一种HPLC法分析及制备3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)吲哚及其对映异构体的方法与流程

本发明涉及一种色谱分析分离方法，尤其是一种hplc法分析及制备3-(n-对甲苯磺酰基-l-丙氨酰氧基)吲哚及其对映异构体的方法，属于化学原料制备的技术领域。

背景技术

尿白细胞是尿常规检测的一项重要指标，吲哚酯是干化法测定尿白细胞的试剂带模块中的重要底物，其测定原理为：白细胞中的中性粒细胞胞浆内含有酯酶，酯酶作用于试纸模块中的吲哚酯，使其发生水解反应并且进一步与重氮盐偶联，形成紫色络合物，其颜色的深浅与中性粒细胞的多少成正比例关系。吲哚酯具体分为(-)-吲哚酯，化学名为3-(n-对甲苯磺酰基-l-丙氨酰氧基)吲哚和(+)-吲哚酯，化学名为3-(n-对甲苯磺酰基-d-丙氨酰氧基)吲哚，其结构式如式(1)所示：

式1中，a：(-)-吲哚酯；b：(+)-吲哚酯；

酯酶对吲哚酯两种对映异构体的立体选择性有所差异，对(-)-吲哚酯选择性水解较强，而对于另一种对映异构体(+)-吲哚酯选择性水解相对较弱，因此，尿白细胞试纸中使用的吲哚酯通常为(-)-吲哚酯。因此，如何分析分离吲哚酯对映异构体，控制(+)-吲哚酯杂质含量，进而确保尿白细胞试纸质量显得尤为重要。然而，对于吲哚酯两种对映异构体分析分离方法未见相关报道。

因此，如何建立一种能够简单、快速、高效的分析及制备吲哚酯两种对映异构体的方法，进而实现对其质量的控制，是目前需要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种应用手性固定相的液相色谱方法对吲哚酯两种对映异构体进行分析及制备，进而实现对其进行质量控制及单一对映体的制备。

本发明提供了一种hplc法分析及制备(-)-吲哚酯及其对映异构体的方法，其特征在于，采用手性色谱柱并使用正相或反相色谱法进行分析分离；所述正相色谱法使用的手性色谱柱为多糖衍生物涂覆型手性色谱柱，具体为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三[(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯]，所用的流动相为正己烷-异丙醇混合溶剂或正己烷-乙醇混合溶剂；所述的反相色谱法使用的色谱柱为β-环糊精手性色谱柱，使用的流动相为ph4.1的1％醋酸三乙胺(teaa)-甲醇或1％醋酸三乙胺(teaa)-乙腈的混合溶剂；

所述的分析方法包括以下步骤：

(1).(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品用乙醇溶解，配置成浓度为0.1mg/ml的对照品溶液；

(2).(±)-吲哚酯供试品用乙醇溶解，配制成浓度为1ml含(±)-吲哚酯0.1～1mg的供试品溶液；进样量为5～10μl；

(3).设置正己烷-异丙醇混合溶剂或正己烷-乙醇混合溶剂的比例为85：15～0：100，设置1％teaa(ph4.1)-甲醇混合溶剂或1％teaa(ph4.1)-乙腈混合溶剂比例为90：10～98：2；设置液相色谱柱温箱温度为室温，检测波长为220nm，流速为0.4～1.0ml/min；

(4).精密吸取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液分别注入液相色谱柱，参照(+)-吲哚酯酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析；

所述的制备方法包括以下步骤：

(1).(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品分别用乙醇溶解，配置成浓度为1mg/ml的对照品溶液；

(2).(±)-吲哚酯供试品用乙醇溶解，配制成浓度为5～10mg/ml的供试品溶液；进样量为1-10ml；

(3).设置正己烷-异丙醇混合溶剂或正己烷-乙醇混合溶剂的比例为85：15～0：100，设置1％teaa(ph4.1)-甲醇混合溶剂或1％teaa(ph4.1)-乙腈混合溶剂比例为90：10～98：2；设置流速为5～50ml/min；检测波长为220nm；

(4).吸取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液分别注入液相色谱柱，参照(+)-吲哚酯酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的制备；

进一步地，所述的一种hplc法分析及制备(-)-吲哚酯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的分析方法所用的手性色谱柱为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，所用的流动相为正己烷-异丙醇(70:30～0:100)或正己烷-乙醇(70:30～0:100)。

实验结果表明：采用硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱，采用正己烷-异丙醇(70：30)或正己烷-乙醇(70：30)混合溶剂的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，能够确保吲哚酯的稳定性，提高色谱峰的对称性，取得较好的分离效果，分离度大于6.0。

进一步地，一种hplc法分析及制备(-)-吲哚酯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的分析方法所用的手性色谱柱为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三[(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯]，所用的流动相为正己烷-异丙醇(75:25～30:70)或正己烷-乙醇(85:15～40:60)。

实验结果表明：采用硅胶表面涂覆有直链淀粉-三[(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯]的手性色谱柱，采用正己烷-异丙醇(75:25)混合溶剂或正己烷-乙醇(85:15)混合溶剂的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，能够确保吲哚酯的稳定性，提高色谱峰的对称性，取得较好的分离效果，分离度大于3.0。

进一步地，所述的一种hplc法分析及制备(-)-吲哚酯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的分析方法所用的手性色谱柱为β-环糊精手性色谱柱，所用的流动相为1％teaa(ph4.1)-甲醇(90:10～98:2)混合溶剂或1％teaa(ph4.1)-乙腈(90:10～98:2)。

实验结果表明：采用β-环糊精手性色谱柱，采用1％teaa-甲醇(95:5)混合溶剂的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，能够确保吲哚酯的稳定性，提高色谱峰的对称性，取得较好的分离效果，分离度大于2.0。

与以往技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明采用手性固定相的液相色谱法对吲哚酯对映异构体进行分析分离，其方法操作简单，准确和高效，能够有效控制吲哚酯的质量；

(2)采用较优选的手性色谱柱，采用较优选的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，从而确保吲哚酯的稳定性，提高了色谱峰的对称性，具有较好的分离效果。

(3)本发明使用的两类手性色谱柱与其它类手性固定相的液相色谱法相比，分离度更高，具有更好的分离效果。

可见，本发明克服了现有技术的不足，解决了吲哚酯对映异构体的分析分离问题，能够快速、准确和高效分析分离吲哚酯对映异构体，有效控制其质量，进而确保吲哚酯的质量。

因此，本发明开发的一种通分析分离吲哚酯对映异构体的hplc方法是十分必要的。

附图说明

图1：hplc图，色谱条件：色谱柱：ad-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-乙醇(50:50)。

图2：hplc图，色谱条件：色谱柱：ad-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(0:100)。

图3：hplc图，色谱条件：色谱柱：as-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-乙醇(70:30)。

图4：hplc图，色谱条件：色谱柱：as-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(50:50)。

图5：hplc图，色谱条件：色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：1％teaa-甲醇(95:5)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于具体实施例。

实施例1：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(70:30)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为6.5，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例2：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(0:100)

柱温：室温

流速：0.4ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为4.3，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例3：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(50:50)

柱温：室温

流速：0.8ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为5.2，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。见附图1。

实施例4：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(70:30)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为6.1，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例5：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(0:100)

柱温：室温

流速：0.4ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为3.3，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。见附图2。

实施例6：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(50:50)

柱温：室温

流速：0.4ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为3.7，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例7：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(85:15)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为1.9，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例8：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(40:60)

柱温：室温

流速：0.5ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为1.7，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例9：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(70:30)

柱温：室温

流速：0.8ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.4，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。见附图3。

实施例10：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(75:25)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为4.3，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例11：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(30:70)

柱温：室温

流速：0.5ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为1.8，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例12：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：正己烷-异丙醇(50:50)

柱温：室温

流速：0.5ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.9，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。见附图4。

实施例13：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-甲醇(90:10)

柱温：室温

流速：0.5ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.4，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例14：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-甲醇(98:2)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为3.0，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例15：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-甲醇(95:5)

柱温：室温

流速：0.8ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.4，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。见图5。

实施例16：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-乙腈(90:10)

柱温：室温

流速：0.5ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：0.1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙腈溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。精密吸取供试品母液1ml,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为1.6，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例17：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-乙腈(98:2)

柱温：室温

流速：1.0ml/min

进样体积：10μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙腈溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各10μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.5，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例18：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的分析分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×4.6mm,5.0μm)

流动相：1％teaa-乙腈(95:5)

柱温：室温

流速：0.8ml/min

进样体积：5μl

样品浓度：1mg/ml

检测波长：220nm

实验步骤

分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各1mg，置于10ml容量瓶中，乙腈溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯10mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品母液。分别精密吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品母液各5μl进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，完成对(-)-吲哚酯及其对映异构体的分析。

实验结果：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯两个对映异构体的分离度为2.1，(-)-吲哚酯及其对映异构体能够完全分离。

实施例19：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的制备分离

仪器与条件

色谱柱：ad-h(250×10mm,10.0μm)

流动相：正己烷-正己烷(0:100)

柱温：室温

流速：5ml/min

进样体积：1ml

样品浓度：5mg/ml

检测波长：220nm

制备步骤：分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各10mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯50mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各1ml进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，制得(-)-吲哚酯2.1mg和(+)-吲哚酯1.9mg。

实施例20：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的制备分离

仪器与条件

色谱柱：as-h(250×20mm,10.0μm)

流动相：正己烷-乙醇(85:15)

柱温：室温

流速：20ml/min

进样体积：10ml

样品浓度：5mg/ml

检测波长：220nm

制备步骤：分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各10mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯50mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10ml进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，制得(-)-吲哚酯18mg和(+)-吲哚酯20mg。

实施例21：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的制备分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×30mm,10.0μm)

流动相：1％teaa(ph4.1)-甲醇(95:5)

柱温：室温

流速：50ml/min

进样体积：10ml

样品浓度：10mg/ml

检测波长：220nm

制备步骤：分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各10mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯100mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10ml进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，制得(-)-吲哚酯45mg和(+)-吲哚酯38mg。

实施例22：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的制备分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×30mm,10.0μm)

流动相：1％teaa(ph4.1)-甲醇(90:10)

柱温：室温

流速：50ml/min

进样体积：10ml

样品浓度：10mg/ml

检测波长：220nm

制备步骤：分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各10mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯100mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10ml进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，制得(-)-吲哚酯43mg和(+)-吲哚酯39mg。

实施例23：(-)-吲哚酯和(+)-吲哚酯的制备分离

仪器与条件

色谱柱：cyclobondⅰ(250×30mm,10.0μm)

流动相：1％teaa(ph4.1)-乙腈(98:2)

柱温：室温

流速：50ml/min

进样体积：10ml

样品浓度：10mg/ml

检测波长：220nm

制备步骤：分别精密量取(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯各10mg，置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称量(±)-吲哚酯100mg,置于10ml容量瓶中，乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别吸取(+)-吲哚酯、(-)-吲哚酯对照品及(±)-吲哚酯供试品溶液各10ml进入液相色谱，参照(+)-吲哚酯和(-)-吲哚酯对照品保留时间，分别接收对应主峰，浓缩，干燥，制得(-)-吲哚酯41mg和(+)-吲哚酯32mg。