PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫层析检测
技术领域：
，具体涉及一种pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术：
猪流行性腹泻(ped)是由猪流行性腹泻病毒(pedv)引起的一种烈性猪传染病，是目前全球传播较广的一种猪的传染病，我国将其列为二类动物传染病。猪流行性腹泻在多个国家流行，并有愈演愈烈的趋势，对pedv的快速诊断是防控ped流行的前提和基础，各国都加强了对流行性腹泻的监控。但传统的鉴别诊断方法，如病毒的抗原检测、病毒的免疫电镜观察、病毒的分离与鉴定等，都需要十分烦琐的病料前处理，不但工作量大、耗时长，而且操作复杂、诊断成本高。因此，建立一个操作简单、灵敏度高，特异性强、检测时间短的能够广泛运用的诊断方法显得尤为迫切。技术实现要素：本申请的目的提供一种pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本申请采用了一下技术方案：本申请的一方面公开了一种pedv免疫检测层析试纸条，其包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；层析条上设置有检测线和质控线，检测线上固定有抗pedv包被抗体，质控线上固定有羊抗鼠igg抗体；样品垫上喷涂有量子点标记抗pedv抗体探针。需要说明的是，本申请的关键在于将抗pedv包被抗体固定在检测线上，并在样品垫上喷涂有量子点标记抗pedv抗体探针；使用时，待测样品中如果含有pedv，pedv会与量子点标记抗pedv抗体探针结合，然后层析到检测线时会被抗pedv包被抗体捕获，从而在检测线位置处聚集；而没有结合pedv的量子点标记抗pedv抗体探针则会继续层析到质控线位置处被羊抗鼠igg抗体捕获，在质控线上集聚；质控线和检测线捕获的量子点标记抗pedv抗体探针，在365nm紫外光照射下会发出明亮的荧光条带，通过检测仪分析这些荧光信号即可实现pedv的现场快速检测。可以理解，本申请的关键在于抗pedv包被抗体和量子点标记抗pedv抗体探针的使用，实现了pedv的免疫层析试纸条检测，至于支撑材料、样品垫、层析条等材料可以参考现有的免疫层析试纸，在此不做具体限定；甚至抗体包被方法、抗体与量子点的结合方法、喷涂方法等都可以参考现有技术，在此不做具体限定。还需要说明的是，借助荧光量子点高灵敏的特性，结合抗原抗体特异性结合的特点，本申请的免疫层析抗原检测试纸条具有灵敏度高，特异性好，且检测周期短的优势，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。优选的，量子点标记抗pedv抗体探针由pedv单克隆抗体10a8a与羧基功能化量子点共价连接而成；抗pedv包被抗体为pedv单克隆抗体10f2a；其中，pedv单克隆抗体10a8a、10f2a均为商品化购置针对pedv的n蛋白单克隆抗体。需要说明的是，原则上只要将两个能够匹配的pedv抗体分别作为本申请的pedv荧光量子点免疫层析试纸条的抗pedv包被抗体和量子点标记抗pedv抗体即可实现本申请的免疫层析试纸条；但是，本申请的一种实现方式中，优选的，量子点标记抗pedv抗体探针由pedv单克隆抗体10a8a与羧基功能化量子点共价连接而成；抗pedv包被抗体为pedv单克隆抗体10f2a。pedv单克隆抗体10a8a和pedv单克隆抗体10f2a均为购置的商业化单克隆抗体。优选的，层析条为硝酸纤维素膜。优选的，样品垫为玻璃纤维垫。本申请的另一面公开了本申请的pedv免疫检测层析试纸条在制备pedv检测试剂盒或装置中的应用。本申请的再一面公开了本申请的pedv免疫检测层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：量子点标记抗pedv抗体探针制备，将羧基功能化的量子点与抗pedv抗体共价连接，制成量子点标记抗pedv抗体探针；样品垫制备，将玻璃纤维垫用含d-(+)海藻糖、1％bsa和0.1％tween20的磷酸盐缓冲液浸泡，然后烘箱干燥，将制备的量子点标记抗pedv抗体探针喷涂与干燥的玻璃纤维垫上，即获得样品垫；包被膜制备，将羊抗鼠igg抗体喷涂在层析条的质控线位置，将抗pedv包被抗体喷涂在检测线位置，将喷涂好的层析条烘干，即获得包被膜；免疫层析试纸条组装，将样品垫、层析条即包被膜按顺序搭接在支撑材料上，即获得pedv荧光量子点免疫层析试纸条。优选的，量子点标记抗pedv抗体探针制备中，抗pedv抗体为pedv单克隆抗体10a8a。优选的，免疫层析试纸条组装中，还包括对组装的试纸条进行裁剪。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的pedv免疫检测层析试纸条，利用量子点标记抗pedv抗体探针进行检测，充分结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，使得本申请的免疫层析检测试纸条具有灵敏度高、特异性好，且检测周期短的优势，能够满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。附图说明图1为本申请实施例中pedv免疫检测层析试纸条的检测荧光强度随反应时间的变化曲线图；图2为本申请实施例中pedv免疫检测层析试纸条灵敏度试验结果图；图3为本申请实施例中pedv免疫检测层析试纸条特异性试验结果。具体实施方式实时荧光rt-pcr具有高灵敏度、高特异性、快速的特点，被国内外广泛应运于人医的临床检测和兽医的临床诊断，并且很多病毒的荧光pcr检测方法都被列为了检测标准，在猪流行性腹泻方面也有相关研究，但一直未能获得可以快速、灵敏，满足现场荧光检测的检测猪流行性腹泻病毒的产品。本申请的发明人在长期的科学研究发现，结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，采用羧基功能化量子点与抗pedv抗体通过酰胺键共价结合，获得抗pedv抗体与pedv结合荧光显色的条件，从而获得本申请具有灵敏性高、特异性好、检测周期短的免疫层析抗原检测试纸条，满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、材料和设备(1)细胞及病毒vero-76传代细胞系、猴肾传代细胞系(ma-104)、猪源肾脏细胞(pk-15)、sp2/0-ag14(简称sp2)骨髓瘤细胞，均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室提供核保存。2015-pedv-6、2016-pedv+prova-1、2016-pedv+prova-2、2016-prova-1、2017-pedv+prova+tgev-3、tgev-gd均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室提供核保存。“科泻宁”，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(wh-1株+aj1102株)为武汉科前生物股份有限公司产品；猪病毒性腹泻三联活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)，为哈尔滨维科生物技术开发有限公司产品。(2)主要试剂细胞基础培养基dmem和1640、gibco胎牛血清fbs为thermofisher公司产品；pvdf膜(0.2μm/0.45μm)为milipore公司产品；nabtmspinkitsforantibodypurification；isostripmousemabisotypingkit；iggelutionbuffer；proteina/giggbindingbuffer；gentleag/abelutionbufferph6.6；nabtmspinkitsforantibodypurification；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为sigma公司产品。羧基功能化量子点为清华大学深圳研究生院产品。rehydragel@lv铝佐剂为美国通用公司产品。peg4000(ph8.0)含5％dmso为merek公司产品。(3)抗体针对pedvn蛋白的单克隆抗体10a8a和10f2a，为中山大学产品；山羊抗猪igg，anti-chickenigg(h+l)-peroxidaseantibodyproducedingoat，羊抗鼠anti-mouseigg(wholemolecule)–peroxidaseantibodyproducedingoat均为sigma公司产品。(4)主要溶液的配制细胞完全培养基：dmem或rpmi-1640(1×原液)加入无菌双抗(青霉素100u/m、链霉素0.1mg/ml)和灭活胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，使fbs的终浓度为10％，置4℃冰箱保存、备用。细胞维持培养基：dmem或rpmi-1640(1×原液)加入无菌双抗和灭活胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，使fbs的终浓度为2％，置4℃冰箱保存、备用。其中，无菌双抗为青霉素100u/ml和链霉素0.1mg/ml。1mg/ml100×胰酶贮存液：取0.1g胰酶溶于100mlpbs缓冲液中，完全溶解后，4℃冰箱过夜，用0.2μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存、备用。3.75mg/ml100×猪胰酶(porcinepancreatin)贮存液：取0.375g猪胰酶溶于100mlpbs缓冲液中，完全溶解后，4℃冰箱过夜，用0.2μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存、备用。0.25％胰酶消化液：取0.25g胰酶和0.04g乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)溶于100mlpbs缓冲液中，完全溶解后，4℃冰箱过夜，用0.2μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存、备用。0.01mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)：取nacl8g、kh2po40.2g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.08g，完全溶解在1000ml去离子水中，高压灭菌30min，4℃冰箱保存、备用。不完全dmem培养基，购自热电公司。完全dmem培养基：不完全dmem培养基80ml，胎牛血清15-20ml。用于骨髓瘤细胞sp2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。ht培养基：高糖dmem培养基99ml，ht贮存液1ml。hat培养基：高糖dmem，ht贮存液1ml，a贮存液1ml。氨基喋呤(a)贮存液(100×，4×10-5mol/l)：称取1.76mg氨基喋呤(aminopterinmw440.4)，溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/lnaoh0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶2ml/瓶，-20℃保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(ht)贮存液(100×，h:10-2mol/l，t:1.6×10-3mol/l)：称取136.1mg次黄嘌呤(hypoxanthine，mw136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(thymidine，mw242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶2ml/瓶，-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。l-谷氨酰鞍(l.g.)溶液(100×，0.2mol/l)：称取2.92gl-谷氨酰鞍(l-glutamine，mw146.15)，用100ml不完全培养液或超纯水或四蒸水溶解，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/瓶，-20℃冻存。青、链霉素(双抗)溶液(100×)：取青霉素g(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶4-5ml/瓶，-20℃冻存。7.5％nahco3溶液：称取分析纯nahco37.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/瓶，盖紧瓶塞，4℃保存。hepes溶液(1mol/l)：称取23.83ghepes(n-2-hydroxyethylpiperazine-n，-2-ethanesulfonicacid，n-2-羟乙基哌嗪-n，-2-乙基磺酸，mw238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/瓶，4℃保存。8-氮鸟嘌呤贮存液100×：称取200mg8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine，mw152.1)，加入4mol/lnaoh1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1％浓度加入到培养液中，即终浓度为20μg/ml。50％peg：称取peg1000或400020-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5％nahco3调ph至8.0，或购买sigma或gibco公司现成产品。(5)主要仪器设备co2细胞培养箱为德国wtbbinder公司产品、普通倒置显微镜为日本olympus公司产品、电子透射显微镜为荷兰philips公司产品、台式低温离心机为德国eppendorf公司产品、超低温冰箱为美国formascientific公司产品、电子天平为瑞典mettlertoledo公司产品、ph计为美国thermo公司产品、超净工作台为苏州净化设备有限公司产品、ql-901漩涡混合器为江苏海门麒麟医用仪器厂产品、台式水平离心机为上海安亭科学仪器厂产品、lx-100手掌型离心机为江苏海门麒麟医用仪器厂产品、thz-c恒温振荡器为金坛市富华仪器有限公司产品、微量移液器为德国eppendorf公司产品、酶标仪为美国bio-rad公司产品、xyz3050喷膜系统为美国bio-rad公司产品、cm4000裁切系统为美国bio-rad公司产品、365nm荧光量子点检测仪为清华大学深圳研究生院产品。二、试验方法1.pedv的增殖与粗制纯化待vero-76传代细胞系单层生长到80％～90％时，用无血清、无抗生素的dmem细胞培养液洗2次，vero-76传代细胞接种2015-pedv-6。接种病毒后的细胞37℃吸附1h，其间轻摇2次。吸附结束后，用无血清、无抗生素的dmem培养液洗2次。在vero-76细胞培养瓶中，加入含有终浓度10μg/ml胰酶、37.5μg/ml猪胰酶和含2％胎牛血清的dmem维持液，于37℃、5％co2培养箱中培养，72h作为一个传代周期。在接种两种毒株后每次传代前，将上一次的细胞培养物反复冻融3次，按上述方法进行盲传，显微镜观察细胞病变，同时进行商品化试剂盒pedv实时荧光rt-pcr检测。在接种病毒的vero-76传代细胞传至第3代后的连续传代中，只加入含有终浓度10μg/ml胰酶和含2％胎牛血清的dmem维持液，37℃培养72h作为一个传代周期。所有的细胞培养上清液均取5ml于-80℃冰箱保存、备用。取收获细胞病毒培养液5000ml。将5000mlpedv病毒培养液8000r/min离心30min，去除细胞碎片。再将上清28000r/min超速离心3h，收集管底产物用1000ml0.01mpbs溶解作为抗原。2.pedv现场荧光量子点免疫层析抗原检测试纸条制备(1)pedv量子点标记探针的制备采用edc法共价连接羧基功能化量子点与抗pedv抗体10a8a。首先配制0.1mmes溶液，调ph4.7待用；配制0.05m硼酸溶液，调ph8.5待用；配制0.02mpbs溶液，调ph7.4待用。羧基功能化量子点与抗pedv抗体10a8a通过酰胺键共价结合，具体方法如下：取水溶性羧基量子点用0.1mmes溶液洗涤离心重悬后加入5mmedc和2mmnhs反应30分钟，然后离心洗涤三次，沉淀用0.05m硼酸溶液重悬，得到活化好的羧基功能化水溶性量子点。分别加入0.08mgpedv抗体10a8a到1mg活化量子点中，37℃反应3小时，抗体氨基与量子点羧基共价结合形成稳定的肽键。量子点上剩余的活化位点通过加入5％bsa封闭，37℃反应30分钟。反应完后20,000g离心3次后用0.02mpbs溶液重悬，得到量子点标记抗pedv抗体10a8a探针，4℃保存。(2)基于量子点的pedv免疫层析试纸的制备首先将羊抗鼠igg用pbs缓冲液配制为0.5mg/ml浓度，将抗pedv包被抗体10f2a用pbs缓冲液配制为2mg/ml浓度。然后用xyz3050喷膜系统将羊抗鼠igg喷涂在硝酸纤维素膜质控线位置，将抗pedv包被抗体10f2a喷涂在检测线位置，喷涂好的硝酸纤维素膜放于37℃烘箱干燥4小时，得到包被膜。将玻璃纤维垫用用含d-(+)海藻糖，1％bsa和0.1％tween20的磷酸盐缓冲液浸泡后放于37℃烘箱干燥3小时，得到样品垫。将量子点标记抗pedv抗体10a8a探针用xyz3050喷膜系统按10μl/cm量喷涂在样品垫上端后放于37℃烘箱干燥3小时，进行试剂条的搭配组装，将试纸条组装后用cm4000裁切系统切成3.5mm宽，得到检测pedv量子点免疫层析试纸。(3)样品检测将60μl的样品滴加到上步得到的检测pedv量子点免疫层析试纸的加样端。样品中存在pedv时，pedv与量子点标记抗pedv抗体10a8a结合后，层析到检测线时会被包被的抗pedv抗体10f2a捕获，从而在检测线位置聚集。没被捕获的量子点标记抗pedv抗体10a8a层析到质控线位置时会被包被的羊抗鼠igg捕获，从而在质控线位置聚集。质控线和检测线捕获的量子点在365nm紫外光照射下会发出明亮的红色荧光条带，通过检测仪分析这些荧光信号，就能确定样品中是否含有pedv。检测仪检测到的荧光信号强度与捕获到的量子点量相关。所能检测到的检测线最低荧光信号所对应流感病毒量即为该荧光免疫层析系统的灵敏度。样品检测过程中，检测线具有荧光信号说明待检测的样品具有pedv，荧光信号的强弱反应pedv病毒量，越强，病毒量越多；质控线具有荧光信号说明该试纸条质量合格，检测结果可靠。(4)pedv量子点免疫层析试纸最佳检测时间的确定将2015-pedv-6vero-76细胞培养液原液用0.02mpbs缓冲液10倍稀释，取60μl的样品滴加到pedv量子点免疫层析试纸的加样端，并用检测仪检测，时间从3到50分钟，每分钟检测1次，做2个平行测试并计算平均值。根据检测值绘制时间动力曲线，获得检测值比较稳定时的检测时间。(5)pedv量子点免疫层析试纸的灵敏度测试首先检测50份阴性样品，计算均值及标准偏差，以便确定pedv量子点免疫层析试纸检测的cut-off值。将2015-pedv-6vero-76细胞培养液用0.02mpbs缓冲液10倍比稀释，从10-1连续稀释至10-7，0.02mpbs缓冲液作为阴性对照样品，用pedv量子点免疫层析试纸检测，每个样品平行测试3次，确定pedv量子点免疫层析试纸的灵敏度。(6)pedv量子点免疫层析试纸的特异性测试用所建立pedv量子点免疫层析试纸检测方法，对2016-pedv+prova-1、2016-pedv+prova-2和2017-pedv+prova+tgev-3阳性确诊冻存样品，科泻宁和猪病毒性腹泻三联活疫苗等pedv疫苗，发病猪乳汁等6份经过tgev/pedv/prova三重实时荧光rt-pcr检测结果为强阳性且经普通rt-pcr检测确证为阳性样品，2016-prova-1、tgev-gd、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合病毒、vero-76正常细胞培养上清和pbs等7份其他样品进行检测，每个样品平行测试3次，进一步确定所建立方法的特异性。(7)pedv量子点免疫层析试纸的重复性测试为检测量子点免疫层析试纸的重复性，我们将2015-pedv-6vero-76细胞培养原液，用pedv量子点免疫层析试纸检测，平行测试20次，计算均值以及相对标准偏差rsd。(8)pedv量子点免疫层析试纸的老化实验将制备的pedv量子点荧光免疫层析试纸，放置于37℃恒温干燥箱中，分别于0、7、14、21、28天取出，检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液原液、10-1和10-2，根据检测结果绘制时间动力曲线，以评估pedv量子点荧光免疫层析试纸的保质期。(9)样品检测对自2015年秋冬季开始，连续3年从9个大型猪场采集粪便、小肠和乳汁样品共38份临床样品，连同阳性对照2015-pedv-6、科泻宁、猪病毒性腹泻三联活疫苗和阴性对照vero-76正常细胞培养上清、健康猪各种组织12份进行pedv量子点免疫层析试纸检测，对所建立的方法进行田间小样试验。其中，38份临床样品由深圳出入境动植物检验检疫技术中心采集保存。三、试验结果1.pedv量子点免疫层析试纸最佳检测时间的确定将量子点标记抗体10a8a，与抗体10f2a包被硝酸纤维素膜配对制成免疫层析试纸，通过检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液原液10倍稀释液，时间从3到50min，每分钟检测1次，结果如图1所示，荧光强度随时间的增加而增强，并且在15min时增强幅度减小并趋于稳定。因此，反应15min是比较适合的检测时间。2.量子点免疫层析试纸的灵敏度测试检测50份阴性样品，通过计算平均值以及标准偏差，将pedv量子点免疫层析试纸的荧光信号cut-off值定为102a.u.。当检测线荧光强度值大于等于102a.u.时结果判定为阳性结果，小于102a.u.时结果判定为阴性结果。将2015-pedv-6vero-76细胞培养液用0.02mpbs缓冲液10倍比稀释，从100连续稀释至10-7，0.02mpbs缓冲液作为阴性对照样品。将样品滴加到pedv量子点免疫层析试纸加样端，放置15min后用荧光检测仪检测，每个样品测试3次，计算均值后作浓度曲线图，检测结果如表1所示，检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液最低浓度为10-5时，检测值高于cut-off值102a.u.，因而pedv量子点免疫层析试纸检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液的检测限为10-4，低于pedv-rrt-pcr灵敏度1000倍。表1pedv量子点免疫层析试纸检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液灵敏度结果pedv量子点免疫层析试纸检测不同稀释度的结果见图2。图2中，pbs为阴性对照，10-7为稀释10-7的细胞培养液的检测结果，10-6为稀释10-6的细胞培养液的检测结果，以此类推。图2的结果显示，在阴性对照成立的情况下，于365紫外激发光下，可在10-1～10-42015-pedv-6vero-76细胞培养液10倍系列稀释样品中均有可见两条荧光条带，即c条带和t条带，且荧光强度逐步减弱。在10-5时则只能观察到c对照条带，t条带已经无法检测到。3.量子点免疫层析试纸的特异性测试将6份含pedv的细胞培养液、混合病毒及混合疫苗，连同7份非pedv的猪病原体样本，滴加到pedv量子点荧光免疫层析试纸加样端，反应15min后用荧光检测仪检测。检测结果表明pedv量子点荧光免疫层析试纸能检测出所有含pedv的样本，与非pedv的猪病原体样本没有交叉反应，与细胞培养上清和pbs样品没有反应，结果如图3所示。图3中，编号1-15依序为：1.2016-pedv+prova-1混合毒株检测结果；2.2016-pedv+prova-2混合毒株检测结果；3.2017-pedv+prova+tgev-3混合毒株检测结果；4.科泻宁疫苗检测结果；5.猪病毒性腹泻三联活疫苗检测结果；6.2016-prova-1毒株检测结果；7.tgev-gd毒株检测结果；8.猪细小病毒检测结果；9.伪狂犬病毒检测结果；10.猪繁殖与呼吸综合症病毒检测结果；11.vero-76正常细胞培养上清检测结果；12.pbs检测结果；13.水空白对照；14.阴性加样液空白对照；15.正常细胞培养液。图3的结果显示，含pedv的细胞培养液、混合病毒及混合疫苗都有检出，而7份非pedv的猪病原体样本则检测为阴性，说明本例的pedv量子点免疫层析试纸特异性好。4.pedv量子点免疫层析试纸的重复性测试结果将2015-pedv-6vero-76细胞培养液原液、10-1稀释液和10-2稀释液分别用pedv量子点免疫层析试纸检测，每个样品平行测试20次，计算均值以及相对标准偏差rsd。检测结果见表2，相对标准偏差rsd均小于10％，说明pedv量子点荧光免疫层析试纸具有良好的重复性。表2中100即细胞培养液原液。表22015-pedv-6vero-76细胞培养液原液、10-1和10-2测试20次计算均值及标准偏差细胞培养液荧光强度均值(a.u.)stdevrsd/％n＝2010-2650.542.56.510-12957.8217.87.410013827.8820.75.95量子点免疫层析试纸老化试验结果将制备的pedv量子点荧光免疫层析试纸，放置于37℃恒温干燥箱中，分别于0、7、14、21、28天取出，检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液原液、10-1和10-2，用检测仪检测，检测结果如表3所示，表3中100即细胞培养液原液。表3pedv试纸条老化试验结果表3的结果显示，pedv量子点荧光免疫层析试纸在37℃放置到28天时，检测值变化不大。因而pedv量子点荧光免疫层析试纸在常温保质期可达到一年以上。上述试验结果显示，本实施例试纸条的最佳反应时间为15min；检测2015-pedv-6vero-76细胞培养液的检测限为10-4，低于pedv-rrt-pcr灵敏度1000倍；特异性强；相对标准偏差rsd均小于10％；保质期可达到一年。以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
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的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。当前第1页12