本发明属于中药成分检测技术领域。更具体地，涉及一种采用hplc法测定金银花活性组分的方法。
背景技术
金银花由(1963年版)梁·《名医别录》收录的，是忍冬科植物的干燥花蕾，耐旱耐寒。(1977年版)《中国药典》，选定lonicerajaponicathunb.，loniceraconfusadc.等为金银花的原植物。(2005年版)《中国药典》将金银花分为金银花和山银花等，并收录多种相关忍冬类植物，确定药用金银花的正品是忍冬lonicerajaponicathunb.。金银花lonicerajaponicathunb.在中国产量高，分布广，廉价易得，为后续的研究提供了来源保障，
目前为止，已检测出金银花包含的主要成分有:有机酸类化合物、三萜皂类化合物、黄酮类化合物、无机元素类等，其药效主要表现在:解热抗炎、抗病原微生物、抗氧化、保肝利胆、提高免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂等。其中黄酮类化合物中包括木犀草苷、丁香油酚、香叶醇、芦丁等；有机酸类化合物包括绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸以及异绿原酸等化合物等成分。金银花中还含有挥发油，例如肉豆蔻酸、苯乙醇、棕榈酸、亚油酸、芳樟醇、香叶醇等和三萜皂类如常春藤皂苷元、齐墩果酸、无患子皂苷、银花皂苷甲[9]；含有无机微量元素共15种如钙、磷、锌、铜、钡、铁、锰等。
hplc(高效液相色谱)法在分析药品、食品中质量检测方面得到广泛应用。hplc法可有效地控制金银花及其相关制剂质量，为改进金银花中药复合药剂和中成药的质量监测提供方法学的保证。同时，大量研究者优化并改进了检测方法，方传代等建立用反相高效液相色谱法建立了一种同时测定芦丁、槲皮素的质量控制方法。该方法使检测效率提高，结果重现性好，可用于金银花的质量监测。高效液相色谱法是检测金银花及其相关中药复合药剂中有效成分含量的主要分析方法。研究者一般检测单一的化学成分类型较多，而对于同时检测出金银花中多种有效成分的检测方法比较少见。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种采用hplc法测定金银花活性组分的方法。该方法可对金银花中8种有效成分进行综合评价并测定各组分含量，为金银花药材的质量鉴定提供依据。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种采用hplc法测定金银花活性组分的方法，包括如下步骤：
1)在色谱条件下，将样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，比较两种溶液相邻色谱峰的分离度；若所述分离度大于1.5，则说明样品溶液中的各活性组分之间是可分离的；
2)在色谱条件下，将2.5-25μl不同体积的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，以进样量(μg)为横坐标(x)，以各活性组分色谱峰峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线，若各活性组分的r2均大于0.9，则说明样品溶液中的各活性组分在各自范围内线性关系良好；
3)在色谱条件下，将10μl的对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的rsd均小于5％，则说明高效液相色谱仪精密度良好；
4)在色谱条件下，将10μl的样品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的rsd均小于5％，则说明样品溶液中各活性组分重复性良好；
5)在色谱条件下，于0-24h不同时间将10μl的样品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，记录在不同时间点各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的rsd小于5％，则说明样品溶液中各活性组分稳定性良好；
6)取6份2.5ml的样品溶液，向每份样品溶液中分别加入2.5ml的对照品溶液，得混合液；在色谱条件下，从每份混合液中取10μl溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，计算每份混合液中各活性组分的回收率；若各活性组分的rsd小于5％，则说明样品溶液中各活性组分回收性良好；
所述色谱条件如下：检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：ymc-packods-ac18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(a)：0.6％(乙酸水溶液的体积分数)乙酸(b)；a：8％-28％，0-30min(流动相冲洗时间)；b：92％-72％，0-30min；检测波长：330nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；
其中，a：8％-28％，0-30min(流动相冲洗时间)；b：92％-72％，0-30min；表示在流动相冲洗时间0-30min内，色谱柱中a相和b相体积分数的变化范围分别为a：8％-28％，b：92％-72％。
流动相的制备：精密量取6ml乙酸，置1000ml容量瓶中，使用超纯水定容，混匀，过0.22μm有机微孔滤膜，超声排气15min。
本发明的流动相在进入高效液相色谱之前需要过0.22μm有机微孔滤膜。
所述对照品溶液和样品溶液中的各活性组分之间具有相同的比例关系。
进一步，所述样品溶液的制备包括如下步骤:
1)将粉碎的金银花置于具塞锥形瓶中，然后加入50％的甲醇并称定重量，得浓度为0.02g/ml的混合液；将所述混合液超声处理30-50min，使金银花的活性组分有效的释出；超声处理后用50％的甲醇补足损失的重量，使超声前和超声后混合液的重量相等；
2)将超声后的混合液摇匀，并过滤除渣；取滤液过0.22μm的有机滤膜，得金银花50％甲醇溶液。
进一步，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：精密称取2.18mg新绿原酸、1.05mg隐绿原酸、4.04mg芦丁、2.42mg木犀草苷、1.53mg异绿原酸b，放入250ml棕色容量瓶中，用50％甲醇溶液定容，溶解，混匀，得第一对照品溶液；精密称取6.16mg绿原酸、0.97mg异绿原酸c和2.86mg异绿原酸a，放入25棕色容量瓶中，加入所述第一对照品溶液，定容，混合，混匀；过0.22μm的有机滤膜，得对照品溶液；
其中，对混合照品溶液中各组分的浓度分别为：新绿原酸0.00872μg/μl、绿原酸0.246μg/μl、隐绿原酸0.0042μg/μl、芦丁0.01616μg/μl、木犀草苷0.00968μg/μl、异绿原酸b0.00612μg/μl、异绿原酸a0.1144μg/μl、异绿原酸c0.0388μg/μl。
进一步，将金银花中的活性组分完全释出的超声处理所要满足的条件如下：超声功率600w，超声频率40khz，超声温度40℃。
进一步，该方法可同时检测样品溶液中的八种活性组分；所述活性组分为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸b、异绿原酸a和异绿原酸c。
进一步，所述样品溶液中各活性组分之间的分离度大于1.5，各活性组分在各自范围内r2均大于0.9990；在重复性、稳定性、加样回收率和精密度实验中，各活性组分的rsd均小于5％。
进一步，为了使对照品溶液、样品溶液和流动相不堵塞高效液相色谱仪的柱子；因此对照品溶液、样品溶液和流动相均需要过0.22μm的有机滤膜。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法采用高效液相色谱与紫外检测法联用，检测了金银花50％甲醇提取液中八种有效成分及其含量；通过方法学考察，表明使用的方法良好，可以作为同时测定金银花50％甲醇提液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c的方法，此方法稳定准确，灵敏高效，回收率高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1:(a)示出了对照品溶液的色谱图；(b)示出了金银花50％甲醇溶液的色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所用仪器：高效液相色谱仪(e2695)，美国沃特世公司；超声波清洗器(kq600e)，昆山市超声仪器有限公司；真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多集团；纯水仪，上海力新仪器有限公司。
本发明的试验材料：金银花，购自北京同仁堂；新绿原酸(批号：16031121)、绿原酸(批号：14031321)、隐绿原酸(批号：16030331)、芦丁(批号：14061322)、木犀草苷(批号：15073023)、异绿原酸b(批号：15111921)、异绿原酸a(批号：15111925)和异绿原酸c(批号：15081422)均购自上海同田生物技术有限公司；乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯)均购自天津市光复精细化工研究所。
实施例1
金银花50％甲醇溶液的制备
金银花粉粹后，称取金银花粉末1.000g，置于50ml具塞锥形瓶中，加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz，温度40℃)30min，放冷，称定重量，用50％甲醇补足损失重量，摇匀，过滤，待用，取续滤液过0.22μm的有机滤膜，即得。制备6份平行样品。
对照品溶液的制备
精密称取2.18mg新绿原酸、1.05mg隐绿原酸、4.04mg芦丁、2.42mg木犀草苷、1.53mg异绿原酸b，放入250ml棕色容量瓶中，用50％甲醇溶液定容，溶解，混匀，得第一对照品溶液；分别称取6.16mg绿原酸、0.97mg异绿原酸c和2.86mg异绿原酸a，放入25ml棕色容量瓶中，加入所述第一对照品溶液，定容，混合，混匀；过0.22μm的有机滤膜，待用。
色谱条件
检测器：二极管阵列检测器；
色谱柱：ymc-packods-ac18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；
流动相：乙腈(a)：0.6％乙酸(b)；a：8％-28％，0-30min；b：92％-72％，0-30min；
检测波长：330nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃。
实施例2
一种采用hplc法测定金银花活性组分的方法，包括如下步骤：
1)专属性试验
在色谱条件下，分别将10μl的金银花50％甲醇溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，结果见图1(a)和(b)；由图1可知，两种溶液相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且在对照品各活性组分相应的保留时间处，样品各活性组分也都有相应的色谱峰出现；说明金银花50％甲醇溶液中的各活性组分之间是可分离的，参考《中华人民共和国药典》，2010，附录37。
分离度r的计算公式：r＝2(tr2-tr1)/(w1+w2)；其中，tr2:相邻两峰中后一峰的保留时间；tr1:相邻两峰中前一峰的保留时间；w1、w2:分别为此相邻两峰的峰宽。
2)线性关系考察
在色谱条件下，分别吸取对照品溶液2.5、5、10、15、20、25μl注入高效液相色谱仪进行检测，以进样量(μg)为横坐标(x)，以各活性组分色谱峰峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线。回归方程见表1，对照品溶液各活性组分的r2均大于0.99，说明8种活性组分在各自范围内线性关系良好。
表1各活性组分的线性关系
3)精密度试验
在色谱条件下，将10μl的对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积，结果见表2；表2显示对照品溶液各活性组分rsd为0.39％～1.78％，说明仪器精密度良好。相对标准偏差(rsd)＝标准偏差(sd)/计算结果的算术平均值(x)×100％。
表2精密度考察结果
4)重复性试验
在色谱条件下，将10μl的金银花50％甲醇溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；结果见表3；表3显示各活性组分rsd为0.35％-1.59％，则说明金银花50％甲醇溶液中各活性组分重复性良好。
表3重复性考察结果
5)稳定性试验
在色谱条件下，分别于0、2、4、8、12和24h吸取10ml的金银花50％甲醇溶液并注入高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，计算各活性组分色谱峰峰面积，结果见表4；表4中8种有效成分峰面积rsd为0.50％～2.43％，表明金银花50％甲醇溶液在24h内稳定。
表4稳定性考察结果
6)加样回收率试验
量取已测定8种有效成分含量的金银花50％甲醇溶液6份，每份2.5ml，置5ml棕色容量瓶中，分别加入对照品溶液2.5ml，在色谱条件下，分别取样10μl并注入高效液相色谱仪；计算各活性组分的加样回收率，结果见表5。在加样回收试验中须注意对照品各成分的加人量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。
加样回收率％＝(c-a)/b×100％；其中，a为金银花50％甲醇溶液各成分原有量；b为对照品中各成分加入量；c为各成分测得量。参考《中华人民共和国药典》，2010，附录130。
表5加样回收率试验结果(n＝6)
由表5可知，金银花50％甲醇溶液中各活性组分的平均回收率为98.98～102.84％(n＝6)，rsd为0.9％-4.11％，说明金银花50％甲醇溶液中各活性组分的回收率良好。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。