用于高灵敏度检测红霉素的3D镍金合金纳米簇印迹修饰电极的制作方法

本发明公开一种电化学印迹传感器用工作电极，尤其是一种利用可见光诱导atrp的方法制备的用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

背景技术

红霉素（em-erythromycin）（mw733.93）是链霉菌所产生的大环内酯类抗生素的第1代产品，针对部分细菌感染所引起的皮肤疾病、呼吸道疾病、牙周组织损伤等疾病具有很好的治疗效果。在水产品和畜牧业养殖过程中常投入大量红霉素来预防各种疾病，但由于红霉素代谢周期比较长，若使用过量等会污染生态环境。同时红霉素还会残留在动物体内，长期食用含有红霉素的食物，会通过食物链富集到人体，对人体造成很大的副作用，如对细菌产生耐药性、过敏反应、肝毒性及肝功能异常等。目前红霉素的常用检测方法有薄层色谱法、液相色谱-质谱法以及微生物法等，但这些方法操作繁琐，价格昂贵，对操作人员有技术要求。

分子印迹是一种独特复制记忆方法，可以被生动的描述为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。分子印迹技术的核心是分子印迹聚合物，是将功能单体和目标分子通过非共价或者共价的方式共聚生成聚合物，再通过溶剂将目标分子洗脱，在聚合物中留下独特的“记忆”空穴，该空穴可以与混合物中的目标分子进行可逆的特异性结合，已在兽药残留分析中得到了广泛的应用。

目前，制备分子印迹聚合物的方法有多种，原子转移自由基聚合（atrp）是实现“活性”/可控聚合的常用方法，是制备分子印迹聚合物的有效手段之一。但是在传统的atrp方法中，其催化剂通常为低价态过渡金属配合物，该金属配合物价格昂贵、对空气敏感且会对环境产生较大负面影响。无金属可见光调控atrp方法是近年来发展起来的atrp聚合新手段，是在可见光照的条件下借助有机小分子光敏剂（如荧光素）催化聚合功能单体，其聚合过程中不需要过渡金属催化剂，具有精准、可控、反应环境绿色、温和及易获得等优点。

电化学传感器是由工作电极、参比电极及对电极构成的三电极体系，是一种利用电化学信号变化对被测样品进行检测的装置，具有灵敏度高、制备简便、成本低、易于微型化、适合现场检测等特点，是迄今为止最为成熟的生物传感技术之一。迄今为止，并没有利用可见光诱导atrp的方法制备的用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种利用可见光诱导atrp的方法制备的用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

本发明的技术解决方案是：一种用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，其特征在于所述工作电极依次按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso40.25~4mol，nicl20.05~0.8mol，糖精1.25~20mmol，十二烷基硫酸钠0.0375~0.6mmol，h3bo30.15~2.4mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl0.45~7.2mol，h3bo30.15~2.4mol、haucl41.25~20mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为0.3125~5g：0.05~0.8g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，再加入0.2129~3.4064g交联剂，0.0007~0.0116g荧光素及0.0625~1ml三乙胺，超声处理20min，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

本发明3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，应用于电化学传感器，能够快速、高灵敏度检测红霉素，对红霉素标准溶液检测的线性范围是1.0×10^－9~1.0×10^－1mg/l，检测限为4.799×10^－10mg/l（lod,s/n=3）。同时具有制备方法操作简单，所需仪器设备简便等优点。

附图说明：

图1是本发明实施例1的制备过程中，不同修饰电极在含有5mm[fecn)6]^3-/4-+0.1mkcl（ph7.0pbs）溶液中的循环伏安图。

图2是本发明实施例1的3d镍纳米簇修饰电极的表面形貌（a）和3d镍金合金纳米簇修饰电极的表面形貌（b）。

图3是本发明实施例1的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极的选择性。

图4是本发明实施例1的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极对红霉素检测的差分脉冲伏安曲线（a）和工作曲线（b）。

具体实施方式：

实施例1：

本发明的用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，用计时电流法，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d（三维）镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso41mol，nicl20.2mol，糖精5mmol，十二烷基硫酸钠0.15mmol，h3bo30.6mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl1.8mol，h3bo30.6mol、haucl45mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为1.25g：0.2g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，使之充分混合，再加入0.8516gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，0.0029g荧光素及0.25ml三乙胺，超声处理20min，使之全部溶解，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

本发明实施例1的电极制备过程中，不同修饰电极在含有5mm[fecn)6]^3-/4-+0.1mkcl（ph7.0pbs）溶液中的循环伏安图如图1所示。

图1中，曲线1是裸金电极的cv曲线，该曲线在0.2v附近出现一对可逆的[fe(cn)6]^3-/4-探针离子氧化还原峰。曲线2是3d镍金纳米簇修饰电极的cv曲线，峰电流高于曲线1，说明修饰了3d纳米簇后，电极导电性急剧增加。曲线3是上修饰了溴化物的3d纳米金簇修饰电极的cv曲线，峰电流低于曲线2，说明电极表面自组装引发剂后阻碍了探针离子到达电极表面，曲线4是未除去红霉素时修饰电极的cv曲线，峰电流明显高于曲线3，其原因是红霉素在该电位下有电化学响应，探针离子的电子转移受到含有红霉素膜的影响，峰电流升高。曲线5为洗脱模板分子（红霉素）后印迹电极的cv曲线，峰电流明显低于曲线4，由于除去红霉素后，电化学响应进一步减弱，氧化还原峰电流又有相对的减少，同时红霉素被洗脱后形成了印迹孔穴，聚丙烯酰胺膜作为惰性电子和传质阻挡层，阻碍了探针离子向电极表面扩散导电性减弱。

图2是利用扫描电镜看到的本发明实施例1的3d镍纳米簇修饰电极的表面形貌（a）和3d镍金合金纳米簇修饰电极的表面形貌（b）。从图2可以看出3d镍金合金纳米簇呈棒状。

为了证明本发明实施例1的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极的选择性，实验中以氯霉素（cap-chloramphenicol）（mw323.13）、罗红霉素（rox-roxithromycin）（mw837.05）、克拉霉素（cla-clarithromycin）（mw747.96）、四环素（tet-tetracycline）（mw444.43）作为干扰物。采用差分脉冲伏安法利用印迹电极（3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极）和非印迹电极（制备方法与印迹电极相同，只是制备时不加红霉素）测定相同浓度（10^-4mg·l^-1）的不同种抗生素的响应信号的差异，结果如图3所示。从图3可以看出本发明实施例1的工作电极检测红霉素响应信号δi为8.408μa，分别是cap、rox、cla和tet的5.556，5.884，6.9779，5.689倍。结果表明，本发明实施例1的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极对目标红霉素选择性更好。

图4是本发明实施例1的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极对红霉素检测的差分脉冲伏安曲线（a）和工作曲线（b）。其中图4a是3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极检测一系列不同浓度红霉素的差分脉冲伏安曲线。图4a中，曲线1～10对应的红霉素浓度分别为空白，10^－9，10^－8，10^－7，10^－6，10^－5，10^－4，10^－3，10^－2，10^－1mg/l。可以看出，随着红霉素浓度的增加差分脉冲伏安曲线峰电流升高。这是由于结合红霉素后的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，其印迹空穴被红霉素占据，而红霉素在该电位下有电化学响应，从而升高电极的差分脉冲伏安曲线峰电流值。红霉素浓度越高，印迹空穴被占据的越多，峰电流值上升越多。图4b是峰电流值衰减（信号响应，δi）与红霉素浓度对数的关系。从图可以看出该3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极检测红霉素的浓度线性范围为1.0×10^－9~1.0×10^－1mg/l。线性回归方程为δi(μa)=0.35041logc(mg/l)+8.19191，相关系数为0.9906。从标准曲线看出，检测限为（lod,s/n=3）4.799×10^－10mg/l。

实施例2：

本发明的一种用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，

依次按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，用计时电流法，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d（三维）镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso40.5mol，nicl20.1mol，糖精2.5mmol，十二烷基硫酸钠0.075mmol，h3bo30.3mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl0.9mol，h3bo30.3mol、haucl42.5mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为0.625g：0.1g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，使之充分混合，再加入0.4258gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，0.0014g荧光素及0.125ml三乙胺，超声处理20min，使之全部溶解，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

实施例3：

本发明的一种用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，

依次按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，用计时电流法，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d（三维）镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso40.25mol，nicl20.05mol，糖精1.25mmol，十二烷基硫酸钠0.0375mmol，h3bo30.15mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl0.45mol，h3bo30.15mol、haucl41.25mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为0.3125g：0.05g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，使之充分混合，再加入0.2129gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，0.0007g荧光素及0.0625ml三乙胺，超声处理20min，使之全部溶解，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

实施例4：

本发明的一种用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，

依次按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，用计时电流法，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d（三维）镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso42mol，nicl20.4mol，糖精10mmol，十二烷基硫酸钠0.3mmol，h3bo31.2mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl0.45mol，h3bo30.15mol、haucl41.25mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为2.5g：0.4g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，使之充分混合，再加入1.7032gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，0.0058g荧光素及0.5ml三乙胺，超声处理20min，使之全部溶解，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

实施例5：

本发明的一种用于高灵敏度检测红霉素的3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极，

依次按照如下步骤的方法制成：

a.将干净的裸金电极放入溶剂为水的溶液a中，通氮气，用计时电流法，在-0.7v下进行恒电位电沉积1200s，然后将电沉积后的电极置于溶剂为水的溶液b中，用计时电流法，在-0.9v下进行恒电位电沉积300s，得3d（三维）镍金合金纳米簇修饰电极；

所述溶液a每升组分为：niso44mol，nicl20.8mol，糖精20mmol，十二烷基硫酸钠0.6mmol，h3bo32.4mol；

所述溶液b每升组分为：nh4cl7.2mol，h3bo32.4mol、haucl42.0mmol；

b.利用巯基封端的含溴化合物修饰3d镍金合金纳米簇电极，得含溴化合物修饰电极；将丙烯酰胺及红霉素溶于乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的氧气，密封静置过夜，所述丙烯酰胺、红霉素及乙醇用量为5g：0.8g：18.75ml的乙醇中超声震荡5min，通入氮气10分钟，除去反应体系中的所有氧气，密封静置过夜，使之充分混合，再加入3.406gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，0.0116g荧光素及1ml三乙胺，超声处理20min，使之全部溶解，制得分子印迹混合溶液；室温下，将含溴化合物修饰电极插入到分子印迹混合溶液中光照3小时，之后取出用超纯水清洗，浸泡在体积比为9:1的甲醇-乙酸的洗脱液中2h，再用超纯水冲洗，氮气吹干，得到3d镍金合金纳米簇印迹修饰电极。

实施例2~5的实验结果同实施例1。