本发明涉及甜菜碱，尤其是一种检测甜菜碱含量的方法，属于化学分析
技术领域：
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背景技术：
：维生素b12(vitaminb12)为b族维生素之一，又叫钴胺素，是一类含钴的复杂有机化合物。分子结构是以钴离子为中心的咕啉环和5,6-二甲基苯并咪唑为碱基组成的核苷酸。自然界中的维生素b12都是微生物合成的,高等动植物不能制造维生素b12，维生素b12是唯一的一种需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素。维生素b12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞,防止恶性贫血、防止大脑神经受到破坏。在利用脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12的过程中，甜菜碱是产物合成的前体,但高浓度的甜菜碱对细胞生长会产生抑制作用,维持合适的较低浓度的甜菜碱有利于维生素b12向胞外释放,尤其在产物大量合成期,低浓度甜莱碱能够明显促进胞外产物的积累，因此将发酵液中甜菜碱浓度控制在适宜水平对维生素b12的高效生长有着重要的意义。甜菜碱的化学名称为1-羧基一n,n,n-三甲基乙内酯，分子式为ch1no，化学结构上与氨基酸相似，属于季铵碱类物质。甜菜碱具有多种功能，作为甲基供体,具有促进动物脂肪代谢，缓和应激，调节渗透压增进食欲、稳定维生素、预防球虫病、提高饲料利用率等功效。目前甜菜碱的检测方法有酸碱滴定法、比色法、重量法、凯氏定氮法、高氯酸非水滴定法、分光光度法等，这些检测方法主要用于高浓度、高纯度甜菜碱产品的含量检测，不适用于基质复杂的发酵液中甜菜碱含量测定。由于发酵液主要由菌种、培养基、前体供体、玉米糖浆、葡萄糖麦芽糖浆、甜菜碱等多种配料组成，在其发酵过程中，又会有新的中间产物、代谢产物、降解产物、杂质等形成，且在发酵过程的不同周期节点，其成份组成和含量组成处于一直不断的变化之中，同时不同周期节点的基质组成对甜菜碱的影响也存在巨大差异性。发酵液成分复杂，基质干扰因素多，因此甜菜碱含量检测一直是检测工作者努力解决的课题。目前针对发酵液中甜菜碱的检测，可见报道的有液相色谱-示差检测器法和液相色谱-紫外检测器法两种方法。液相色谱-示差检测器法采用示差检测器和十八烷基硅胶色谱柱，该类型检测器对检测的系统温度和环境温度都很敏感，造成检测系统稳定性差；仪器工作前通常需要在恒温环境中过夜平衡，造成检测工作效率低下；由于发酵液基质复杂，示差检测器和烷基硅胶色谱柱检测条件下，受基质干扰影响大，分离效果较差，样品检测结果存在较大误差；同时发酵液中的代谢产物及蛋白质等对示差检测器光学流通池的污染严重，不易清除，影响仪器的准确度，降低仪器的使用寿命。液相色谱-紫外检测器法所用检测器为紫外检测器(或dad检测器)，方法采用的检测波长多为低紫外波长190nm-205nm，所用流动相为甲醇-乙酸铵水溶液。甲醇的截止波长是205nm，在这个波长段下，甲醇及很多物质都有较强的紫外吸收，造成背景干扰大，色谱峰的起止不明确，同时由于发酵液中基质复杂，基质的干扰峰与甜菜碱峰很难有效分离，也就无法准确测定甜菜碱的峰面积，造成检测结果准确性差。专利cn105067741a《一种甜菜碱含量的检测方法》，采用的液相色谱-紫外dad检测器和十八烷基硅胶色谱柱法，检测波长为低紫外波长190nm-196nm，流动相为离子对试剂和磷酸盐溶液全水混合流动相。全水型流动相通常会对烷基硅胶色谱柱寿命造成损伤，离子对试剂流动相通常需要较长的系统平衡时间，系统的后期清洗也很费时。实施例中样品均为高纯度、高含量甜菜碱(50％)，对于测定发酵液中低含量、复杂基质样品同样存在背景吸收高，基线不稳定，基质干扰峰与甜菜碱峰很难有效分离的问题，因此该专利方法也无法准确测定发酵液中甜菜碱含量。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题是提供一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，能消除检测背景的干扰、提高抗基质干扰能力、提高检测结果的准确性及可靠性。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，利用高效液相色谱法进行检测，高效液相色谱条件如下：色谱柱：反相氨基色谱柱，检测器：蒸发光散射检测器，流动相：乙腈和水混合组成的梯度流动相。本发明技术方案的进一步改进在于所述高效液相色谱还包括如下条件：色谱柱柱温：38～42℃，进样体积：10～20μl，检测器漂移管温度：80～110℃，检测器气体流速：1.8～2.2l/min。本发明技术方案的进一步改进在于：所述反相氨基色谱柱的规格为250×4.6mm，粒径4.5～5.5μm。本发明技术方案的进一步改进在于：所述流动相中加入三氟乙酸，三氟乙酸在流动相中的加入量为流动相体积的0.05～0.2％。本发明技术方案的进一步改进在于所述流动相中各成分的配比、加入时间及流量按如下进行：0～2min时，流动相中水的体积占比为58～62％、乙腈的体积占比为38～42，流量为0.7～0.9ml/min；2～5min时，流动相中水的体积占比为43～47％、乙腈的体积占比为53～57，流量为0.7～0.9ml/min；5～6min时，流动相中水的体积占比为28～32％、乙腈的体积占比为68～72，流量为0.7～0.9ml/min；6～11min时，流动相中水的体积占比为23～27％、乙腈的体积占比为73～77，流量为0.9～1.1ml/min；11～30min时，流动相中水的体积占比为58～62％、乙腈的体积占比为38～42，流量为0.7～0.9ml/min。本发明技术方案的进一步改进在于包括如下过程：a.配制不同浓度的甜菜碱标准溶液，利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线，b.取发酵液样品，然后利用有机溶剂进行预处理，c.利用高效液相色谱法测定预处理后发酵液样品的峰面积，然后对应甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线得到发酵液中甜菜碱的浓度，步骤a与步骤c中高效液相色谱条件相同。本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤a中甜菜碱标准溶液的浓度范围为0.1～5.0mg/ml。本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤a中配制甜菜碱标准溶液时所用溶剂为水或乙腈-水混合溶液，乙腈-水混合溶液中乙腈和水的体积比为45～55:55～45。本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤b中预处理是将有机溶剂加入发酵液样品中，超声混匀2～3min后再离心，然后取上清液过0.45μm滤膜备用。本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤b中有机溶剂为乙腈-水混合溶液，乙腈与水的体积比为45～55:55～45；发酵液样品与有机溶剂的体积比为1:3.5～4.5。由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：本发明的检测方法抗基质干扰能力强，甜菜碱与基质的分离度高，可完全消除发酵液中复杂基质的干扰；检测方法简单快捷、稳定性好，且结果准确可靠、可重复性好。本发明利用高效液相色谱法建立了甜菜碱溶液浓度与峰面积之间的标准曲线，方法简单、准确、可重复性好，并且当甜菜碱浓度在0.1～5.0mg/ml范围内时有良好的线性关系，其线性相关系数能达到0.9994甚至更高。配制甜菜碱标准溶液时使用的溶剂为水或乙腈-水混合溶液，无论溶剂为水还是乙腈-水混合溶液，其溶剂吸收峰与甜菜碱吸收峰分离度良好，不会影响甜菜碱的吸收峰，并且吸收峰基线平稳，结果准确可靠；当溶剂为水时，与使用乙腈-水混合溶液相比，还节约了有机化合物的使用量，进而降低了企业生产成本、降低了废液排放量、降低了环境污染。本发明所用流动相中三氟乙酸的加入，以及梯度流动相的选择使得甜菜碱与发酵液中其他杂质的分离度良好，并且吸收峰基线更平稳，保证了检测结果的准确性。本发明流动相中加入三氟乙酸(tfa)作为改良剂，改良剂三氟乙酸(tfa)的加入量为流动相体积的0.05～0.2％，流动相采用梯度流动相，在此最佳的改良剂加入量范围内以及流动相梯度范围内改变了流动相的极性，流动相中的改良剂三氟乙酸通过与氨丙基键合相和极性表面以多种模式相互作用，调整了甜菜碱及其他杂质在氨基柱上的选择性，改变了甜菜碱以及发酵液中其他杂质的保留时间，使得除甜菜碱之外的杂质如发酵液培养基、菌种、葡萄糖浆等吸附性降低，最先从氨基柱上被洗脱下来，而甜菜碱最后被洗脱下来，甜菜碱的吸收峰与其他杂质的吸收峰分离效果好，避免了其他杂质对甜菜碱的干扰，保证了检测结果的准确性。本发明将发酵液样品先利用有机溶剂进行预处理，消除了发酵液中蛋白质对检测结果的干扰。本发明将发酵液样品与乙腈-水混合溶液按体积比1:3.5～4.5进行混合，乙腈-水混合溶液能降低发酵液样品中蛋白质类物质的溶解度，从而使蛋白质类物质沉降下来，通过后续的离心，上清液再过0.45μm滤膜，将发酵液样品中的蛋白质类物质完全分离出来，在后续的高效液相色谱检测过程中降低了蛋白质类物质对色谱柱、仪器系统的污染，使发酵液样品中基质物质种类大幅减少，降低了色谱柱的分离压力，降低了发酵液中复杂基质对检测结果的干扰，保证了检测结果的准确性。本发明的检测方法对仪器条件和环境条件适应性好。本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定发酵液中甜菜碱的含量，与使用紫外检测器相比，避免了发酵液基质或流动相物质在所选波长范围内的强烈吸收对甜菜碱吸收峰的干扰；与采用示差检测器相比，蒸发光检测器对检测的系统温度和环境温度适应性强，检测系统稳定性高，并且蒸发光检测器使用前无需在恒温环境中过夜平衡或其他复杂的预处理，因而使得检测工作效率较高。本发明的检测方法抗基质干扰能力强、甜菜碱与发酵液基质分离度高。本发明通过优化高效液相色谱法检测条件，使用反相氨基色谱柱作为固定相，乙腈-水混合溶液为流动相，流动相优选色谱纯乙腈与纯化水按一定体积比混合而成的梯度流动相，将经过预处理后的发酵液样品中的甜菜碱、糖分等基质较好的分离开来，结合蒸发光散射器进行检测，以保留时间定性，以峰面积定量，采用外标法计算峰面积，发酵液基质吸收峰与甜菜碱吸收峰能较好的分离开来，从而消除了复杂基质对甜菜碱含量检测的干扰，提高了检测结果的准确性及可靠性。本发明检测方法简单、快速。本发明只需利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线，然后再检测发酵液样品中甜菜碱的吸收峰面积，对应标准曲线即能得到发酵液中甜菜碱的含量；并且标准曲线只需建立一次，可持续用于发酵液样品中甜菜碱含量的检测；此外，本发明所用到的仪器设备、试剂等均是化学领域常用物品，检测成本低。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，利用高效液相色谱法进行检测，具体检测步骤如下：a.配制不同浓度的甜菜碱标准溶液，利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线。具体为以保留时间定性，峰面积定量，建立甜菜碱标准溶液浓度和峰面积对数关系的校正标准曲线，要求曲线的相关系数≥0.999。其中配制甜菜碱标准溶液时所用溶剂为水或乙腈-水混合溶液，其中乙腈-水混合溶液中乙腈和水的体积比为45～55:55～45，配制而成的甜菜碱标准溶液的浓度范围为0.1～5.0mg/ml。b.取发酵液样品，利用有机溶剂进行预处理，有机溶剂为乙腈-水混合溶液，其中乙腈与水的体积比为45～55:55～45，发酵液样品与有机溶剂的体积比为1:3.5～4.5；将有机溶剂加入发酵液样品中后，超声混匀2～3min后再离心，然后取上清液过0.45μm滤膜备用。c.利用高效液相色谱法测定预处理后发酵液样品的峰面积，然后对应甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线得到发酵液中甜菜碱的浓度。其中步骤a与步骤c中高效液相色谱条件相同，具体条件如下：色谱柱：反相氨基色谱柱，规格为250×4.6mm，粒径4.5～5.5μm检测器：蒸发光散射检测器，流动相：乙腈和水混合组成的梯度流动相，色谱柱柱温：38～42℃，进样体积：10～20μl，检测器漂移管温度：80～110℃，检测器气体流速：1.8～2.2l/min。其中流动相中加入改良剂，改良剂为三氟乙酸，改良剂在流动相中的加入量为流动相体积的0.05～0.2％，流动相中乙腈和水的配比、流动相的加入时间及流量按下表进行：时间(min)水(％)乙腈(％)流量(ml/min)0～258～6238～420.7～0.92～543～4753～570.7～0.95～628～3268～720.7～0.96～1123～2773～770.9～1.111～3058～6238～420.7～0.9实施例1一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，利用高效液相色谱法进行检测，具体检测步骤如下：a.配制不同浓度的甜菜碱标准溶液，利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线。a-1.称取甜菜碱或盐酸盐甜菜碱标准品精密称取标品盐酸盐甜菜碱0.6560g(105℃烘干)溶于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即为甜菜碱5.00mg/ml标准溶液，作为标准储备液。a-2.甜菜碱系列标准溶液配制分别精确吸取甜菜碱标准储备液(a-1中)0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml、10.0ml于10ml容量瓶中，用纯水定容，混匀。配制成质量浓度分别为0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml、2.50mg/ml、5.00mg/ml的标准系列。a-3.利用高效液相色谱法对上述标准系列进行测定，以保留时间定性，峰面积定量，以峰面积的对数为纵坐标，甜菜碱溶液的浓度的对数为横坐标，建立标准校正曲线。高效液相色谱具体条件如下：色谱柱：反相氨基色谱柱，规格为250×4.6mm，粒径5.0μm检测器：蒸发光散射检测器，流动相：乙腈和水混合组成的梯度流动相，色谱柱柱温：40℃，进样体积：15μl，检测器漂移管温度：95℃，检测器气体流速：2.0l/min。其中流动相中加入改良剂，改良剂为三氟乙酸，改良剂在流动相中的加入量为流动相体积的0.1％，流动相中乙腈和水的配比、流动相的加入时间及流量按下表进行：表1其中利用高效液相色谱法检测之前需进行液相仪器检测系统重现性测定，具体为取低浓度点标液0.20mg/ml和高浓度点标液5.00mg/ml分别进样6针，进样体积15μl，计算标准平均偏差rsd≤1.0％，然后对甜菜碱标准系列进行检测。b.按不同的发酵周期节点即不同的甜菜碱含量水平、不同的基质组成，分高、中、低浓度节点各取三组，每组三个共9个样品，其中每组2个平行测定，一个加标回收质控样品。取每个样品1.0ml到带有刻度的10ml离心管中，加入4ml乙腈-水(乙腈与水的体积比为50:50)混合溶液，在快速混匀器上混匀30s，超声2.5min，于8000r/min离心10min，然后取上清液过0.45μm滤膜备用。c.利用高效液相色谱法测定预处理后发酵液样品的峰面积，然后对应甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线得到发酵液中甜菜碱的浓度。其中步骤a与步骤c中高效液相色谱条件相同。检测结果如表2所示：表2上述样品检测，每组平行样相对平均偏差＜1％，回收率在98％～101％，回收率良好，完全可以满足生产对甜菜碱控制的要求。实施例2一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，利用高效液相色谱法进行检测，具体检测步骤如下：a.配制不同浓度的甜菜碱标准溶液，利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线。a-1.称取甜菜碱或盐酸盐甜菜碱标准品精密称取标品盐酸盐甜菜碱0.6560g(105℃烘干)溶于100ml容量瓶中，用乙腈-水混合溶液稀释至刻度，其中乙腈和水的体积比为55:45，摇匀即为甜菜碱5.00mg/ml标准溶液，作为标准储备液。a-2.甜菜碱系列标准溶液配制分别精确吸取甜菜碱标准储备液(a-1中)0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml、10.0ml于10ml容量瓶中，用乙腈-水混合溶液稀释至刻度，其中乙腈和水的体积比为55:45，混匀。配制成质量浓度分别为0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml、2.50mg/ml、5.00mg/ml的标准系列。a-3.利用高效液相色谱法对上述标准系列进行测定，以保留时间定性，峰面积定量，以峰面积的对数为纵坐标，甜菜碱溶液的浓度的对数为横坐标，建立标准校正曲线。高效液相色谱具体条件如下：色谱柱：反相氨基色谱柱，规格为250×4.6mm，粒径4.5μm检测器：蒸发光散射检测器，流动相：乙腈和水混合组成的梯度流动相，色谱柱柱温：38℃，进样体积：10μl，检测器漂移管温度：80℃，检测器气体流速：1.8l/min。其中流动相中加入改良剂，改良剂为三氟乙酸，改良剂在流动相中的加入量为流动相体积的0.05％，流动相中乙腈和水的配比、流动相的加入时间及流量按下表进行：表3时间(min)水(％)乙腈(％)流量(ml/min)0～258420.72～543570.75～628720.76～1123770.911～3058420.7其中利用高效液相色谱法检测之前需进行液相仪器检测系统重现性测定，具体为取低浓度点标液0.20mg/ml和高浓度点标液5.00mg/ml分别进样6针，进样体积10μl，计算标准平均偏差rsd≤1.0％，然后对甜菜碱标准系列进行检测。b.按不同的发酵周期节点即不同的甜菜碱含量水平、不同的基质组成，分高、中、低浓度节点各取三组，每组三个共9个样品，其中每组2个平行测定，一个加标回收质控样品。取每个样品1.0ml到带有刻度的10ml离心管中，加入4ml乙腈-水(乙腈与水的体积比为45:55)混合溶液，在快速混匀器上混匀30s，超声2min，于8000r/min离心10min，然后取上清液过0.45μm滤膜备用。c.利用高效液相色谱法测定预处理后发酵液样品的峰面积，然后对应甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线得到发酵液中甜菜碱的浓度。其中步骤a与步骤c中高效液相色谱条件相同。检测结果如下所示：表4样品编号样品中含量mg/ml加标量mg/ml加标后含mg/ml回收率％1-10.22///1-20.22///1-加标0.220.220.441002-11.02///2-21.04///2-加标1.030.511.52983-13.19///3-23.15///3-加标3.171.014.18100上述样品检测，每组平行样相对平均偏差＜1％，回收率在98％～100％，回收率良好，完全可以满足生产对甜菜碱控制的要求。实施例3一种检测发酵液中甜菜碱含量的方法，利用高效液相色谱法进行检测，具体检测步骤如下：a.配制不同浓度的甜菜碱标准溶液，利用高效液相色谱法建立甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线。a-1.称取甜菜碱或盐酸盐甜菜碱标准品精密称取精密称取0.5768g一水甜菜碱溶于100ml容量瓶中，用乙腈-水混合溶液稀释至刻度，其中乙腈和水的体积比为45:55，摇匀即为甜菜碱5.00mg/ml标准溶液，作为标准储备液。a-2.甜菜碱系列标准溶液配制分别精确吸取甜菜碱标准储备液(a-1中)0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml、10.0ml于10ml容量瓶中，用乙腈-水混合溶液稀释至刻度，其中乙腈和水的体积比为45:55，混匀。配制成质量浓度分别为0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml、2.50mg/ml、5.00mg/ml的标准系列。a-3.利用高效液相色谱法对上述标准系列进行测定，以保留时间定性，峰面积定量，以峰面积的对数为纵坐标，甜菜碱溶液的浓度的对数为横坐标，建立标准校正曲线。高效液相色谱具体条件如下：色谱柱：反相氨基色谱柱，规格为250×4.6mm，粒径5.5μm检测器：蒸发光散射检测器，流动相：乙腈和水混合组成的梯度流动相，色谱柱柱温：42℃，进样体积：20μl，检测器漂移管温度：110℃，检测器气体流速：2.2l/min。其中流动相中加入改良剂，改良剂为三氟乙酸，改良剂在流动相中的加入量为流动相体积的0.2％，流动相中乙腈和水的配比、流动相的加入时间及流量按下表进行：表5时间(min)水(％)乙腈(％)流量(ml/min)0～262380.92～547530.95～632680.96～1127731.111～3062380.9其中利用高效液相色谱法检测之前需进行液相仪器检测系统重现性测定，具体为取低浓度点标液0.20mg/ml和高浓度点标液5.00mg/ml分别进样6针，进样体积20μl，计算标准平均偏差rsd≤1.0％，然后对甜菜碱标准系列进行检测。b.按不同的发酵周期节点即不同的甜菜碱含量水平、不同的基质组成，分高、中、低浓度节点各取三组，每组三个共9个样品，其中每组2个平行测定，一个加标回收质控样品。取每个样品1.0ml到带有刻度的10ml离心管中，加入4ml乙腈-水(乙腈与水的体积比为55:45)混合溶液，在快速混匀器上混匀30s，超声3min，于8000r/min离心10min，然后取上清液过0.45μm滤膜备用。c.利用高效液相色谱法测定预处理后发酵液样品的峰面积，然后对应甜菜碱溶液浓度与峰面积的标准曲线得到发酵液中甜菜碱的浓度。其中步骤a与步骤c中高效液相色谱条件相同。检测结果如下所示：表6样品编号样品中含量mg/ml加标量mg/ml加标后含mg/ml回收率％1-10.20///1-20.20///1-加标0.200.210.40982-11.00///2-21.02///2-加标1.010.501.511003-13.17///3-23.13///3-加标3.151.004.1499上述样品检测，每组平行样相对平均偏差＜1％，回收率在98％～100％，回收率良好，完全可以满足生产对甜菜碱控制的要求。当前第1页12