猪瘟病毒E2蛋白灭活疫苗免疫效果评价方法与流程

本发明属于动物疾病防控
技术领域：
，涉及的是一种在猪瘟净化过程中，使用猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗后评判其免疫效果的方法。
背景技术：
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种猪的高度接触性、出血性和致死性传染病，该病传染性强，致死率高，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。中国《猪瘟防治技术规范》、《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》及《国家猪瘟防治指导意见(2017-2020年)》中提出的要求是，到2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围。猪瘟净化的标准是指“连续24个月以上，种猪场、区域内无猪瘟临床病例，猪瘟病毒野毒感染病原学检测阴性”。目前，普通猪场在达到猪瘟净化标准的过程中，首先将其建成为猪瘟稳定控制场，即在猪场内采用猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫6-8个月，当传统猪瘟c株活疫苗免疫产生的e0抗体完全消失后，淘汰场内所有猪瘟野毒感染产生的e0抗体阳性的猪只。显然，使用猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗对猪场内所有猪只进行免疫是建立猪瘟稳定控制场的一项必要的步骤。目前，市场上的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗产品较多，尽管各产品中的猪瘟病毒e2蛋白含量符合官方标准，但由于存在生产工艺的差异，各疫苗中抗原蛋白空间构象不尽相同，疫苗在猪只体内达到的免疫效果有明显差异，进而在临床上对猪瘟净化工作影响很大。因此，选择哪一种或哪几种猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗产品用于临床的猪瘟净化，是猪瘟净化的必要工作，而进行这项工作首先要完成对不同疫苗产品免疫效果的评价，但是截至目前，该
技术领域：
中还没有一个系统、严格且为准确的关于猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果的血清学评价方法。技术实现要素：本发明的目的在于提出一种猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果的评价方法，以促进猪瘟净化的实施和完成。实现上述目的的技术方案是：一种猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价方法，第一步是建立一个猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价的基准曲线，所述基准曲线的建立是按下述步骤依次完成：(1.1)在猪瘟净化达标的猪场或spf无特定病原猪场内，对商品猪用标准的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫后，按0、14、28、56、84、112、140、168、196日进行血样采集，每个采样日的血样为3-5份，血清分离后冷冻保存，(1.2)解冻血清，检测所有血清的e0抗体，剔除e0抗体为阳性的血清，(1.3)检测剩余血清样品的e2抗体，计算出每个采样日多份血清样品中e2抗体效价的平均值h，(1.4)计算出相邻两个采样日h值两点连线下的面积——sn，计算公式为：sn＝(hn+hn-1)×l/2，式中：n为采样日，n-1为上一个采样日，hn为某个采样日e2抗体效价的平均值，hn-1为上一个采样日e2抗体效价的平均值，l为相邻两个采样日之间的间隔天数，(1.5)依据步骤(4)计算的sn，计算出对应于各采样日猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积mn，计算式为mn＝sn+sn-1+sn-2+…，式中：sn-1为上一个采样日的e2抗体效价的平均值与它前一个采样日的e2抗体效价的平均值两点连线下的面积，sn-2为n-2采样日的e2抗体效价的平均值与它前一个采样日的e2抗体效价的平均值两点连线下的面积，(1.6)以n为横坐标，mn为纵坐标，做猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积--时间图，即生成基准曲线；第二步是在上述步骤(1.1)所述的猪场内做一个猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价的参比曲线，所述参比曲线的完成步骤是：(2.1)对商品猪用待评估的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫后，按0、14、28、56、84、112、140、168、196日进行血样采集，每个采样日的血样为3-5份，血清分离后冷冻保存，(2.2)与上述步骤(1.2)相同，(2.3)与上述步骤(1.3)相同，(2.4)与上述步骤(1.4)相同，(2.5)与上述步骤(1.5)相同，(2.6)以n为横坐标，mn为纵坐标，做猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积--时间图，即生成参比曲线；第三步是将参比曲线与基准曲线放在同一坐标系内进行比较和评价，首先是做几何学初步评价：先看参比曲线与基准曲线的重合度，再看参比曲线是在基准曲线的左上侧还是右下侧，最后看参比曲线中免疫112天后的线段是否有相对于基准曲线向下偏离的形态，若重合度严重不好的，可以初步评价为该疫苗不合格，然后做进一步统计学评价：对于与基准曲线的重合度较好的参比曲线，即处于基准曲线的左上侧，或虽处于基准曲线右下侧却十分接近基准曲线，而且参比曲线中免疫112天后的线段相对于基准曲线没有明显向下偏离的参比曲线，将参比曲线112天后的mn数据与基准曲线上对应的mn数据进行两者的统计学方差分析，若差异不显著，即p≥0.05的，可评价且判定为该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果达标，进而即可确定使用在该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗合格；如果差异较大，即p≤0.05的，可评价且判定为该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果不达标，进而即可确定使用在该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗不合格。本发明是一种严格的血清学评价方法，具有特别高的准确性，通过猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价，在各猪场的生物安全管理水平及猪场猪群免疫系统功能一致的状况下，可以准确的评价和判定某种猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗产品的优劣，从而为该种疫苗的选择提供了准确且可靠的方法，进而可促进猪瘟净化的实施和完成。附图说明图1是按照本发明，在一个猪瘟净化达标猪场w内对商品猪用标准的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫后建立的疫苗免疫效果评价基准曲线q。图2是按照本发明，在猪场w内使用待评估的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b的免疫效果评价参比曲线p1。图3是按照本发明，在猪场w内使用待评估的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗c的免疫效果评价参比曲线p2。图4是参比曲线p1与基准曲线q在同一坐标系的比较图。图5是参比曲线p2与基准曲线q在同一坐标系的比较图。图中：n--采样日，mn--猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积，a--mn值，b--mn值的对应坐标，c--指标曲线，r2--曲线与坐标拟合度，q--基准曲线，p1--参比曲线，p2--参比曲线。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明。实施例1一种猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价方法，如下所述：第一步，选定一个猪瘟净化达标的猪场w或spf无特定病原猪场，在该猪场内建立一个猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价的基准曲线q，基准曲线q的建立是按下述步骤依次完成，(1.1)对商品猪，用标准的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫后，按0、14、28、56、84、112、140、168、196日进行血样采集，每个采样日的血样为3-5份，血清分离后冷冻保存，(1.2)解冻血清，检测所有血清的e0抗体，剔除e0抗体为阳性的血清，(1.3)检测剩余血清样品的e2抗体，计算出每个采样日多份血清样品中e2抗体效价的平均值h，见表一表一猪瘟净化达标场内猪瘟e2免疫抗体效价均值(1.4)将表一中各数据代入计算公式sn＝(hn+hn-1)×l/2，计算出相邻两个采样日h值两点连线下的面积——sn，式中：n为采样日，n-1为上一个采样日，hn为某个采样日e2抗体效价的平均值，hn-1为上一个采样日e2抗体效价的平均值，l为相邻两个采样日之间的间隔天数，例如，采样日n为14，hn为h14＝4，hn-1＝h0＝3.2，l＝14-0＝14，则s14＝(h14+h0)×l/2＝(4+3.2)×14÷2＝50.4；采样日为28，hn为h28＝6.0，hn-1＝h14＝4.0，l＝28-14＝14，则s28＝(h28+h14)×l/2＝(6.0+4.0)×14÷2＝70；采样日为112，hn为h112＝12.0，hn-1＝h84＝11.2，l＝112-84＝28，则s112＝(h112+h84)×l/2＝(12.0+11.2)×28÷2＝324.8；将表一中其余各数据带入上述公式计算，即可得到如下表二所列数据，表二猪瘟净化达标场内猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下面积sn采样日nhsn03.20(s0)14450.4(s14)28670(s28)567.5189(s56)8411.2261.8(s84)11212324.8(s112)14011.5329(s140)1689.6295.4(s168)1968.2249.2(s196)(1.5)将表二中的各个sn数据带入计算式mn＝sn+sn-1+sn-2+…中，计算出对应于各采样日猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积mn，式中：sn-1为上一个采样日的e2抗体效价的平均值与它前一个采样日的e2抗体效价的平均值两点连线下的面积，sn-2为n-2采样日的e2抗体效价的平均值与它前一个采样日的e2抗体效价的平均值两点连线下的面积，例如，采样日n为14，sn为s14，sn-1为s0，则mn＝m14＝s14+s0＝50.4+0＝50.4；采样日n为28，sn为s28，sn-1为s14，则mn＝m28＝s28+s14＝70+50.4＝120.4；采样日n为56，sn为s56，sn-1为s28，sn-2为s14，则mn＝m56＝s56+s28+s14＝s56+m28＝189+120.4＝309.4；将表二中其余各数据带入上述计算式，即可得到如下表三所列数据，表三猪瘟净化达标场内猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下累加面积mn采样日nhsnmn03.20(s0)0(m0)14450.4(s14)50.4(m14)28670(s28)120.4(m28)567.5189(s56)309.4(m56)8411.2261.8(s84)571.2(m84)11212324.8(s112)896(m112)14011.5329(s140)1225(m140)1689.6295.4(s168)1520.4(m168)1968.2249.2(5196)1769.6(m198)(1.6)以采样日n为横坐标，猪瘟e2抗体效价-时间曲线下面积累加值mn为纵坐标，做猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积--时间图，即生成图1所示的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果的血清学评价基准曲线q。该基准曲线采用excel制表软件拟合多项式为：y＝0.012x2+7.3797x--93.095其中：x为采样日距e2疫苗免疫日的间隔天数，y为采样日的e2疫苗免疫抗体效价--时间曲线下面积累加值，r2为多项式与散点图拟合度，取值范围0≤r≤1，r＝1时为完全重合。第二步，在猪场w内，建立一个猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价的参比曲线p1，比曲线p1的建立是按下述步骤依次完成，(2.1)对商品猪，以待评估的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b免疫的0、14、28、56、84、112、140、168、196日进行血样采集，每个采样日的血样为3-5份，血清分离后冷冻保存，(2.2)与第一步中的步骤(1.2)相同，(2.3)与第一步中的步骤(1.3)相同，计算出的每个采样日多份血清样品中e2抗体效价的平均值h，见表四，表四待评估猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b的免疫抗体效价均值(2.4)将表四中各数据代入计算公式sn＝(hn+hn-1)×l/2，计算出免疫后各采样日的e2抗体效价的平均值与它前一个采样日的e2抗体效价的平均值两点连线下的面积——sn，例如，采样日n为14，hn为h14＝3.8，hn-1＝h0＝3.3，l＝14-0＝14，则s14＝(h14+h0)×l/2＝(3.8+3.3)×14÷2＝49.7；采样日为28，hn为h28＝4.4，hn-1＝h14＝3.8，l＝28-14＝14，则s28＝(h28+h14)×l/2＝(4.4+3.8)×14÷2＝57.4；采样日为112，hn为h112＝8.1，hn-1＝h84＝7.3，l＝112-84＝28，则s112＝(h112+h84)×l/2＝(8.1+7.3)×28÷2＝215.6；将表四中其余各数据带入上述公式计算，即可得到如下表五所列数据，表五待评估e2疫苗b在猪瘟净化场内的猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下面积sn采样日nhsn03.30(s0)143.849.7(s14)284.457.4(s28)566.1147(s56)847.3187.6(s84)1128.1245.6(s112)1406.3201.6(s140)1684.3148.4(s168)1963.2105(s196)(2.5)将表五中的各个sn数据带入计算式mn＝sn+sn-1+sn-2+…中，计算出对应于各采样日猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积mn，例如，采样日n为14，sn为s14，sn-1为s0，则mn＝m14＝s14+s0＝49.7+0＝49.7；采样日n为28，sn为s28，sn-1为s14，则mn＝m28＝s28+s14＝57.4+49.7＝107.1；采样日n为56，sn为s56，sn-1为s28，sn-2为s14，则mn＝m56＝s56+s28+s14＝s56+m28＝147+107.1＝254.1；将表五中其余各数据带入上述计算式，即可得到下列表六所列数据，表六待评估e2疫苗b在猪瘟净化场内猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下累加面积mn采样日nhsnmn03.30(s0)0(m0)143.849.7(s14)49.7(m14)284.457.4(s28)107.1(m28)566.1147(s56)254.1(m56)847.3187.6(s84)441.7(m84)1128.1245.6(s112)657.3(m112)1406.3201.6(s140)858.9(m140)1684.3148.4(s168)1007.3(m168)1963.2105(s196)1112.3(m196)(2.6)以采样日n为横坐标，猪瘟e2抗体效价-时间曲线下面积累加值mn为纵坐标，做猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积--时间图，即生成图2所示的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b的免疫效果评价参比曲线p1。第三步，将参比曲线p1与基准曲线q放在同一坐标系内，如图4所示，先做几何学初步评价，然后做统计学评价，几何学初步评价方法是：先看参比曲线与基准曲线的重合度，再看参比曲线是在基准曲线的左上侧还是右下侧，最后看参比曲线中免疫112天后的线段是否有相对于基准曲线向下偏离的形态，若重合度严重不好的，可以初步评价为该疫苗不合格；统计学评价方法是：对于与基准曲线的重合度较好的参比曲线，即处于基准曲线的左上侧，或虽处于基准曲线右下侧却十分接近基准曲线，而且参比曲线中免疫112天后的线段相对于基准曲线没有明显向下偏离的参比曲线，将参比曲线112天后的mn数据与基准曲线上对应的mn数据进行两者的统计学方差分析，若差异不显著，即p≥0.05的，可评价且判定为该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果达标，进而即可确定使用在该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗合格；如果差异较大，即p≤0.05的，可评价且判定为该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果不达标，进而即可确定使用在该猪场的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗不合格。从图4中可以看出，1、参比曲线p1处于基准曲线q的右下侧，2、参比曲线p1距离基准曲线q较远，属于重合度严重不好的类型，3、在免疫112天后呈现明显向下偏离标准基线的形态。因此可以初步评价为猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b不合格。再做进一步统计学评价的情况是：疫苗b与标准疫苗免疫112日后指标数据经方差分析为t＝2.9482、p≤0.05，差异显著，可进一步评价且断定为：猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b为不合格。实施例2本实施例中的第一步与实施例1所述的第一步相同。第二步，在猪场w内，建立一个猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫效果评价的参比曲线p2，参比曲线p2的建立步骤与与实施例1所述的(2.1)至(2.6)基本相同，有所不同的是：1、待评估的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗是疫苗c；2、在步骤(2.3)中计算出的每个采样日多份血清样品中e2抗体效价的平均值h为下列表七中所列数值；3、在步骤(2.4)中计算出的sn为下列表八中所列数值；4、在步骤(2.5)中计算出的mn为下列表九中所列数值；表七待评估猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗b的免疫抗体效价均值采样日待评估e2疫苗c的抗体效价均值h03.1(h0)143.9(h14)285.7(h28)567.1(h56)8410.6(h84)11211.6(h112)14011.2(h140)1689.4(h168)1967.8(h196)表八待评估e2疫苗c在猪瘟净化场内的猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下面积sn采样日nhsn03.10(s0)143.949.0(s14)285.767.2(s28)567.1179.2(s56)8410.6247.8(s84)11211.6310.8(s112)14011.2319.2(s140)1689.4288.4(s168)1967.8240.8(s196)表九待评估e2疫苗c在猪瘟净化场内猪瘟e2免疫抗体效价-时间曲线下累加面积mn采样日nhsnmn03.10(s0)0(m0)143.949.0(s14)49.7(m14)285.767.2(s28)116.9(m28)567.1179.2(s56)296.1(m56)8410.6247.8(s84)543.9(m84)11211.6310.8(s112)854.7(m112)14011.2319.2(s140)1173.9(m140)1689.4288.4(s168)1462.3(m168)1967.8240.8(s196)1703.1(m196)(2.6)以采样日n为横坐标，猪瘟e2抗体效价-时间曲线下面积累加值mn为纵坐标，做猪瘟e2抗体效价--时间曲线下累加面积--时间图，即生成图3所示的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗c的免疫效果评价参比曲线p2。第三步，将参比曲线p2与基准曲线q放在同一坐标系内，如图5所示，先做几何学初步评价，然后做统计学评价，评价方法与实施例1所述方法相同。从图5中可以看出，1、参比曲线与p2与基准曲线q呈现近似重合状态，2、参比曲线虽处于基准曲线q的右下侧，但却十分接近基准曲线的位置，3、在免疫112天后没有向下偏离基准曲线q的形态。因此可以初步评价为疫苗c合格。再做进一步统计学评价的情况是：疫苗c与标准疫苗免疫112日后指标数据经方差分析t＝0.2668、p≥0.05，差异小，可进一步评价且断定为：猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗c合格。按照本发明方法，可以对疫苗d、疫苗e、疫苗f.....等多种待销售的和上市的猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗的免疫效果做出准确的评价。本发明还有以下特点：1、由于以采样日为横坐标，猪瘟e2抗体效价-时间曲线下累加面积为纵坐标的猪瘟e2抗体效价-时间曲线下面积-时间图，将生物制品免疫效价水平和效价持续时间相结合，组成了效价-时间复合指标，弥补了猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗单纯抗原含量测定评价方法的不足，并将免疫效价高低评价一维体系推进到二维空间，因此提高了免疫评价结果的准确性；2、建立的指标曲线，即基准曲线和参比曲线清楚地表现了不同疫苗产品在免疫效果上的差异，为用户选用猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗开展猪瘟免疫净化提供了直观的对比依据；3、对于使用同一批次猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗免疫的不同猪场，基于本发明建立的指标曲线真实的反映了相应猪场在这一指标上的差异，还可用以评估各猪场生物安全管理水平及猪场猪群免疫系统功能受外界综合免疫抑制因素如免疫抑制病、霉菌毒素等影响的程度。4、本发明推广使用后可以为基于猪瘟病毒e2蛋白灭活疫苗及其配套技术达到的猪瘟稳定控制猪场是否达到猪瘟净化标准的问题的自动化判断奠定了必要技术理论及物质基础。同时降低猪瘟稳定控制场发病的风险，对国家提出猪瘟净化目标的早日实现具有十分重要的现实意义。当前第1页12