一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物O-去甲文拉法辛浓度的方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛浓度的方法。

背景技术

抑郁障碍是一组以显著而持久的情绪低落等症状为主要特征的常见的心境障碍，其具有患病率高、复发率高、致残率高的特点。据2012年世界卫生组织的统计数据表明，抑郁障碍已经成为世界第四大疾病，预计到2020年可能成为仅次于缺血性心脏病的人类第二大疾病。文拉法辛是第一个5-羟色胺(5-ht)和去甲肾上腺素(ne)再摄取双重抑制剂(snris)，是不同于其他抗抑郁药物的、具有独特化学结构和神经药理活性的新型抗抑郁药。它对肾上腺素能、m1、胆碱能及组胺h1受体无明显亲和力，因此其不良反应较少，安全性高，且由于其对β受体的快速下调作用而起效快。与其他抗抑郁药物相比具有明显优势，已成为治疗抑郁症的一线药物。

2011年精神科治疗药物监测(therapeuticdrugmonitoring,tdm)指南根据当时的研究成果提出文拉法辛参考浓度范围为100ng～400ng/ml，另外需重视该药物的警戒浓度水平为800ng/ml，即当血药浓度达到或超过上述警戒浓度水平时，如患者出现不能耐受或毒性反应，应适当减量药物，如患者无明显不良反应而减药则存在病情恶化的风险，可暂不减药。文拉法辛的tdm必要性推荐分级为2级建议级，在4级分级中仅次于1级强烈建议级，建议进一步拓展tdm优化治疗。有些精神疾病患者自知力丧失或仅存部分自知力，在长期用药过程中可能存在藏匿药物的行为，治疗依从性差，tdm可准确地反映患者服药的真实情况。tdm可定量测定血浆或血清中药物浓度来确定患者个体的给药剂量，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性、同时还可以降低中毒的风险，是针对不同患者个体量体裁衣式地制定给药方案的一种很有效的方法。此外，tdm还具有提高精神药物治疗成本-效益的可能，以及其他尚未充分挖掘的巨大潜力。

近来年，国内外逐渐关注新型抗抑郁药物血药浓度的研究领域，但涉及文拉法辛活性代谢产物o-去甲文拉法辛的报告较少，部分研究检测灵敏度不高，影响生物样本中血药浓度的准确测定或仅对犬血样的测定，无临床指导意义。

目前从血浆中提取文拉法辛(和文拉法辛)的研究报导中，有沉淀蛋白、液液萃取和固相萃取法，其中以沉淀蛋白居多。沉淀蛋白属快速但粗糙的净化技术，仅可去除约90-95％的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除，处理后的血样易堵塞小粒径填料色谱柱，使色谱柱寿命缩短，且导致样品稀释，造成灵敏度的降低，固相萃取小柱成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足之处而提供一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛浓度的方法。本发明采用hplc荧光检测方法，简单方便灵敏度高，且无内源性杂质峰干扰，文拉法辛、o-去甲文拉法辛峰形好及内标分离度高；血样采用乙醚萃取、抽提，样本处理简单、快捷。本方法成本低，可方便检测人血浆中的文拉法辛和o-去甲文拉法辛，方法重复性好、准确度高、可操作性强，对于指导临床个体化用药具有重要意义。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛浓度的方法，由以下步骤完成：

(1)血浆样品的处理:

取血浆样品500μl于5ml具塞离心管中，加入50μg/ml内标溶液30μl，于1500r/min涡旋3min，加乙醚3ml，1500r/min涡旋3min后，3000r/min离心15min进行萃取、抽提，取上层有机层于40℃氮气流下吹干，精密加入流动相100μl复溶，涡旋10s，得到血浆样品上样液，用高效液相荧光法进样10μl；

(2)溶液配制：

0.05mol/l磷酸二氢钠溶液：称取nah2po4·h2o3.44893g加水溶解并稀释至500ml，加三乙胺10μl，用磷酸溶液调ph至2.90；

盐酸文拉法辛标准储备液：精密称取盐酸文拉法辛2.33mg置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(206μg/ml)，4℃冰箱内保存备用；

o-去甲文拉法辛标准储备液：精密称取o-去甲文拉法辛2.12mg，置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(212μg/ml)，4℃冰箱内保存备用；

内标溶液：精密称取盐酸美西律2.33mg，置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液(193.6μg/ml)，4℃冰箱内保存备用。实验时用50％甲醇-水稀释为50μg/ml；

文拉法辛和o-去甲文拉法辛系列标准溶液：分别精密量取文拉法辛和o-去甲文拉法辛标准储备液适量，用50％甲醇-水稀释，制成浓度分别为25、18.725、12.5、5、2.5、1.25、0.5、0.25μg/ml的含文拉法辛和o-去甲文拉法辛系列标准溶液，4℃冰箱内保存备用。

(3)色谱条件的选择：

其中高效液相色谱条件为：色谱柱agilenteclipsexdb-c18(5μm,4.6×150mm)，流动相为磷酸二氢钠(0.05mol/l)-乙腈(72:28)，流速0.05ml/min，柱温30℃，荧光激发波长276nm，发射波长598nm。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用操作方便、成本低廉的液液萃取来处理血浆样本，本发明建立了人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛的hplc荧光检测法，优化了血样处理过程，操作简便、成本低廉，且该荧光法专属性强灵敏度高。

(2)本发明选用非精神科药物作为内标，且排除了一些精神科合并用药的干扰，大大提高了准确测定文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛的能力，提高了测定方法的可靠性。

(3)本发明中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛与内标分离度高，峰形良好且无内源性杂质峰干扰，满足临床实验的需求和相关指导原则的要求，可用于临床文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛的测定。

(4)本发明考查常与文拉法辛合并用药的苯二氮卓类药物阿普唑仑、氯硝西泮、劳拉西泮的影响，将药品用甲醇溶，配成远大于阿普唑仑(5-50ng/ml)、氯硝西泮(4-80ng/ml)、劳拉西泮(10-15ng/ml)的治疗窗(治疗窗上限100倍)浓度，结果发现，仅在约2.8min处有个较小溶剂峰，阿普唑仑、氯硝西泮、劳拉西泮无明显的荧光峰，表明该合并用药不影响文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛的准确测定。

附图说明

图1.文拉法辛和o-去甲文拉法辛的高效液相荧光色谱图；

其中a为加乙腈-水(40:60)50μl的血样；b为不加乙腈-水(40:60)50μl的血样

图2.文拉法辛和o-去甲文拉法辛的高效液相色谱图；

其中a为荧光检测，b为紫外检测；1为o-去甲文拉法辛，2为内标美西律，3为文拉法辛

图3.合并用药药物色谱图；

其中a为阿普唑仑色谱图，b为氯硝安定色谱图，c劳拉西泮色谱图，d甲醇溶剂色谱图

图4.文拉法辛和o-去甲文拉法辛的高效液相色谱图；

图5.血浆中文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度的标准曲线；

图6.血浆中文拉法辛和o-去甲文拉法辛的定量限；

1为o-去甲文拉法辛，2为文拉法辛

图7.文拉法辛和o-去甲文拉法辛的高效液相色谱图；

其中a为条件1检测，b为条件2检测；1为o-去甲文拉法辛，2为内标美西律，3为文拉法辛

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

溶液的配制

0.05mol/l磷酸二氢钠溶液：称取nah2po4·h2o3.44893g加水溶解并稀释至500ml，加三乙胺10μl，用磷酸溶液调ph至2.90。

盐酸文拉法辛标准储备液：精密称取盐酸文拉法辛2.33mg置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(206μg/ml)，4℃冰箱内保存备用。

o-去甲文拉法辛标准储备液：精密称取o-去甲文拉法辛2.12mg，置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(212μg/ml)，4℃冰箱内保存备用。

内标溶液：精密称取盐酸美西律2.33mg，置10ml棕色容量瓶中，用50％甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液(193.6μg/ml)，4℃冰箱内保存备用。实验时用50％甲醇-水稀释为50μg/ml。

文拉法辛和o-去甲文拉法辛系列标准溶液：分别精密量取文拉法辛和o-去甲文拉法辛标准储备液适量，用50％甲醇-水稀释，制成浓度分别为25、18.725、12.5、5、2.5、1.25、0.5、0.25μg/ml的含文拉法辛和o-去甲文拉法辛系列标准溶液，4℃冰箱内保存备用。

实施例2

血浆样品处理

取血浆样品500μl于5ml具塞离心管中，加入50μg/ml内标溶液30μl，于1500r/min涡旋3min，加乙醚3ml，1500r/min涡旋3min后，3000r/min离心15min进行萃取、抽提，取上层有机层于40℃氮气流下吹干，精密加入流动相100μl复溶，涡旋10s，得到血浆样品上样液，用高效液相荧光法进样10μl，其中高效液相色谱条件为：色谱柱agilenteclipsexdb-c18(5μm,4.6×150mm)，流动相为磷酸二氢钠(0.05mol/l)-乙腈(72:28)，流速0.05ml/min，柱温30℃，荧光激发波长276nm，发射波长598nm。

实施例3

色谱条件的选择

条件1：色谱柱agilenteclipsexdb-c18(5μm，4.6×150mm)，流动相为磷酸二氢钠(0.05mol/l)-乙腈(75:25)，流速0.5ml/min，柱温30℃，荧光激发波长276nm，发射波长598nm，进样量10μl；见图7a

条件2：色谱柱agilenteclipsexdb-c18(5μm，4.6×150mm)，流动相为磷酸二氢钠(0.05mol/l)-乙腈(72:28)，流速0.5ml/min，柱温30℃，荧光激发波长276nm，发射波长598nm，进样量10μl；见图7b。

实施例4

专属性试验

取空白血浆500μl，按“血浆样品处理”项下操作，进样作空白对照；另取空白血浆，加入适量文拉法辛、o-去甲文拉法辛及内标，同法操作，记录色谱图，见图1、图2。

实施例5

标准曲线与检测线

分别在空白血浆500μl中加入含文拉法辛和o-去甲文拉法辛的系列标准溶液20μl，得到含文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度分别为1000、750、500、200、100、50、20、10ng/ml的含药生物样本，加内标30μl，按“血浆样品处理”项下操作，进样10μl，记录色谱图，图4所示。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法(l/c²)进行回归运算，求直线回归方程和标准曲线，得到文拉法辛和o-去甲文拉法辛的回归方程，如图5所示。

分别配制不同浓度的文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度分别血浆样品，不加内标，按血样前处理项下处理后进样，按信噪比为s/n为10计算定量限，见图6。

实施例6

精密度实验

按“标准曲线的制备”的方法配制含文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度分别20、200、750ng/ml的qc样品，按“血浆样品处理”项下操作，对每一个浓度样品进行5次平行样品测定，连续测定3天。根据当日的标准曲线，计算qc样品的浓度。根据qc样品测定结果计算日内和日间相对标准偏差,结果见表1。

实施例7

萃取回收率与方法回收率

萃取回收率：精密量取适量含文拉法辛和o-去甲文拉法辛的标准溶液，按“标准曲线的制备”的方法，加入空白血浆500μl配制浓度分别20、200、750ng/ml的质量控制(qualitycontrol，qc)样品,按“2.3”项下操作的方法操作，对每一个浓度样品进行5次平行样品测定，待测物的峰面积记录为a1；另精密量取适量含文拉法辛和o-去甲文拉法辛的标准溶液，40℃氮气流下吹干，加入100μl流动相复溶，进样10μl，以待测物和内标物的峰面积比记录为a2，以a1/a2计算萃取回收率，结果见表2。

方法回收率：按“标准曲线的制备”的方法配制含文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度分别20、200、750ng/ml的qc样品，按“2.3”项下操作，每一浓度进行5次平行测定，记录待测物与内标峰的峰面积as、ai，以r＝as/ai代入标准曲线方程计算测定浓度，以测定浓度与配制浓度之比计算回收率,结果见表2。

实施例8

样品的稳定性和重复性

按“标准曲线的制备”的方法配制含文拉法辛和o-去甲文拉法辛浓度分别20、200、750ng/ml的qc样品，按“2.3”项下操作，于室温下保存，于0、24、48h取样检测，每个浓度5样本进样，进样10μl,结果见表3所示。

实施例9

合并用药对测定结果的影响

本实施例考查了部分苯二氮卓类药物对文拉法辛、o-去甲文拉法辛和内标美西律测定的影响。分别配制远大于阿普唑仑(5-50ng/ml)、氯硝西泮(4-80ng/ml)、劳拉西泮(10-15ng/ml)治疗窗浓度(治疗窗上限100倍)的血浆样品，按照血样处理方法处理后进样10μl，结果见图3。

以上实施例检测表格如下：

表1.血浆中文拉法辛和o-去甲文拉法辛的日内精密度和日间精密度

表2.血浆中文拉法辛和o-去甲文拉法辛的萃取回收率和方法回收率

表3.血浆中文拉法辛和o-去甲文拉法辛的稳定性和重复性

结果表明：

(1)见图1、图2，空白血浆对文拉法辛、o-去甲文拉法辛及内标(美西律)的测定均无干扰；

(2)按信噪比为s/n为10计算定量限，文拉法辛和o-去甲文拉法辛的定量线为10ng/ml，见图6；

(3)流动相比例为磷酸二氢钠(0.05mol/l)-乙腈(72:28)时文拉法辛和o-去甲文拉法辛的峰形更好，且出峰时间明显缩短(约2min)，这对于临床上高通量快速检测样品具有重要的意义，可以节省样品检测时间，见图7；

(4)结果显示文拉法辛和o-去甲文拉法辛的日内和日间精密度均<10％，表明该实验精密度良好,结果见表1；

(5)文拉法辛血浆萃取回收率>70％，o-去甲文拉法辛萃取回收率>80％，两者rsd均<10％；文拉法辛和o-去甲文拉法辛的方法回收率均在90％～110％之间，rsd均<10％，可满足生物样品分析方法的要求，结果见表2。

(6)文拉法辛和o-去甲文拉法辛血浆样品在放置0，24，48h后测定，rsd均<10％，表明文拉法辛和o-去甲文拉法辛的稳定性和重复性良好，见表3；

(7)阿普唑仑、氯硝西泮和劳拉西泮无明显的荧光峰，不影响文拉法辛、o-去甲文拉法辛和内标美西律的准确测定。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。