱柱：db-5ms弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；

b)程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；

c)进样口温度280℃；

d)载气：he；

e)流速：1ml/min；

f)分流比：10:1；

g)进样量1μl。

质谱条件：

h)离子源温度200℃；

i)离子源：ei，电子轰击能量70ev；

j)扫描方式：scan；

k)扫描范围：40amu～450amu；

l)溶剂延迟时间：2.5min。

4、方法的确证

4.1液液萃取-气相色谱质谱检验方法

按照“2.1液液萃取法”对样品进行处理，按照“3.1气相色谱质谱分析条件”进行仪器检测，对方法进行方法论证。包括方法的专属性、灵敏度、回收率、精密度等指标。

4.1.1标准工作曲线

用移液器精确吸取标准工作液适量，用甲醇稀释定容成最终浓度为1、5、10、50、100μg/ml的标准工作液，各取1μl分别进样，每个样品平行进样三次，用6-ba的定量离子(225)和多效唑的定量离子(236)的峰面积(y)对标准浓度(x)进行线性回归，求得6-ba的的回归方程为y＝13369x-34074r²＝0.999，多效唑的回归方程为y＝20858x-18952r²＝0.999，工作曲线见图3、4。结果表明此两种植物生长调节剂在1～100μg/ml浓度范围内有着良好的线性关系。

4.1.2方法专属性

取空白血或尿，加入一定量的6-ba和多效唑标准溶液，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，同时做空白血的对照试验，将二者的图谱进行比较(见图5至图12)。结果在6-ba和多效唑时间段内，空白血及尿均未出现明显的色谱峰，表明生物体液中内源性杂质不会对此两种植物生长调节剂的的测定造成干扰，说明本发明建立的方法具有较高的专属性。

4.1.3方法的回收率

用标准加入法进行回收率实验，取空白的血样、尿样，分别加入一系列浓度的6-ba和多效唑混合标准工作液，使其在每一种样品中6-ba和多效唑的添加浓度均分别为1、5、10μg/ml，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以测得的添加各样品中两种植物生长调节剂的定量离子的峰面积与对照品相同浓度峰面积的比值来计算回收率，结果见表1。

表1生物检材中添加植物生长调节剂的平均回收率(％)n＝3

4.1.4方法线性考察

取空白的血样、尿样，分别加入适量的6-ba、多效唑标准液，使6-ba、多效唑在每一种样品中的添加浓度均分别为1、5、10、50、100μg/ml，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以测得的添加各样品中两种植物生长调节剂的定量离子的峰面积为纵坐标(y)，以样品中添加两种植物生长调节剂的浓度为横坐标(x)，进行线性回归，求得线性回归方程，结果如下：

血液中6-ba:y＝31353x-38125r²＝0.999

尿液中6-ba:y＝11689x+18301r²＝0.997

血液中多效唑:y＝12115x+38684r²＝0.997

尿液中多效唑:y＝83639x+15998r²＝0.999

以上结果表明，该方法对血液、尿液样本中的6-ba和多效唑在1μg～100μg/ml范围内有着良好的线性关系。

4.1.5方法的精密度

用标准溶液加入法对方法的精密度进行考察。取空白的血样、尿样，加入适量的6-ba、多效唑标准液，使6-ba、多效唑在每一种样品中的添加浓度均分别为1、5、10μg/ml，每一样品每一浓度平行3份，按照“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，每份样品平行进样3次，连续测定三天，计算各组分峰面积的标准偏差，得到日内精密度与日间精密度(见表2、3)。结果表明6-ba日内精密度介于3.42～5.85％之间，日间精密度介于4.87～8.33％之间，多效唑日内精密度介于4.41～9.31％之间，日间精密度介于4.91～10.29％之间，说明该方法的重现性良好。

表2尿液样品中添加植物生长调节剂的精密度实验n＝3

表3血液样品中添加植物生长调节剂的精密度实验n＝3

4.1.6方法的灵敏度

依据“2.1液液萃取方法”进行样品制备，“3.1气相色谱质谱分析条件”进行分析检测，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.3μg/ml，以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.5μg/ml。

一、结果与讨论

2.1样品制备方法选择

2.1.1液-液萃取方法

萃取溶剂的选择：液-液萃取中最关键的步骤是萃取溶剂的选择，它会直接影响到萃取效果，尤其是对于中性药毒物。本发明对环己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿:异丙醇(体积比3:1)五种萃取溶剂，在中性条件下对尿液中添加6-ba和多效唑进行了比较(对1ml含6-ba和多效唑10μg/ml的水样进行萃取，每种溶剂平行3份)，结果如表4表明二氯甲烷对多效唑的萃取效果较好而乙酸乙酯对6-ba的萃取效果较好，二氯甲烷作萃取溶剂二者共同的萃取溶剂较为理想，但由于二氯甲烷比重较大，萃取后有机溶剂在试管底部，不易进行操作，而且提取过程中很容易发生乳化，因此本发明选用乙酸乙酯做萃取溶剂。

表4不同萃取溶剂的选择(n＝3)

2.2分析条件的选择

2.2.1气相色谱质谱条件的选择：

气相色谱质谱，最大的优势是有固定的谱库(nist)，可对未知物进行排查，6-ba和多效唑的质谱图与nist谱库里的相一致见图13、14)。在本发明中，通过优化升温程序，使目标物尽可能的与杂质分开，得到了良好的效果。

二、结论

本发明建立了生物体液中6-ba、多效唑的液-液萃取前处理方法和气相色谱质谱方法。所建立的方法回收率高、重现性好、提取产物较干净。添加的平均回收率在80％以上，方法简便快速、灵敏度高、重现性好、结果准确可靠，为进一步研究6-ba、多效唑的染毒动物实验及稳定性考察提供了技术手段。本发明方法可满足涉及此两种植物生长调节剂中毒案件的检测。

第二部分稳定性考察

植物生长调节剂6-ba、多效唑在不同的介质及不同的储存条件下放置过久其含量可能发生变化，为保证定量的准确，必须对植物生长调节剂6-ba、多效唑的稳定性进行考察。在毒物分析中从现场检材的提取到送实验室检验，需要经历一定的时间段，由于植物生长调节剂6-ba、多效唑本身的理化性质及生物样品中一些内源性物质的作用，可能导致植物生长调节剂6-ba、多效唑在生物检材中发生分解。所以检材存放的条件和时间对植物生长调节剂6-ba、多效唑的浓度有很大的影响，本发明对两种植物生长调节剂6-ba、多效唑在不同溶剂和血液样本中的稳定性进行了考察。

一、试剂、材料与仪器(同前)

二、实验部分

2.1溶液中稳定性考察

分别配制含10、50、100μg/ml6-ba和多效唑的甲醇溶液，每一浓度各3份，密封，置于4℃冰箱中保存，放置0、1、2、3、4周后，按“第一部分3分析方法”对样品进行分析，每次结果与浓标新稀释后的相同浓度的作比较，此两种植物生长调节剂在1、2、3、4周的测定结果相互间差异无统计学意义(p>0.05)，说明两种植物生长调节剂的甲醇溶液在4℃冰箱中1月内具有稳定性。

2.2提取样品反复冻融的稳定性的考察

用空白血或空白尿的提取液，配置20μg/ml的两种药物溶液3份，-20℃保存，放置24、48、72h后，按“第一部分3.1分析方法”对样品反复进行分析，(分析完样品密封保存，待下一时间点分析)，每次分析结果与标准品进行比较，结果两种药物在72小时的测定结果相互间差异无统计学意义(p>0.05)，说明两种植物生长调节剂在提取样品溶液中72h内具有稳定性。

2.3两种植物生长调节剂在血液、尿液中稳定性的考察

准备1ml血液及尿若干份于塑料试管中，向每份中添加1μg的6-ba和1μg的多效唑两种标准物质，6-ba和多效唑合并添加为一组将其分成2份，每份中有5组、每组3样本，分别于常温及-20℃冰箱中保存，在放置的第0、7、14、21、30天，按液液萃取气相色谱质谱法对6-ba和多效唑进行检验，每次检测需有新配制新鲜血液样本平行操作，并以新配制血液样本计算被测样本中的含量。设定第0天的样品的检测量为100％，每次的检测量按照起初值的百分比来计。结果在-20℃冰箱中保存的样本中两种植物生长调节剂的含量无明显变化。

三、结论

1、6-ba和多效唑的甲醇溶液在4℃冰箱中1月内具有良好的稳定性。

2、含6-ba和多效唑生物体液经冷冻后，72h内反复冻融不影响含量。

3、含6-ba和多效唑生物体液在-20℃条件下保存1月，其含量不会发生明显变化。

第三部分动物实验

一、材料

1.1仪器

同第一部分。

1.2试剂

除生理盐水外，其余均同第一部分。

1.3动物

实验用wistar雄性大鼠，体重500g±20g，购于华富康生物科技股份有限公司。适应性喂养2天。饲养环境：温度17℃，湿度45％～65％，通风换气良好，光照合理，笼具和垫料卫生、无毒，喂营养颗粒饲料和高压消毒灭菌水。

1.4药物配制

精确称取6-ba和多效唑一定量，充分溶解于生理盐水中，混匀，配制成浓度均为2.5mg/ml的6-ba和多效唑混合溶液，置4℃冰箱保存；

2.动物实验方法

2.16-ba和多效唑灌胃给药模型及检材的采集

健康wistar雄性大鼠6只，实验前禁食12h，自由饮水。其中1只做空白对照，其余5只以35mg/kg剂量灌胃给予6-ba和多效唑混合溶液，于3h将大鼠处死，取血、尿，采用液液萃取，气相色谱质谱进行分析。

2.26-ba和多效唑样品检测

取灌服6-ba、多效唑大鼠血或尿液1ml，于15ml塑料离心管中，6ml乙酸乙酯振荡提取，高速离心(8000r/min，10min)，转移有机相至尖底玻璃试管中，重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用100μl甲醇溶解定容，供gc-ms分析。

气相色谱质谱条件：色谱柱：db-5ms弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：80℃起始，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度280℃；载气：he；流速：1ml/min；分流比：10:1；进样量1μl。质谱条件：传输线温度200℃；离子源温度200℃；离子源：ei，电子轰击能量70ev；扫描方式：scan；扫描范围：40amu～450amu；溶剂延迟时间：2.5min。

3.结果

3.1工作曲线

分别在空白大鼠血、尿中加6-ba和多效唑标准品，使其浓度分别为0.5，1，5，10，50μg/ml，按照2.1.1方式进行检测，以目标物的浓度为横坐标(x)，以其定量离子峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，求得回归方程:

血中6-ba回归方程：y＝40517x-37107r²＝0.997

尿中6-ba回归方程：y＝11463x+51227r²＝0.998

血中多效唑回归方程：y＝79854x+59720r²＝0.999

尿中多效唑回归方程：y＝11297x+16481r²＝0.996

3.2专属性实验

取空白大鼠的血液各1ml，加入一定量的6-ba和多效唑标准溶液，按照2.2方法进行样品制备及检测，同时做空白对照，将二者的图谱进行比较，结果表明均无内源性杂质对两种植物生长调节剂的测定造成干扰。

3.3两种植物生长调节剂给药后大鼠血、尿中含量

取动物实验所得血液、尿液样本，按照2.2方法进行样品制备及检测，以保留时间结合特征离子峰(6-ba、多效唑)进行定性，以标准曲线法进行定量。大鼠血液、尿液样本中植物生长调节剂浓度见表5。

表5植物生长调节剂在大鼠血、尿中的浓度(n＝5)

4结论

本发明主要是通过进行动物实验，验证检验方法的可行性。给药后，在血液、尿液等检材中均检出了两种植物生长调节剂。此外，本实验给药量分别为35mg/kg，远低于两种植物生长调节剂的ld50，证明在因投毒、误服植物生长调节剂导致死亡的实际案件中对血液、尿液等检材进行检验是可行的。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。