本发明属于标本固定液技术领域，具体的说是一种解剖教学标本用保色固定液及其制备方法。
背景技术
动物教学标本种类繁多、品种多样，主要包括浸制标本、塑化标本、剥制标本、透明标本、骨骼标本、干制标本、病理组织标本等，在科研、教学及科普等领域中发挥着重要作用。其中，浸制标本因其制作方法简单，易操作，应用历史最久、范围较广。浸制标本制作步骤包括剥皮、清除脂肪、残肉、结缔组织、污血等处理后，进行清洗、脱脂、鞣制、中和、清洗，之后在固定液中固定。
传统用于固定的固定液成分有甲醛、多聚甲醛、乙醇、甲醇等。其中，甲醛为有刺激气味的无色气体，对眼、鼻、咽喉等有强烈的刺激作用，易造成气喘、皮炎、胸闷等不适反应。还易燃烧，遇明火、高热会引起剧烈爆炸。而甲醇和乙醇又是无色有酒精气味易挥发的液体，易燃易爆，生成水蒸气和二氧化碳，甲醇致命剂量约为70毫升。对神经、血液、消化道、呼吸道产生毒性反应。也就是说：这些传统的固定液成分大多存在刺激性、毒性、挥发性、易燃性和易爆性等使用缺陷。同时，现有的固定液在用于动物浸制标本的浸泡使用过程中，均不同程度的存在标本掉色、暗淡现象。即：动物浸制标本在固定液中浸泡时间较长时，动物组织的外观会因为细菌侵入，菌落繁殖、细胞氧化等原因，产生不同程度的掉色，影响着标本的逼真性。
因此，亟需研发一种新型、环保、无毒、无刺激、环境友好型的固定液，来用于浸制标本的保色固定和保存。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种解剖教学标本用保色固定液及其制备方法。其能够对动物标本细胞实现快速渗透和填充，并具有较好的抑菌杀菌，防止霉变，保色抗氧化的作用，从而提高动物浸制标本的固定质量、效果、保存时间及色泽。同时，该固定液成分具有安全无毒，环保的特点。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种解剖教学标本用保色固定液，由以下重量份数的组分构成：十二烷基硫酸钠2-3份、尿素10-15份、山梨酸钾0.3-0.7份、柠檬酸0.2-0.5份、1,2-丙二醇18-23份、三聚磷酸钠0.5-0.7份、抗坏血酸0.4-0.6份、l-半胱氨酸0.1-0.3份、柑橘类水果果皮提取物0.8-1.3份、茶渣提取物1-1.5份，蒸馏水60-67份。
一种解剖教学标本用保色固定液的制备方法，包括以下步骤：
（1）柑橘类水果果皮提取物的制备
取柑橘类水果的果皮，洗净晾干后，置于破碎机中破碎成浆料，之后，向该浆料中加入其质量0.3-0.7%的纤维素酶和其质量0.2-0.4%的果胶酶，搅拌均匀后，于40-50℃温度条件下进行酶解处理1.5-2.5h，之后，在不断搅拌条件下，向所得酶解产物中加入naoh溶液，直至所得混合物的ph为10-11，然后进行真空抽滤，取滤液，并在不断搅拌条件下，向滤液中加入酸碱调节剂，调节滤液的ph为2-3，取下层沉淀，蒸馏水反复冲洗并干燥后，即得柑橘类水果果皮提取物，备用；
（2）茶渣提取物的制备
取一次冲泡后的新鲜茶渣，摊晒晾干后，置于微波反应器中，调节微波功率为650-750w，进行微波处理100～120s，然后，将所得茶渣粉碎成粒径为0.3-0.8㎜的粉末，并向所得粉末中加入其质量3-5倍的乙醇溶液，充分搅拌混合后，在超声波辅助条件下进行回流提取1-2h，取高于80℃的馏分，即得茶渣提取物，备用；
（3）保色固定液的制备
a按照上述重量份数，分别称取十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、1,2-丙二醇、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、蒸馏水以及步骤（1）制得的柑橘类水果果皮提取物和步骤（2）制得的茶渣提取物，备用；
b取步骤a所称取的一半的蒸馏水，并向其中加入十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸和茶渣提取物，充分搅拌溶解后，制得中间溶液，备用；
c取步骤a所称取的1,2-丙二醇和柑橘类水果果皮提取物，充分混合均匀后，加入到步骤b制得的中间溶液中，搅拌均匀后，将步骤a称取的另一半蒸馏水加入其中，充分混合后，即得成品保色固定液。
优选的，在步骤（1）中，所述酶解处理的过程中，每间隔30min进行超声波处理20-30s。
优选的，在步骤（1）中，所述的酸碱调节剂为醋酸溶液或磷酸溶液。
优选的，在步骤（1）中，所述向滤液中加入酸碱调节剂的过程中，辅助进行有超声波振荡处理，且超声波振荡处理的频率为55-65khz。
本发明的有益效果：
1、本发明的保色固定液采用十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、1,2-丙二醇、柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物作为有效成分。该保色固定液配方合理、成分科学安全、环境友好，配制操作方便，具有快速渗透和填充动物组织标本细胞，固定蛋白质，广谱抑菌和防霉，保色抗氧化的功效。适用于骨骼标本、动物浸泡标本等的长期固定、防腐、保存，有效提高了标本固定质量、效果，而且能够长时间保持标本原有色彩。同时，固定液成分对人畜无毒、无害、无刺激，对环境无污染，是一种环境友好型保色固定液。保色固定液本身还具有植物芳香气味，不仅能够起到较强的抑菌抗霉效果，还能够掩盖动物组织长时间放置所产生的腐败气味。实验室实验测试结果显示：本发明的保色固定液相较于现有技术中的常规固定液，保色时间更长，动物标本还原度更高，且对于动物标本的组织器官无任何破坏、发暗、变色作用，自然状态保持度高，从而有效提高了动物浸制标本的制作质量和制作效率，降低了制作和护理成本，且环保特性显著特点。
2、本发明的保色固定液采用特定配比的化学抗氧化物质柠檬酸、抗坏血酸和l-半胱氨酸，结合生物质提取抗氧化物质柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物作为固定液中的抗氧化成分，这些成分协同配合，不仅能够很好的避免动物标本组织器官长时间放置后细胞氧化所带来的组织损伤、变质、发暗、变色等现象的发生，还能够与动物标本细胞中的肌红蛋白和血红蛋白等物质结合，生成具有鲜艳色彩的亚硝基蛋白，从而起到较好的护色、丰色效果。同时，生物质成分柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物还具有较强的防腐、抗菌和杀菌功效，该成分能够附着在动物标本表面，形成防护隔离膜，有效避免外接污染物或细菌的浸入，起到较好的抗菌、抑菌作用，从而起到长时间对动物标本进行护色、防腐蚀的保护效果。
3、本发明提供的一种保色固定液的制备方法，方法本身操作简单，药用成分利用率高。其中的天然生物质抗氧化、抑菌成分取自柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物，提取的药用成分有皂苷、黄酮类化合物、多酚等。其中，柑橘类水果果皮提取物中的主要成分为橘皮苷，本申请在该物质的提取过程中，采用了破碎、酶解、ph析出等步骤，通过破碎、酶解等操作能够最大限度的破坏柑橘类水果的果皮细胞，使其将更多的生物质药用成分释放出来，提高提取率。独特的ph析出操作不仅能够使橘皮苷较为完全的沉淀析出，还能够保证橘皮苷结构不被破坏和分解，使其在固定液成分中发挥更好的抑菌、抗炎作用。茶渣提取物中的主要成分为茶多酚，茶多酚本身除了对于葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等的抑菌作用外，还具有较强的抗氧化作用。其本身的稠环芳香烃结构还能够吸附标本长时间存放后产生的异味，还具有防止褪色，抑制亚硝酸盐的形成和积累作用。同时，茶渣提取物取自工业生产废料茶渣，属于废物再利用，提高了物料利用率，成本较低。
4、本发明在天然生物质成分柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物的提取过程中，采用有频率为55-65khz的超声波振荡处理的步骤。该操作能够使生物质成分中的c-n键发生断裂，促使生物质成分中小分子组分的生成，提高可利用药用成分的含量。同时，该频率的超声波振荡处理还有利于晶体的沉淀和析出，提高收率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。以下实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改或改动，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
一种解剖教学标本用保色固定液，由以下重量份数的组分构成：十二烷基硫酸钠2-3份、尿素10-15份、山梨酸钾0.3-0.7份、柠檬酸0.2-0.5份、1,2-丙二醇18-23份、三聚磷酸钠0.5-0.7份、抗坏血酸0.4-0.6份、l-半胱氨酸0.1-0.3份、柑橘类水果果皮提取物0.8-1.3份、茶渣提取物1-1.5份，蒸馏水60-67份。
一种解剖教学标本用保色固定液的制备方法，包括以下步骤：
（1）柑橘类水果果皮提取物的制备
取柑橘类水果的果皮，洗净晾干后，置于破碎机中破碎成浆料，之后，向该浆料中加入其质量0.3-0.7%的纤维素酶和其质量0.2-0.4%的果胶酶，搅拌均匀后，于40-50℃温度条件下进行酶解处理1.5-2.5h，在酶解处理的过程中，每间隔30min进行超声波处理20-30s，之后，在不断搅拌条件下，向所得酶解产物中加入naoh溶液，直至所得混合物的ph为10-11，然后进行真空抽滤，取滤液，并在不断搅拌条件下，辅助进行频率为55-65khz的超声波振荡处理，向滤液中加入酸碱调节剂醋酸溶液或磷酸溶液，调节滤液的ph为2-3，取下层沉淀，蒸馏水反复冲洗并干燥后，即得柑橘类水果果皮提取物，备用；
（2）茶渣提取物的制备
取一次冲泡后的新鲜茶渣，摊晒晾干后，置于微波反应器中，调节微波功率为650-750w，进行微波处理100～120s，然后，将所得茶渣粉碎成粒径为0.3-0.8㎜的粉末，并向所得粉末中加入其质量3-5倍的乙醇溶液，充分搅拌混合后，在超声波辅助条件下进行回流提取1-2h，取高于80℃的馏分，即得茶渣提取物，备用；
（3）保色固定液的制备
a按照上述重量份数，分别称取十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、1,2-丙二醇、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、蒸馏水以及步骤（1）制得的柑橘类水果果皮提取物和步骤（2）制得的茶渣提取物，备用；
b取步骤a所称取的一半的蒸馏水，并向其中加入十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸和茶渣提取物，充分搅拌溶解后，制得中间溶液，备用；
c取步骤a所称取的1,2-丙二醇和柑橘类水果果皮提取物，充分混合均匀后，加入到步骤b制得的中间溶液中，搅拌均匀后，将步骤a称取的另一半蒸馏水加入其中，充分混合后，即得成品保色固定液。
本发明的一种解剖教学标本用保色固定液，配方中的十二烷基硫酸钠（sds），为阴离子表面活性剂，易溶于水，生物降解快，用于动物组织蛋白的变性。尿素是一种白色晶体，能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质，使蛋白质有效变性。山梨酸钾为酸性防腐剂，能够抑制微生物体内的脱氢酶系统，具有较强的抑制细菌、霉菌、酵母菌生长的作用，起到防腐的作用。柠檬酸为无色晶体的抗氧剂，无色无味，易溶于水，有效抑制细菌、杀灭细菌芽孢，并且具有保色作用。丙二醇为一种无色粘稠液体，有微甜味，用作润湿剂，可结合生物质成分渗入细胞内部更好的还原动物形貌。三聚磷酸钠为其中的水分保持剂，对于动物形貌的还原性好。抗坏血酸和l-半胱氨酸为保色剂，具有较好的保色、护色效果。柑橘类水果果皮提取物和茶渣提取物用于抗氧化和护色，与动物细胞的相容性好。配方整体能够很好的满足蛋白质变性、抑菌防腐、原色保存、快速渗透等要求，使用效果好。
实施例1
一种解剖教学标本用保色固定液，由以下重量份数的组分构成：十二烷基硫酸钠2.5份、尿素12份、山梨酸钾0.5份、柠檬酸0.3份、1,2-丙二醇20份、三聚磷酸钠0.6份、抗坏血酸0.5份、l-半胱氨酸0.2份、柑橘类水果果皮提取物1份、茶渣提取物1.2份，蒸馏水65份。
一种解剖教学标本用保色固定液的制备方法，包括以下步骤：
（1）柑橘类水果果皮提取物的制备
取柑橘类水果的果皮，洗净晾干后，置于破碎机中破碎成浆料，之后，向该浆料中加入其质量0.6%的纤维素酶和其质量0.3%的果胶酶，搅拌均匀后，于45℃温度条件下进行酶解处理2h，在酶解处理的过程中，每间隔30min进行超声波处理25s，之后，在不断搅拌条件下，向所得酶解产物中加入naoh溶液，直至所得混合物的ph为10.5，然后进行真空抽滤，取滤液，并在不断搅拌条件下，辅助进行频率为60khz的超声波振荡处理，向滤液中加入酸碱调节剂醋酸溶液或磷酸溶液，调节滤液的ph为2.5，取下层沉淀，蒸馏水反复冲洗并干燥后，即得柑橘类水果果皮提取物，备用；
（2）茶渣提取物的制备
取一次冲泡后的新鲜茶渣，摊晒晾干后，置于微波反应器中，调节微波功率为700w，进行微波处理110s，然后，将所得茶渣粉碎成粒径为0.5㎜的粉末，并向所得粉末中加入其质量4倍的乙醇溶液，充分搅拌混合后，在超声波辅助条件下进行回流提取1.5h，取高于80℃的馏分，即得茶渣提取物，备用；
（3）保色固定液的制备
a按照上述重量份数，分别称取十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、1,2-丙二醇、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、蒸馏水以及步骤（1）制得的柑橘类水果果皮提取物和步骤（2）制得的茶渣提取物，备用；
b取步骤a所称取的一半的蒸馏水，并向其中加入十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸和茶渣提取物，充分搅拌溶解后，制得中间溶液，备用；
c取步骤a所称取的1,2-丙二醇和柑橘类水果果皮提取物，充分混合均匀后，加入到步骤b制得的中间溶液中，搅拌均匀后，将步骤a称取的另一半蒸馏水加入其中，充分混合后，即得成品保色固定液。
实施例2
一种解剖教学标本用保色固定液，由以下重量份数的组分构成：十二烷基硫酸钠2份、尿素15份、山梨酸钾0.3份、柠檬酸0.2份、1,2-丙二醇18份、三聚磷酸钠0.7份、抗坏血酸0.4份、l-半胱氨酸0.1份、柑橘类水果果皮提取物1.3份、茶渣提取物1份，蒸馏水60份。
一种解剖教学标本用保色固定液的制备方法，包括以下步骤：
（1）柑橘类水果果皮提取物的制备
取柑橘类水果的果皮，洗净晾干后，置于破碎机中破碎成浆料，之后，向该浆料中加入其质量0.7%的纤维素酶和其质量0.2%的果胶酶，搅拌均匀后，于40℃温度条件下进行酶解处理2.5h，在酶解处理的过程中，每间隔30min进行超声波处理30s，之后，在不断搅拌条件下，向所得酶解产物中加入naoh溶液，直至所得混合物的ph为10，然后进行真空抽滤，取滤液，并在不断搅拌条件下，辅助进行频率为65khz的超声波振荡处理，向滤液中加入酸碱调节剂醋酸溶液或磷酸溶液，调节滤液的ph为3，取下层沉淀，蒸馏水反复冲洗并干燥后，即得柑橘类水果果皮提取物，备用；
（2）茶渣提取物的制备
取一次冲泡后的新鲜茶渣，摊晒晾干后，置于微波反应器中，调节微波功率为650w，进行微波处理100s，然后，将所得茶渣粉碎成粒径为0.3㎜的粉末，并向所得粉末中加入其质量5倍的乙醇溶液，充分搅拌混合后，在超声波辅助条件下进行回流提取2h，取高于80℃的馏分，即得茶渣提取物，备用；
（3）保色固定液的制备
a按照上述重量份数，分别称取十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、1,2-丙二醇、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、蒸馏水以及步骤（1）制得的柑橘类水果果皮提取物和步骤（2）制得的茶渣提取物，备用；
b取步骤a所称取的一半的蒸馏水，并向其中加入十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸和茶渣提取物，充分搅拌溶解后，制得中间溶液，备用；
c取步骤a所称取的1,2-丙二醇和柑橘类水果果皮提取物，充分混合均匀后，加入到步骤b制得的中间溶液中，搅拌均匀后，将步骤a称取的另一半蒸馏水加入其中，充分混合后，即得成品保色固定液。
实施例3
一种解剖教学标本用保色固定液，由以下重量份数的组分构成：十二烷基硫酸钠3份、尿素10份、山梨酸钾0.7份、柠檬酸0.5份、1,2-丙二醇23份、三聚磷酸钠0.5份、抗坏血酸0.6份、l-半胱氨酸0.3份、柑橘类水果果皮提取物0.8份、茶渣提取物1.5份，蒸馏水67份。
一种解剖教学标本用保色固定液的制备方法，包括以下步骤：
（1）柑橘类水果果皮提取物的制备
取柑橘类水果的果皮，洗净晾干后，置于破碎机中破碎成浆料，之后，向该浆料中加入其质量0.3%的纤维素酶和其质量0.4%的果胶酶，搅拌均匀后，于50℃温度条件下进行酶解处理1.5h，在酶解处理的过程中，每间隔30min进行超声波处理20s，之后，在不断搅拌条件下，向所得酶解产物中加入naoh溶液，直至所得混合物的ph为11，然后进行真空抽滤，取滤液，并在不断搅拌条件下，辅助进行频率为55khz的超声波振荡处理，向滤液中加入酸碱调节剂醋酸溶液或磷酸溶液，调节滤液的ph为2，取下层沉淀，蒸馏水反复冲洗并干燥后，即得柑橘类水果果皮提取物，备用；
（2）茶渣提取物的制备
取一次冲泡后的新鲜茶渣，摊晒晾干后，置于微波反应器中，调节微波功率为750w，进行微波处理120s，然后，将所得茶渣粉碎成粒径为0.8㎜的粉末，并向所得粉末中加入其质量3倍的乙醇溶液，充分搅拌混合后，在超声波辅助条件下进行回流提取1h，取高于80℃的馏分，即得茶渣提取物，备用；
（3）保色固定液的制备
a按照上述重量份数，分别称取十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、1,2-丙二醇、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸、蒸馏水以及步骤（1）制得的柑橘类水果果皮提取物和步骤（2）制得的茶渣提取物，备用；
b取步骤a所称取的一半的蒸馏水，并向其中加入十二烷基硫酸钠、尿素、山梨酸钾、柠檬酸、三聚磷酸钠、抗坏血酸、l-半胱氨酸和茶渣提取物，充分搅拌溶解后，制得中间溶液，备用；
c取步骤a所称取的1,2-丙二醇和柑橘类水果果皮提取物，充分混合均匀后，加入到步骤b制得的中间溶液中，搅拌均匀后，将步骤a称取的另一半蒸馏水加入其中，充分混合后，即得成品保色固定液。
试验检测
实验例1
采用本发明的保色固定液和市售常规固定液（品牌：维格斯，生产厂家：广州维格斯生物科技有限公司）进行对比实验。
具体实验方式为：对同样大小的3份兔尸体剥皮、清除脂肪、残肉、结缔组织、污血等处理，用生理盐水清洗，之后分别封存于空白对照组无菌溶液中、常规对照组维格斯固定液和实验组本发明的保色固定液中保存固定。常温下放置5-7天，观察各组兔标本的性状。
其中，空白对照组兔标本组织发生腐化、产生较明显的腐臭味，部分组织脱落，溶液中有菌落生长；
常规对照组兔标本的肌肉和表皮有变白迹象，组织僵硬，溶液中有强烈刺激气味；
实验组兔标本无刺激性气味，呈芳香味，表皮组织完整性好，无腐臭味，无霉斑，色泽丰满，还原度高。
对于常规对照组和实验组的更长时间（12-24个月）的跟踪观察，发现对照组的标本颜色逐渐暗淡，发黑，固定液中有菌落生产，部分组织发生微腐化。而实验组的兔标本，色彩、纹理等表观性状无变化，且无发霉、发臭现象发生，散发淡淡芳香味。防腐保色效果优良。
实验例2
采用本发明的保色固定液和市售常规固定液（品牌：维格斯，生产厂家：广州维格斯生物科技有限公司）进行对比实验。
具体实验方式为：对同样大小的2份猪脾脏，谨慎清除脂肪、结缔组织、污血等，采用生理盐水清洗干净，然后在对照组维格斯固定液和实验组本发明的保色固定液中保存固定一周。之后，经梯度酒精脱水，进真空箱，在-0.1大气压的负压环境，在有机硅橡胶内塑化1个月后，在密闭烘箱内由固化剂固化，制成塑化标本。常温下放置6-9个月，观察两组塑化标本的性状。
其中，常规对照组猪脾脏标本的表面发生颜色变暗和局部褪色现象，且组织僵硬，完整性差。
实验组猪脾脏标本表皮组织完整性好，色泽鲜亮、丰满，还原度高。长期保存后仍无霉变、变味现象。
试验结论：由上述实验可知，本发明制备的保色固定液在抗菌、抑菌，保色时间、标本还原度等多个指标上，均优于现有技术中的常规固定液。保色时间更长，动物标本还原度更高，且对于动物标本的组织器官无任何破坏、发暗、变色作用，自然状态保持度高，提高了动物浸制标本的制作质量和制作效率，降低了制作和护理成本，其无毒副作用，安全可靠性高。