一种用于检测三氯乙酸或亚硝酸钠的纳米电化学酶传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米材料、电化学检测与生物传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测三氯乙酸或亚硝酸钠的纳米电化学酶传感器及其制备方法和应用。

背景技术

电化学生物传感器是指用固定化的生物材料作为敏感元件的传感器。其工作原理是由生物体成分（酶、抗原、抗体等）或生物体本身（细胞、组织、细胞器等）作为敏感元件，电极（固体电极、离子选择性电极、气敏电极等）作为转换元件，以电位、电流或电导作为特征检测信号的传感器。电化学生物传感器在生物传感器中占有重要的比重，近年来其研究工作取得了快速的进步。

有机-金属骨架化合物(metal-organicframeworks,mofs)是由无机阳离子和无机阴离子或有机阴离子组成的一种配位聚合物。镁金属-有机骨架材料(mg-mofs-74)是由mg(ⅱ)离子与配体2,5-二羟基对苯二甲酸组装构成，具有二维六方孔道，且表现出良好的吸附能力、较大的比表面积、较多的催化位点以及很高的机械强度等优点。但是mofs材料的导电性有限，限制其在电化学中的应用，所以本发明引入了高导电性的纳米金颗粒，所形成的复合材料有效地克服了mofs材料的这一缺点。

纳米金颗粒(aunps)是一种常用的金属纳米材料，可以制备成不同的形貌与尺寸，具有高电子密度、介电特性和良好的催化作用等优点，因其大的比表面积和优异的导电效率，已被广泛应用于化学修饰电极的制备。本发明采用电沉积的方法将aunps修饰在电极界面上，有效提高传感界面的电化学性能。

三氯乙酸(tca)又名三氯醋酸，是一种易潮解，易溶于水和乙醇的有刺激性气味的液体。它属于致癌物，不仅会对环境造成影响，还会导致动物及培养细胞低甲基化表现，这种低甲基化可能通过多种途径实现，其中很有可能的一条途径就是通过降低dna甲基化转移酶(dnmts)表达水平来实现。

亚硝酸钠(nano2)为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水，是一种常见的无机盐类。硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于人类环境中，是自然界中最普遍的含氮化合物。其外观及滋味都与食盐相似，在工业、建筑业中广为使用，肉类制品中也允许作为发色剂限量使用，但是由于亚硝酸盐属于致癌物，其引起食物中毒的几率较高，所以实现对nano2的高灵敏检测显得尤为重要。

综上，研发一种新型纳米电化学酶传感器，对tca和nano2这两种物质均能快速且准确检测显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足引入新型的纳米材料，发挥其协同作用，提供一种具有高灵敏度检测tca或nano2这两种目标物质且稳定性高和检测范围宽的电化学酶传感器，并相应提供一种基于纳米材料的电化学酶传感器的制备方法。在此基础上，还提供一种上述电化学酶传感器的应用，该应用能够以低的检测限及较宽的线性范围实现对tca及其样品的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种纳米电化学酶传感器，包括在三电极体系中用作基底电极的碳离子液体电极(cile)，所述cile表面修饰有包括mg-mofs-74、aunps和肌红蛋白(mb)组成的复合膜，所述复合膜表面再覆盖一层nafion膜。进一步优选的，所述mg-mofs-74、aunps和mb从内至外依次排列于所述cile表面形成复合膜。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的纳米电化学酶传感器的具体制备方法，包括以下步骤：

s1、修饰mg-mofs-74：在cile表面滴加6μl0.3mg/mlmg-mofs-74悬浮液，静置晾干后得到mg-mofs-74修饰的cile；

s2、电沉积aunps：在所述步骤s1得到的mg-mofs-74/cile表面电沉积aunps，静置晾干后得到aunps/mg-mofs-74/cile；

s3、修饰mb：在所述步骤s2得到的aunps/mg-mofs-74/cile表面滴涂8μl15mg/mlmb，静置晾干后得到mb/aunps/mg-mofs-74/cile；

s4、覆盖nafion膜：在所述步骤s3得到的mb/aunps/mg-mofs-74/cile表面滴涂6μlwt0.5%nafion乙醇溶液，使所述电极材料能够稳定固化在电极表面，完成纳米电化学酶传感器的制备，即nafion/mb/aunps/mg-mofs-74/cile。

上述的制备方法，优选的，所述步骤s2中，采用恒电位沉积法将所述aunps沉积在所述mg-mofs-74/cile表面，所述恒电位沉积法的沉积电位为-0.3v，沉积时间为100s~300s。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了采用所述制备方法制得的纳米电化学酶传感器在检测tca或nano2的应用。

上述的应用，优选的，所述检测tca或nano2的应用方法步骤为：以经过所述步骤s4制备修饰电极为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝为辅助电极，以pbs缓冲溶液（磷酸盐缓冲溶液）为支持电解质，建立三电极系统，记录循环伏安曲线，根据tca或nano2浓度与还原峰电流之间的关系构建线性回归方程，根据线性回归方程计算样品中tca或nano2的浓度。

上述的应用，优选的，所述检测tca或nano2的步骤中，所述pbs缓冲溶液ph为2.0~8.0，进一步优选的缓冲溶液ph为2.0。

上述的应用，优选的，所述tca浓度与还原峰电流变化关系的线性回归方程为ip(μa)=3.399c(mmol/l)+147.8，式中的相关系数为g=0.999，tca检测线性范围为4.0~200.0mmol/l，检测限为1.33mmol/l；所述nano2浓度与还原峰电流变化关系的线性回归方程为ip(μa)=115.7c(mmol/l)+5.371，式中的相关系数为g=0.999，nano2检测线性范围为0.8~18.0mmol/l，检测限为0.27mmol/l。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明提供的用于检测tca或nano2的纳米电化学酶传感器，是在cile表面修饰有mg-mofs-74、aunps和mb组成的复合膜，复合膜表面覆盖一层nafion膜。如果待测样品中存在tca，则电极表面的mb会参与催化反应，电催化反应过程为：

mbfe(ⅲ)+h⁺+e→mbfe(ⅱ)(1)

cl3ccooh→cl3ccoo^-+h⁺pka=0.98(2)

2mbfe(ⅱ)+cl3ccooh+h⁺→2mbfe(ⅲ)+cl2ccooh+cl^-(3)

2、本发明提供的用于检测tca或nano2的纳米电化学酶传感器，具有较宽的检测范围和较低的检测限。这得益于mg-mofs-74、aunps和mb的协同放大作用，工作电极表现出优良的电子传输能力，很大程度上提高了电化学酶传感器的灵敏度。

3、本发明提供的用于检测tca或nano2的电化学酶传感器，具有稳定性高和使用寿命长等优点。这得益于mg-mofs-74是一种多孔材料，其具有稳定的空间构型和较大的比表面积，固定在cile表面后可以使aunps均匀沉积在mg-mofs-74立体结构表面；电沉积在多孔的mg-mofs-74孔道以及电极表面的aunps为mb的电子转移提供良好的导电平台，最后利用nafion膜固化复合材料，使电极更加的稳定并有利于电荷传输，从而提高该传感器的稳定性和使用寿命。

4、本发明提供的用于检测tca和nano2的纳米电化学酶传感器的制备方法，该方法具有制备工艺简单、成本低廉，操作便捷、无污染且应用范围广等优点，可以实现对tca和nano2的特异性检测。

5、本发明提供的纳米电化学酶传感器可用于检测tca和nano2两种目标物质，应用范围涉及药物和水体等具体样品，提高了生物传感器的利用领域；在检测tca和nano2时具有较宽的检测范围和较低的检测极限。

附图说明

图1为nafion/mb/aunps/mg-mofs-74/cile在tca存在下的循环伏安曲线(a~m依次为4,10,20,30,40,50,60,80,100,120,150,170,200mmol/l)

图2为nafion/mb/aunps/mg-mofs-74/cile在不同浓度nano2存在下的循环伏安图(a~l依次为0.8,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.5,10.0,16.0,18.0mmol/l)

图3为不同修饰电极在ph2.0的pbs缓冲溶液中，扫速为100mv/s时的循环伏安曲线，其中曲线d为实施例2s5的nafion/mb/aunps/mg-mofs-74/cile的循环伏安曲线，曲线c为实施例2s3的nafion/aunps/mg-mofs-74/cile的循环伏安曲线，曲线b为实施例2s2的nafion/mg-mofs-74/cile的循环伏安曲线，曲线a为实施例2s1的nafion/cile的循环伏安曲线；

图4为tca浓度与还原峰电流变化关系的检测线性回归曲线；

图5为nano2浓度与还原峰电流变化关系的检测线性回归曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的原料和仪器均为市售。

实施例1

一种用于检测tca或nano2的纳米电化学酶传感器，包括在三电极体系中用作基底电极的cile，cile表面修饰有复合膜，复合膜是从内到外依次排列的mg-mofs-74、aunps、mb和nafion组成的。

当将上述纳米电化学酶传感器置于含tca的ph为2.0的pbs缓冲溶液中，记录循环伏安曲线，根据tca浓度与还原峰电流变化关系构建线性回归方程，进一步可用于待测溶液中的tca浓度的检测。

参见图1，其为上述电化学酶传感器分别检测4,10,20,30，40,50,60,80,100,120,150,170,200mmol/ltca溶液时的循环伏安曲线的叠加图，明显可以看出还原峰电流随着tca浓度的增大而增大。

当待测溶液为nano2时，以ph为2.0的pbs缓冲溶液为支持电解质，测试循环伏安曲线，根据亚硝酸钠浓度与峰电流变化关系构建线性回归方程，根据线性回归方程可以得到待测溶液中的nano2浓度。

参见图2，其为该电化学酶传感器在ph为2.0的pbs缓冲溶液中分别检测含0.8,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.5,10.0,16.0,18.0mmol/lnano2时测得的循环伏安曲线的叠加图，明显可以看出还原峰电流随着nano2浓度的增加而增加。

由此可见，实施例1中的电化学酶传感器可以用来检测tca和nano2，并据循环伏安曲线的还原峰电流在相应应用情况下判断tca和nano2的浓度。

实施例2

一种上述用于检测tca或nano2的纳米电化学酶传感器的制备方法，包括以下步骤：

s1、取1.6g石墨粉和0.8gn-己基吡啶六氟磷酸盐(hppf6)置于研钵中研磨2.5h得到碳糊，然后将碳糊填入内径为4mm的玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到cile。在cile表面滴涂0.5%wtnafion乙醇溶液，静置晾干后得到nafion/cile。图3示出了nafion/cile在ph为2.0的pbs缓冲液中测得的循环伏安图；

s2、修饰mg-mofs-74：在所述步骤s1得到的cile表面滴涂0.3mg/mlmg-mofs-74悬浮液，得到mg-mofs-74修饰的cile，即mg-mofs-74/cile。在mg-mofs-74/cile表面滴涂0.5%wtnafion乙醇溶液，静置晾干后得到nafion/mg-mofs-74/cile。图3示出了nafion/mg-mofs-74/cile在ph为2.0的pbs缓冲液中测得的循环伏安图；

s3、电沉积aunps：在所述步骤s2得到的mg-mofs-74/cile浸泡在含2mmol/l氯金酸(haucl4)和0.5mol/lkno3混合溶液中，采用恒电位法电沉积aunps，沉积电位为-0.3v，沉积时间为200s。沉积后静置100s，用超纯水冲洗，静置晾干后得到aunps/mg-mofs-74/cile。在aunps/mg-mofs-74/cile表面滴涂0.5%wtnafion乙醇溶液，静置晾干后得到nafion/aunps/mg-mofs-74/cile。图3曲线c示出了nafion/aunps/mg-mofs-74/cile在ph为2.0的pbs缓冲液中测得的循环伏安曲线；

s4、修饰mb：在所述步骤s3得到的aunps/mg-mofs-74/cile表面滴涂mb溶液，得到mb/aunps/mg-mofs-74/cile；

s5、覆盖nafion膜：在所述步骤s4得到的mb/aunps/mg-mofs-74/cile表面滴涂0.5%wtnafion乙醇溶液，使所述电极材料能够稳定固定在电极上，完成纳米电化学酶传感器的制备，即nafion/mb/au/mg-mofs-74/cile。图3示出了nafion/aunps/mg-mofs-74/cile在ph为2.0的pbs缓冲液中测得的循环伏安图。

实施例3

一种实施例1的纳米电化学酶传感器在检测tca中的应用，包括以下步骤：以nafion/aunps/mg-mofs-74/cile作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，以ph为2.0的pbs缓冲液中为支持电解质，记录循环伏安曲线；根据tca浓度与还原峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的tca浓度。

参照图4，tca浓度与还原峰电流变化关系的检测线性回归图，从图中可知检测线性回归方程为：ipc(μa)=3.399c(mmol/l)+147.8，相关系数为g=0.999，tca检测线性范围为4.0-200.0mmol/l，检测限为1.67mmol/l(3σ)。

实施例4

一种实施例1的纳米电化学酶传感器在检测nano2中的应用，包括以下步骤：将nafion/aunps/mg-mofs-74/cile作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，以ph为2.0的pbs缓冲液为支持电解质，记录循环伏安曲线；据nano2浓度与还原峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的nano2浓度。

参照图5，nano2浓度与还原峰电流变化关系的检测线性回归图，从图中可知检测线性方程为：ipc(μa)=115.7c(mmol/l)+5.371，相关系数为g=0.999，tca检测线性范围为0.8~18mmol/l，检测限为0.27mmol/l(3σ)。

实施例5

对电化学酶传感器的回收率进行检查

为了进一步验证实施例1的电化学酶传感器在实际应用中的检测效果，现采用标准加入法，将该电化学酶传感器用于实际样品中的目标物检测（测定方法参照实施例1），进行回收率实验。

具体实验步骤：以ph为2.0的pbs缓冲溶液为支持电解质，标准添加已知浓度的tca，添加浓度参照表1，最后将实施例1的电化学酶传感器按照实施例3的方法检测待测溶液中的tca浓度，测定结果列于表1中。

表1：生物样品的回收率验证结果

从表1中可以看出，本发明的纳米电化学酶传感器在可测定的浓度范围内，测定结果理想，相比传统的检测技术，本发明的检测方法操作简单快速。

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。