一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种纳米复合材料的制备方法，具体说来是一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

对饮用水和食品中细菌的检测，特别是致病性细菌的检测，对于控制传染病、保护环境卫生和人民群众身体健康都有着重要的意义。在水和食品中传播的各种致病性细菌中，大肠杆菌是最为普遍的一种。它是人及各种动物肠道中的常居菌，常随粪便从人及动物体内排出，广泛散播于自然界。人体感染了部分大肠杆菌可引起腹膜炎、出血性肠炎、胆囊炎、阑尾炎和尿道炎等疾病，严重者甚至死亡。大肠杆菌的传统检测方法包括多管发酵法和滤膜法等，存在操作繁琐、检测时间长（一般需要1~2天才能得到结果）等缺点，难以满足污染源快速诊断的需要。近年来，许多基于不同检测原理的方法已得到长足的发展，比如聚合酶链反应、免疫学检测、质谱测定、光学测定等等。与传统方法相比，这些方法具有一定的优势，但所需的检测时间仍然较长。

电化学/生物传感器由于其独特的优势，如能在浑浊溶液中操作、选择性好、灵敏度高等，在各类传感器中占着重要的地位。其所测的信号通常是电位、电流、电阻等的变化，可以直接测量，便于仪器自动化、小型化和智能化。近年来，应用各种电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的方法纷纷发展起来。但常用的大肠杆菌电化学生物传感器主要包括阻抗型和安培型两种。由于电化学阻抗不能直观的给出电化学信号，需要对阻抗谱进行等效电路的模拟才能给出电化学反应电阻值，因而在实际使用的过程中，需要对数据进行较为复杂的过程，而安培型大肠杆菌电化学生物传感器可以有效克服这一缺点，直接可以从曲线上读出电流值，无需复杂的数据处理过程，表现出极大的优越性。安培型大肠杆菌生物传感器，其检测抗体通常需要和过氧化物酶结合在一起，利用过氧化物酶催化双氧水来产生电化学信号，所需的试剂多，而且过程复杂，因此急需开发新型的安培型大肠杆菌生物传感器的检测方法。本发明采用导电高分子聚合对二茂铁进行包覆，然后吸附金纳米粒子，再吸附检测抗体，实现对大肠杆菌的检测，方法简单，应用效果好。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提出一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料及其制备方法和应用，采用聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料来固定检测抗体，实现对于大肠杆菌的检测。

为达到上述目的，本发明采用原位化学聚合法制备了聚吡咯包覆的二茂铁复合材料，由于聚吡咯@二茂铁复合材料表面带正电荷，可以和带负电荷的金纳米粒子发生静电相互作用，从而使得金纳米粒子很好地分散在聚吡咯@二茂铁表面，金纳米粒子具有良好的生物相容性和优异的生物分子亲和力，利用金纳米粒子吸附检测抗体，可以有效保持抗体的活性，提高生物监测的稳定性。对于安培型的三明治式免疫生物传感器来讲，过氧化物酶通常要和检测抗体结合在一起，用于产生电流信号，需要繁琐的生物分子交联过程，本发明采用二茂铁来产生电化学信号，吸附的二茂铁分子越多，在电极上产生的电流信号就越大，可以利用大肠杆菌的浓度和产生的电流信号对应关系，得到工作曲线。本发明无需考虑酶分子的活性和稳定性，降低了成本，简化了检测过程。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料，采用聚吡咯包覆二茂铁，同时吸附金纳米粒子，来固定大肠杆菌k12检测抗体，利用该复合材料产生的电化学信号实现对大肠杆菌的检测，所述采用原位聚合的方法将二茂铁包覆在聚吡咯纳米球内，然后采用静电吸附的方法在聚吡咯-二茂铁复合材料的表面吸附金纳米粒子。

一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1）聚吡咯@二茂铁复合材料的制备，以盐酸、吡咯、十二烷基磺酸钠和水的质量比为0.1:1-3：0.01-0.05:100，将盐酸、吡咯、十二烷基磺酸钠溶解到水溶液中，搅拌，记为溶液m，以二茂铁和乙醇的质量比为1:10-20，将二茂铁溶解到乙醇溶液中，记为溶液n，将过硫酸铵加入到水溶液中，过硫酸铵和水的质量比为1:3-5，记为溶液o，

首先将溶液n缓慢地向溶液m中滴加，并用磁力搅拌器对进行搅拌，得到mn混合溶液，

然后，将溶液o滴加到mn混合溶液中，并用磁力搅拌器对进行搅拌，

最后，滴加完成后，再让溶液反应2-4小时，过滤、洗涤、干燥，得到本发明的聚吡咯@二茂铁复合材料的制备，将盐酸、吡咯、十二烷基磺酸钠溶解到水溶液中，搅拌，记复合材料；

步骤2）金纳米粒子溶液的制备，以氯金酸、柠檬酸三钠、nabh4和水的质量比为0.1-0.3:1:0.1:100，将氯金酸加入水中，搅拌，然后加入柠檬酸三钠，再加入nabh4还原，得到金纳米粒子溶液；

步骤3）聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的制备，将步骤1）所制备的聚吡咯@二茂铁复合材料的制备，将盐酸、吡咯、十二烷基磺酸钠溶解到水溶液中，搅拌，记复合材料加入到步骤2）所制备的金纳米粒子溶液中，搅拌，然后过滤、洗涤、干燥，得到聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料。

一种聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的应用，用于安培型大肠杆菌生物传感器修饰电极的应用，检测大肠杆菌的线性范围为1×10¹~1×10⁷cfu/ml，最低检出限为10cfu/ml。

本发明的基于聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的安培型电化学大肠杆菌生物传感器对于现有技术，具有以下优点：

1．采用聚吡咯对二茂铁进行包覆，可以有效提高二茂铁在电极上的氧化还原行为，聚吡咯具有良好的导电性，可以促进二茂铁的电子转换。

2.采用静电吸附法在聚吡咯表面吸附金纳米粒子，有效提高了金纳米粒子的分散性，克服了金纳米粒子易团聚的问题，方法简单；

3．聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子具有良好的导电性、高的比表面积和良好的生物相容性，可以有效提高抗体分子在电极上的负载量，并保持良好的活性；

4.高分散的金纳米粒子对生物分子有良好的亲和力，可以直接对抗体分子进行吸附，无需交联剂的参与。

5．本发明的聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的制备方法工艺简单，产品性能稳定，适合大批量的制备，而且后处理工艺简单。

因此，本发明在生物传感器领域具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为本发明实施例制备聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的透射电镜图；

图2为本发明实施例制备的聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料修饰电极检测大肠杆菌k12的工作曲线。

具体实施方式

本发明通过实施例，结合说明书附图对本发明内容作进一步详细说明，但不是对本发明的限定。

实施例

一种基于聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的安培型电化学大肠杆菌生物传感器及其制备方法：

步骤1）聚吡咯@二茂铁复合材料的制备，将0.1ghcl，0.01g十二烷基磺酸钠和1g吡咯溶液加入到100ml水溶液中，搅拌1h，记为溶液m，将0.5g二茂铁溶于10ml乙醇溶液中记为溶液n，将2g过硫酸铵溶解到10ml水溶液中，记为溶液o，

首先，将溶液n缓慢地向溶液m中滴加，并用磁力搅拌器对进行搅拌，得到mn混合液，

然后，将溶液o缓慢地向mn混合溶液中滴加，并用磁力搅拌器对进行搅拌，

最后，滴加完成后，再让溶液反应2小时，过滤、洗涤、干燥，得到本发明的聚吡咯-二茂铁纳米复合材料；

步骤2）金纳米粒子溶液的制备，将0.1g氯金酸加入100ml水中，搅拌，然加入0.5g柠檬酸三钠，再加入0.1gnabh4还原，得到所需要的金纳米粒子溶液；

步骤3）聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的制备，将步骤1）所制备的聚吡咯@二茂铁复合材料的制备，将盐酸、吡咯、十二烷基磺酸钠溶解到水溶液中，搅拌，记复合材料加入到步骤2）所制备的金纳米粒子溶液中，搅拌，然后过滤、洗涤、干燥，得到聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料。

聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料制备成安培型大肠杆菌生物传感器的方法和测试如下：

（1）取聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料0.1g分散到0.1mg/ml的大肠杆菌k12检测抗体溶液中，让检测抗体吸附在聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料上；

（2）将金电极打磨光亮，将金电极浸在0.01m的1-硫辛酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶液中1h，然后浸在大肠杆菌k12捕捉抗体中2h；

（3）配制浓度为1×10¹，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷cfu/ml的大肠杆菌k12溶液，将（2）制备的大肠杆菌生物工作电极浸在上述溶液中1h，然后以铂电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在pbs溶液中，测试工作电极的dpv曲线，以峰电流对大肠杆菌的浓度作图，得到该生物传感器的工作曲线。

聚吡咯@二茂铁的透射电镜图如图1a所示，可以看出其为球状纳米颗粒，聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的透射电镜如图1b所示，可以看出所得的金纳米粒子很好地分散在聚吡咯基体上。

聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料修饰电极对大肠杆菌检测的dpv曲线，如图2所示，可以看出大肠杆菌浓度的增加，电极的峰电流增大。

图2b为本发明实施例制备的聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料修饰电极检测大肠杆菌的工作曲线。在浓度范围为1×10¹～1×10⁷cfu/ml时，表现出良好的线性关系，最低检出限位1×10¹cfu/ml。发明构建的一种基于聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子复合材料的安培型电化学大肠杆菌生物传感器，利用聚吡咯@二茂铁/金纳米粒子对抗体亲和力强的特点，有效地对电化学检测信号增强，对大肠杆菌进行了快速、灵敏的检测，具有广泛的应用前景。