本发明涉及一种食品检测方法，具体涉及一种酱油中酪胺含量的超高效液相色谱检测方法。
背景技术：
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酪胺(tyramine)又名对羟基苯乙胺，是一类含氮低分子的生物胺。生物胺作为一类生理活性物质，参与生物体内的代谢活动。生物胺广泛存在于各类食品中，在富含蛋白质和氨基酸的食品中相对更多，特别是鱼类及其制品、乳酪、肉制品和发酵类食品。食品中的酪胺主要是由相关微生物产生的脱羧酶催化脱去酪氨酸的羧基而产生，或者是醛和酮通过氨基化和转胺作用产生。因此食品中的生物胺有两个来源，一是由原材料带入，二是微生物的脱羧反应产生的。因为传统的发酵过程难以控制、机理不明晰，天然发酵食品中的生物胺问题愈发受到人们关注。过量摄入生物胺，可能会引发头痛、头晕、恶心、呼吸窘迫、心悸等各种中毒症状。所有生物胺中，对人类健康影响最大的是组胺和酪胺。酪胺具有增高血压的作用，过多摄取酪胺会在体内消耗单胺氧化酶抑制剂，从而引起严重的副作用，这就是酪胺又称干酪毒素的原因。酪胺对人体的危害还表现在促进末梢血管收缩，剌激心律加快，增加血糖浓度，消除神经系统中的去甲肾上腺素，从而引发偏头疼。人体口服酪胺超过100mg可引起偏头痛，超过1080mg可引起中毒性肿胀，欧盟规定食品中酪胺含量不得超过100-800mg/kg。
酱油是一种有悠久历史的食品，用于佐餐和调味，因其风味独特、味道鲜美、营养丰富而被广泛制作和食用。但酱油的制作普遍采用自然发酵的方法，发酵菌种复杂，因此存在较高的微生物源性生物胺的安全隐患。出于对食品安全的考虑，人们应尽可能降低生物胺的摄入量，而检测和监控食品中生物胺的含量就成为当务之急。由于酪氨酸在发酵过程中产生酪胺，因此对酱油中酪胺的分析不仅可以保障食品安全，还可以获得与食品生产和发酵工艺过程相关的有用信息。
生物胺的检测方法有气相色谱-串联质谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等等,这些方法具有处理步骤较为繁琐,分析时间长，不易操作等缺点。本发明通过超高效液相色谱法(ultraperformanceliquidchromatography,uplc)测定酪胺的检测方法,通过使用小粒径填料的色谱柱,可以获得更好的分离效果和更短的分析时间,同时简化处理步骤。因此本发明方法具有样品用量少，时间短，方法线性良好，操作简单，重现性好，准确度高等优点。
技术实现要素：
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本发明目的在于简化样品预处理步骤，缩短样品检测时间，研究设计采用uplc检测方法快速准确地测定酱油中酪胺含量。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
(1)标准溶液的制备：精密称取酪胺用0.1m盐酸配成浓度为1mg·ml-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。使用的梯度标准工作溶液用0.1m盐酸稀释到所需浓度。精密称取内标用去离子水配制成浓度为50μg·ml-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。
(2)样品溶液的制备：酱油样品用去离子水稀释5-20倍，微孔滤膜0.22μm过滤；加50μg·ml-1内标溶液100μl，进行衍生化反应。
(3)衍生化反应：取标准溶液或样品100μl，分别加ph10的饱和碳酸氢钠100μl和5-10mg·ml-1丹磺酰氯200μl(溶剂为丙酮)，在50-60℃下避光反应10-20min。结束后加氨水100μl终止反应20-30min。加乙腈定容到1ml。微孔滤膜0.22μm过滤。滤液上柱检测。
(4)检测：采用watersacquityⅰ-class超高效液相色谱仪，c18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3ml·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μl，柱温55℃，流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，检测器：pda检测器。采用内标法以目标分析物峰面积和内标峰面积的比值进行定量计算样品中酪胺的含量。
所述步骤(1)制备混合梯度标准工作溶液的具体过程如下:将浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液用0.1m盐酸配制浓度梯度为50、100、200、300、400、500μg·ml-1的标准工作溶液,每个浓度的混合标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为50μg·ml-1。
uplc的洗脱程序为：流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，采用梯度洗脱，在0-20min,a50-85％,b50-15％,20-21min,a85-50％,b15-50％,21-25min,a50％,b50％。
本发明与文献相比,分离方法处理过程简单，分析时间短，建立的方法简单可靠，可以应用于酱油中酪胺含量的检测；该方法对样品分析简单便捷，检出限低，灵敏度高，重复性和回收率好。
附图说明
图1为加有内标的标准溶液的uplc色谱峰图；
图2为加有内标的酱油样品的uplc色谱峰图；
图3为加有内标和标准溶液的酱油样品的uplc色谱峰图；
图4为酪胺的标准曲线。
具体实施方式
下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
(a)样品溶液的预处理：取待检测酱油样品5ml用去离子水稀释10倍，微孔滤膜0.22μm过滤，滤液4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入50μg·ml-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整ph值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的8mg·ml-1丹磺酰氯200μl，在55℃下避光进行衍生化反应，反应15min。结束后加氨水100μl终止反应25min。加乙腈定容到1ml。微孔滤膜0.22μm过滤，滤液上柱检测。
(c)uplc的检测条件：采用watersacquityⅰ-class超高效液相色谱仪，c18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3ml·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μl，柱温55℃，流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，检测器：pda检测器。uplc的洗脱程序为：流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，采用梯度洗脱，在0-20min,a50-85％,b50-15％,20-21min,a85-50％，b15-50％，21-25min，a50％，b50％。
(d)将步骤(c)测定数值代入酪胺标准品线性回归方程中计算，得到酱油样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100mg放于100ml棕色容量瓶中，用0.1m盐酸定容至刻度，即得浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100mg放于100ml容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1mg·ml-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为50μg·ml-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用。
将浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液用0.1m盐酸配制浓度梯度为50、100、200、300、400、500μg·ml-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为50μg·ml-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.22μm滤膜过滤后，取适量采用uplc进行检测，uplc法条件同步骤(c)；以峰面积的比值一浓度作为线性回归，得到酪胺标准品的线性回归方程。
实施例2
(a)样品溶液的预处理：取待检测酱油样品2ml用去离子水稀释20倍，微孔滤膜0.22μm过滤，滤液4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入50μg·ml-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整ph值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的5mg·ml-1丹磺酰氯200μl，在50℃下避光进行衍生化反应，反应20min。结束后加氨水100μl终止反应30min。加乙腈定容到1ml。微孔滤膜0.22μm过滤，滤液上柱检测。
(c)uplc的检测条件：采用watersacquityⅰ-class超高效液相色谱仪，c18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3ml·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μl，柱温55℃，流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，检测器：pda检测器。uplc的洗脱程序为：流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，采用梯度洗脱，在0-20min,a50-85％,b50-15％,20-21min,a85-50％,b15-50％,21-25min,a50％,b50％。
(d)将步骤(c)测定数值代入酪胺标准品线性回归方程中计算，得到酱油样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100mg放于100ml棕色容量瓶中，用0.1m盐酸定容至刻度，即得浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100mg放于100ml容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1mg·ml-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为50μg·ml-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用。
将浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液用0.1m盐酸配制浓度梯度为50、100、200、300、400、500μg·ml-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为50μg·ml-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.45μm滤膜过滤后，取适量采用uplc进行检测，uplc法条件同步骤(c)；以峰面积的比值一浓度作为线性回归，得到酪胺标准品的线性回归方程。
实施例3
(a)样品溶液的预处理：取待检测酱油样品10ml用去离子水稀释5倍，微孔滤膜0.22μm过滤，滤液4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入50μg·ml-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整ph值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的10mg·ml-1丹磺酰氯200μl，在60℃下避光进行衍生化反应，反应10min。结束后加氨水100μl终止反应20min。加乙腈定容到1ml。微孔滤膜0.22μm过滤，滤液上柱检测。
(c)uplc检测条件：采用watersacquityⅰ-class超高效液相色谱仪，c18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3ml·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μl，柱温55℃，流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，检测器：pda检测器。uplc的洗脱程序为：流动相a为乙腈，流动相b为去离子水，采用梯度洗脱，在0-20min,a50-85％,b50-15％,20-21min,a85-50％,b15-50％,21-25min,a50％,b50％。
(d)将步骤(c)测定数值代入酪胺标准品线性回归方程中计算，得到酱油样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100mg放于100ml棕色容量瓶中,用0.1m盐酸定容至刻度,即得浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100mg放于100ml容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1mg·ml-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为50μg·ml-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。
将浓度为1mg·ml-1的酪胺标准溶液用0.1m盐酸配制浓度梯度为50、100、200、300、400、500μg·ml-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为50μg·ml-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.22μm滤膜过滤后，取适量采用uplc进行检测，uplc法条件同步骤(c)；各浓度做3个平行，分别进样检测。以其中一次进样为例，得到的色谱峰图如图3所示。以峰面积之比值的平均值为横坐标，以对应的浓度为纵坐标，进行线性回归，得到回归曲线见图4。
uplc检测方法的分析参数见表1-3。
表1酪胺标准品的线性回归方程及相关参数
注:x：酪胺浓度(μg·ml-1)；y：峰面积比值；*检出限：信噪比(s/n)为3；**定量限：信噪比(s/n)为10。
表1和图4可以看出，得到的线性回归方程的r2为0.9997，线性稳定，误差小。从表1可知最低检出浓度为250ng·ml-1，检测限为50ng·ml-1，说明该方法的检出限低，符合痕量测定的要求。对同一样品连续进样8次测定结果进行计算其相对标准偏差为0.06％，说明仪器的精密度良好。对同一样品在连续3天内分别测定其相对标准偏差为0.20％，说明方法的稳定性好。
表2重复性和重现性实验
对标准溶液和酱油样品在同一天内连续测定6次，相对标准偏差分别为2.12和3.62％；对标准溶液和酱油样品在连续3天内每天测定1次，相对标准偏差为3.13和3.09％。结果说明该方法具有良好的重复性和重现性。
表3加标回收率实验
从表3可以可看出，该检测方法的平均回收率为87.3％，相对标准偏差为6.63％。
对从市场购买的5种酱油样品按照本发明方法检测，通过线性回归方程计算酪胺含量，结果如表4所示。
表45种酱油样品中酪胺的含量(mean±sd)(n＝3)
从表4可以看出，购买的五种酱油中酪胺的含量在166—792mg/l范围内，没有超出欧盟规定的标准要求。
本发明提供的uplc测定酱油中酪胺含量的方法，样品用量少，测定结果快速准确，分析时间快，溶剂载量少，实验结果表明，测定结果稳定，具有良好的专一性，精密度和回收率。具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合痕量测定的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。