本发明涉及药品质量检测
技术领域：
，是一种莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法。
背景技术：
：退行性骨关节炎(osteoarthritis,以下简称oa)指由于长期应力不均或中老年人而发生退行性变的骨关节炎，又称或骨性关节病。其发病机制目前尚不清晰，现代医学认为：此病系构成关节的软骨、椎间盘、韧带等软组织变性、退化，最终出现骨破坏，导致骨质增生、关节变性，患者出现关节肿胀、疼痛、活动受限等。有研究表明其发病机制以为细胞因子合成与分解的失衡是oa患者关节软骨损害的主要原因，其中尤以il1-β，tnf-α为重要.已发现il1-β、tnf-α不仅存在于骨性关节炎关节液中，而且在滑膜细胞和软骨细胞内的表达明显升高。这两种细胞因子能促进软骨细胞产生大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂失平衡，从而增强对软骨中ii型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，导致软骨发生进行性破坏。目前临床治疗方法包括：(1)物理疗法：热疗法、电疗法、磁疗法等，通过改善微循环，减轻慢炎症的发作；(2)药物疗法：非甾体抗炎药或糖皮质激素治疗、关节润滑剂、改善关节软骨代谢类药物等。这些药物可以改善软骨代谢、减轻组织炎症反应及减少炎性介质对组织的刺激，达到消炎和止痛的效果，但不良反应较多；(3)手术疗法：关节镜下膝关节冲洗和清除术、截骨术、关节置换术等，手术疗法适用于药物或物理治疗对病情控制不佳，严重影响日常生活的患者。莲威阿纳其颗粒(lianweianaqigranule，以下简称lwg)，是针对oa患者的一种新型中药复方制剂，其由雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾、鸡血藤、阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草、生白术、骨碎补和土鳖虫共12味药材组方而成。lwg方中12味药材所含化学物质众多，各药发挥自身药理活性作用的同时，又协同配合，相辅相成。现代药理研究表明雪莲中含有黄酮类(芦丁、槲皮素、高车前素等)和苯丙素类成分(绿原酸、紫丁香苷等)；肉苁蓉的活性成分有苯乙醇苷类、木脂素类、多种活性多糖、环烯醚萜类及生物碱等，松果菊苷和麦角甾苷(又名毛蕊花糖苷)是肉苁蓉中苯乙醇总苷的主要成分；桑椹的主要活性物质包括芦丁(黄酮类)、白黎芦醇(多酚类)、花色苷(酚类中的类黄酮类)、多糖等；骨碎补中含有黄酮类化合物(柚皮苷、新北美圣草苷、山奈酚、木犀草素等)、多酚类(原儿茶酸)、甲基丁香酚、β-2谷甾醇、豆甾醇等多种化学物质，主要活性物质为柚皮苷；阿纳其根含有黄酮类、墙草碱、挥发油等化学物质；鹿衔草的活性成分为黄酮类(槲皮素、金丝桃苷)、酚类(高熊果酚苷、鹿蹄草苷)、醌类(鹿蹄草素、大黄素)和环烯醚萜苷类(熊果酸、水晶兰苷)；仙灵脾又名淫羊藿，主要含有黄酮类(淫羊藿苷、宝霍苷)、苯丙素类(绿原酸、木脂素等)多糖、生物碱(木兰碱)、萜类化合物及微量元素等多种活性物质；威灵仙主要含有三萜皂苷、黄酮(槲皮素、甘草素)、苯丙素类(木脂素、香豆素等)、生物碱等成分；鸡血藤含有到黄酮、三萜和甾醇等多种成分；透骨草含有黄酮类、萘醌类、香豆素类、甾醇类、多肽类化合物及蛋白质等成分；土鳖虫主要活性成分包括多种活性蛋白质(酶)、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素、生物碱和脂溶性维生素等。上述莲威阿纳其颗粒剂中复杂的化学成分，依照传统做法，主要通过实施颗粒中少数几味药材的薄层鉴别和1-2个活性成分含量测定来控制lwg的质量已然不能满足需要。如何更加有效地控制lwg中药复方制剂的质量，需要我们课题组开发尝试。技术实现要素：本发明提供了一种莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有莲威阿纳其颗粒传统检测方法中，存在鉴别药材种类不多、少数活性成分含量测定的问题。本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法，包括莲威阿纳其颗粒有效成分的鉴别方法、莲威阿纳其颗粒有效成分含量的测定方法和莲威阿纳其颗粒中有效成分的药效学检测方法，其中，莲威阿纳其颗粒有效成分的鉴别方法采用莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法和莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法，莲威阿纳其颗粒有效成分含量的测定方法采用莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法，莲威阿纳其颗粒中有效成分的药效学检测方法采用莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法。下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：上述莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分为绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷。上述莲威阿纳其颗粒中七味主要药材为肉苁蓉、桑葚、天山雪莲、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、威灵仙。上述莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法按照下述步骤进行：第一步，称取0.1g莲威阿纳其颗粒，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒供试品溶液，称取0.1g莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液，称取0.01g莲威阿纳其颗粒中间体-水提物，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液；第二步，取莲威阿纳其颗粒供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末供试品溶液，根据色谱条件分别得到莲威阿纳其颗粒、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物、莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末的色谱图；第三步，分别建立莲威阿纳其颗粒供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液的高效液相化学指纹图谱，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统的数据匹配功能，标定共有20个共有指纹峰,确定莲威阿纳其颗粒中含有绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷五种成分。上述莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物为莲威阿纳其颗粒中七味主要药材经乙醇提取干燥后得到的醇提浸膏干粉，莲威阿纳其颗粒中间体-水提物为阿纳其根、桑椹药材及醇提药渣经水提取干燥后所得的粗多糖干粉，莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末为土鳖虫药材粉末和骨碎补药材粉末。上述莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，配制薄层色谱鉴别供试品溶液；第二步，配制薄层色谱鉴别阴性样品溶液；第三步，配制薄层色谱鉴别对照药材溶液；第四步，配制薄层色谱鉴别对照品溶液；第五步，配制显色剂；第六步，进行薄层色谱鉴别。上述莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法按照下述步骤进行：第一步，取绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷混合，精密称定，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合，配制成混合对照品溶液，取莲威阿纳其颗粒0.1g，与体积分数70％乙醇混合后过滤，得到滤液为供试品溶液，取缺雪莲、肉苁蓉、雪莲及鹿衔草、仙灵脾的莲威阿纳其颗粒0.1g，与体积分数70％乙醇混合后过滤，得到滤液为阴性对照溶液；第二步，取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液根据色谱条件，分别得到混合对照品溶液色谱图、供试品溶液色谱图、阴性对照溶液色谱图，通过方法学考察确定一测多评法在莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法中可行；第三步，取莲威阿纳其颗粒，根据色谱条件，得到色谱图，对莲威阿纳其颗粒中五种有效成分色谱峰进行定位并计算出绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的含量。上述莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法按照下述步骤进行：第一步，取处于对数生长期的raw264.7细胞，用完全培养基调整细胞密度到3×105/ml，接入96孔板，每孔100μl细胞悬液，37℃培养过夜，给96孔细胞培养板中加入10μldmso药液，将96孔细胞培养板置于细胞培养箱孵育4h，以10μl不同批次2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的不同浓度莲威阿纳其颗粒组，处理细胞4h，每组3个复孔，于加药4h后加入10μl终浓度为1μg/ml的lps，lps组加入等量含1μg/ml的lps的培养液，空白组加入等体积的培养液孵育24h，吸取细胞上清液，用elisa试剂盒检测il1-β、tnf-α的含量；第二步，以莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱中共有指纹峰的相对峰面积为x，il-1β含量为y，采用spss软件，进行逐步回归法的多元回归分析，拟合出指纹图谱中各共有峰峰面积与il-1β含量之间的回归方程:y＝0.7-0.0000009968x9-0.0000008434x17+0.0000005974x20，标准化后的回归方程为y＝-1.708x9-1.069x17+1.006x20，根据标准化回归系数说明该共有色谱峰对抑制il-1β释放作用的贡献大小，确定莲威阿纳其颗粒五个主要有效成分物质抗炎药效作用大小，其中，x9是9号峰峰面积，x17是17号峰峰面积，x20是20号峰峰面积；第三步，以莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱中共有指纹峰的相对峰面积为x，nf-α含量为y，采用spss软件，进行逐步回归法的多元回归分析，拟合出指纹图谱中各共有峰峰面积与tnf-α含量之间的回归方程:y＝637.142+0.002x4-0.008x9-0.001x12+0.001x19，标准化后的回归方程为:y＝2.454x4-1.361x9-0.511x12+0.315x19，根据标准化回归系数说明该共有色谱峰对抑制tnf-α释放作用的贡献大小，确定莲威阿纳其颗粒五个主要有效成分物质抗炎药效作用大小，其中，x4是4号峰峰面积，x9是9号峰峰面积，x12是12号峰峰面积，x19是19号峰峰面积。上述deme培养基是按照下述过程配制：lps是按照下述过程配制：10mg粉末加10ml磷酸盐缓冲液，过0.22μm滤膜10μl分装，-20℃保存，得到浓度为1mg/ml的lps；或/和，dmso药液是按照下述过程配制：1mg黄酮或挥发油加1ml二甲基亚得到浓度为1mg/ml的dmso药液。本发明能更精确的检测莲威阿纳其颗粒中多味药材类别、多种有效成分的含量以及抗炎药效作用的大小，可以最方便、有效的作为莲威阿纳其颗粒的质量控制依据。附图说明附图1为本发明实施例3中10批莲威阿纳其颗粒高效液相化学指纹图谱。附图2为本发明实施例3中10批莲威阿纳其颗粒对照指纹图谱。附图3为本发明实施例3中混合对照品溶液高效液相化学指纹图谱中原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷5个特征峰图。附图4为本发明实施例3中莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物高效液相化学指纹图谱。附图5为本发明实施例3中莲威阿纳其颗粒中间体-水提物的高效液相化学指纹图谱。附图6为本发明实施例3中莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末的高效液相化学指纹图谱。附图7为本发明实施例7中混合对照品溶液色谱图。附图8为本发明实施例7中供试品溶液色谱图。附图9为本发明实施例7中缺肉苁蓉药材阴性对照溶液色谱图。附图10为本发明实施例7中缺雪莲药材阴性对照溶液色谱图。附图11为本发明实施例7中缺雪莲和鹿衔草药材阴性对照溶液色谱图。附图12为本发明实施例7中缺仙灵脾药材阴性对照溶液色谱图。具体实施方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。下面结合实施例对本发明作进一步描述：实施例1：该莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法，包括莲威阿纳其颗粒有效成分的鉴别方法、莲威阿纳其颗粒有效成分含量的测定方法和莲威阿纳其颗粒中有效成分的药效学检测方法，其中，莲威阿纳其颗粒有效成分的鉴别方法采用莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法和莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法，莲威阿纳其颗粒有效成分含量的测定方法采用莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法，莲威阿纳其颗粒中有效成分的药效学检测方法采用莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法。实施例2：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分为绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷。实施例3：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒中七味主要药材为肉苁蓉、桑葚、天山雪莲、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、威灵仙。实施例4：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法按照下述步骤进行：第一步，称取0.1g莲威阿纳其颗粒，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒供试品溶液，称取0.1g莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液，称取0.01g莲威阿纳其颗粒中间体-水提物，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合后过滤，得到滤液为莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液；第二步，取莲威阿纳其颗粒供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末供试品溶液，根据色谱条件分别得到莲威阿纳其颗粒、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物、莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末的色谱图；第三步，分别建立莲威阿纳其颗粒供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物供试品溶液、莲威阿纳其颗粒中间体-水提物供试品溶液的高效液相化学指纹图谱，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统的数据匹配功能，标定共有20个共有指纹峰,确定莲威阿纳其颗粒中含有绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷五种成分。实施例4中色谱条件为色谱柱inertsilods-3(5μm，4.6×250mm)、流动相：乙腈(a)-0.3％磷酸水(b)，梯度洗脱程序、柱温：30℃、检测波长：280nm、体积流量：1.0ml/min。实施例4中10批莲威阿纳其颗粒高效液相化学指纹图谱如图1所示；10批莲威阿纳其颗粒对照指纹图谱如图2所示；混合对照品溶液高效液相化学指纹图谱中绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷5个特征峰如图3所示，其中，1为绿原酸、2为松果菊苷、3为芦丁、4为毛蕊花糖苷、5为淫羊藿苷；莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物高效液相化学指纹图谱如图4所示；莲威阿纳其颗粒中间体-水提物的高效液相化学指纹图谱如图5所示；莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末的高效液相化学指纹图谱如图6所示。实施例4中10批莲威阿纳其颗粒高效液相化学指纹图谱中20个共有指纹峰的相对峰面积数据如表1所示，其中，x1至x20分别表示1号至20号色谱峰，s1至s10分别代表10批莲威阿纳其颗粒。莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法精密度试验：取同一批号威阿纳其颗粒供试品溶液，按上述色谱条件连续进样六次，记录色谱图。以松果菊苷为参照，计算各共有峰的相对保留时间rsd值不高于0.62,相对保留峰面积rsd值不高于1.29，各色谱峰的相似度值不低于0.99，表明仪器的精密度良好。莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法重复性试验：取同一批号的威阿纳其颗粒，平行6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，按上述色谱条件连续进样六次，记录色谱图，以松果菊苷为参照，计算各共有峰的相对保留时间rsd值不高于0.62,相对保留峰面积rsd值不高于1.29，各色谱峰的相似度值不低于0.99，表明该方法的重复性良好。莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法稳定性试验：取同一威阿纳其颗粒供试品溶液10μl，分别于配制后的0、2、4、8、12、24h，按上述色谱条件进样，记录色谱图，以松果菊苷为参照，计算各共有峰的相对保留时间rsd值不高于0.62,相对保留峰面积rsd值不高于1.29，各色谱峰的相似度值不低于0.99，表明24h内供试品溶液的稳定性良好。实施例5：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒中间体-醇提物为莲威阿纳其颗粒中七味主要药材经乙醇提取干燥后得到的醇提浸膏干粉，莲威阿纳其颗粒中间体-水提物为阿纳其根、桑椹药材及醇提药渣经水提取干燥后所得的粗多糖干粉，莲威阿纳其颗粒中间体-二味药材粉末为土鳖虫药材粉末和骨碎补药材粉末。实施例6：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，配制薄层色谱鉴别供试品溶液；第二步，配制薄层色谱鉴别阴性样品溶液；第三步，配制薄层色谱鉴别对照药材溶液；第四步，配制薄层色谱鉴别对照品溶液；第五步，配制显色剂；第六步，进行薄层色谱鉴别。实施例7：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法按照下述步骤进行：第一步，取绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷混合，精密称定，与体积百分比浓度为70％的乙醇混合，配制成混合对照品溶液，取莲威阿纳其颗粒0.1g，与体积分数70％乙醇混合后过滤，得到滤液为供试品溶液，取缺雪莲、肉苁蓉、雪莲及鹿衔草、仙灵脾的莲威阿纳其颗粒0.1g，与体积分数70％乙醇混合后过滤，得到滤液为阴性对照溶液；第二步，取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液根据色谱条件，分别得到混合对照品溶液色谱图、供试品溶液色谱图、阴性对照溶液色谱图，通过方法学考察确定一测多评法在莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法中可行；第三步，取莲威阿纳其颗粒，根据色谱条件，得到色谱图，对莲威阿纳其颗粒中五种有效成分色谱峰进行定位并计算出绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的含量。实施例7中色谱条件为色谱柱inertsilods-3(5μm，4.6×250mm)、流动相：乙腈(a)-0.3％磷酸水(b)，梯度洗脱程序、柱温：30℃、检测波长：280nm、体积流量：1.0ml/min。实施例7中混合对照品溶液色谱图如图7所示、实施例7中供试品溶液色谱图如图8所示、缺肉苁蓉药材阴性对照溶液色谱图如图9所示、缺雪莲药材阴性对照溶液色谱图如图10所示、缺雪莲和鹿衔草药材阴性对照溶液色谱图如图11所示、缺仙灵脾药材阴性对照溶液色谱图如图12所示，其中，在图7至图12中，1为绿原酸、2为松果菊苷、3为芦丁、4为毛蕊花糖苷、5为淫羊藿苷。莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法方法学考察线性关系考察：吸取实施例7的混合对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、15μl注入高效液相色谱仪，按实施例7的色谱条件进行测定，以对照品的进样量(x)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，根据结果统计可知，五个主要有效成分在一定进样量范围内呈良好的线性关系。精密度试验：取同一批号威阿纳其颗粒供试品溶液，按上述色谱条件连续进样六次，记测定绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面积，其rsd分别为0.82％、1.37％、1.82％、1.86％、1.98％，表明仪器的精密度良好。重复性试验：取同一批号的威阿纳其颗粒，平行6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，测定莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分的含量，rsd分别为0.96％、1.73％、1.54％、2.29％、1.45％，表明该方法的重复性良好。稳定性试验：取同一威阿纳其颗粒供试品溶液10μl，分别于配制后的0、2、4、8、12、24h测定峰面积积分值，绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷内峰面积的rsd分别为1.16％、0.98％、1.80％、1.28％、1.27％，表明24h内供试品溶液的稳定性良好。为确定莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法的准确性，本试验利用相关系数考察法和相似度评价法两种方法进行考察：将两种方法结果经相关系数分析，二者之间的相关系数均大于0.9999，可说明两种方法得到的含量相似性极高。同时将计算结果经t检验，p远大于0.05，说明两种方法得到的计算结果并无显著性差异。借鉴指纹图谱相似度评价方法，通过计算夹角余弦值来评价外标法与一测多评法所得结果的相似度，从而考察两者的差异程度。根据夹角余弦的统计学定义，两组数据的夹角余弦值越接近1，其两者差异越小，相似度越高。将两种方法得到的数据计算夹角余弦值，结果均在0.989与0.999之间，表明其相似度极高，因此验证一测多评法在莲威阿纳其颗粒的质量评价中应用是可行的。实施例8：作为上述实施例的优化，莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法按照下述步骤进行：第一步，取处于对数生长期的raw264.7细胞，用完全培养基调整细胞密度到3×105/ml，接入96孔板，每孔100μl细胞悬液，37℃培养过夜，给96孔细胞培养板中加入10μldmso药液，将96孔细胞培养板置于细胞培养箱孵育4h，以10μl不同批次2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的不同浓度莲威阿纳其颗粒组，处理细胞4h，每组3个复孔，于加药4h后加入10μl终浓度为1μg/ml的lps，lps组加入等量含1μg/ml的lps的培养液，空白组加入等体积的培养液孵育24h，吸取细胞上清液，用elisa试剂盒检测il1-β、tnf-α的含量；第二步，以莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱中共有指纹峰的相对峰面积为x，il-1β含量为y，采用spss软件，进行逐步回归法的多元回归分析，拟合出指纹图谱中各共有峰峰面积与il-1β含量之间的回归方程：y＝0.7-0.0000009968x9-0.0000008434x17+0.0000005974x20，标准化后的回归方程为y＝-1.708x9-1.069x17+1.006x20，根据标准化回归系数说明该共有色谱峰对抑制il-1β释放作用的贡献大小，确定莲威阿纳其颗粒五个主要有效成分物质抗炎药效作用大小，其中，x9是9号峰峰面积，x17是17号峰峰面积，x20是20号峰峰面积；第三步，以莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱中共有指纹峰的相对峰面积为x，nf-α含量为y，采用spss软件，进行逐步回归法的多元回归分析，拟合出指纹图谱中各共有峰峰面积与tnf-α含量之间的回归方程：y＝637.142+0.002x4-0.008x9-0.001x12+0.001x19，标准化后的回归方程为y＝2.454x4-1.361x9-0.511x12+0.315x19，根据标准化回归系数说明该共有色谱峰对抑制tnf-α释放作用的贡献大小，确定莲威阿纳其颗粒五个主要有效成分物质抗炎药效作用大小，其中，x4是4号峰峰面积，x9是9号峰峰面积，x12是12号峰峰面积，x19是19号峰峰面积。实施例8中10批莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱中20个共有指纹峰的相对峰面积数据如表1所示，其中，x1至x20分别表示1号至20号色谱峰，s1至s10分别代表10批莲威阿纳其颗粒。实施例8中指纹图谱中各共有峰峰面积与il-1β含量之间的回归系数如表3所示。实施例8中指纹图谱中各共有峰峰面积与tnf-α含量之间的回归系数如表4所示。根据表3、表4结果，与前期混合对照品指认，8号峰为绿原酸，9号峰为松果菊苷，11号峰为芦丁，12号峰为毛蕊花糖苷，17号峰为淫羊藿苷。莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法采用谱效关系研究思路，在莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法和莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法的基础上，一是通过pearson相关系数，判别每个共有色谱峰与il1-β或tnf-α的含量的相关性；二是以莲威阿纳其颗粒的效液相化学指纹图谱色谱图中各共有峰的峰面积为自变量，以10批莲威阿纳其颗粒对lps刺激的raw264.7细胞分泌il1-β或tnf-α的含量为因变量，建立多元回归函数并进行逐步回归分析，最终揭示莲威阿纳其颗粒中的各化学成分与抗炎药效之间的相关性及主要相关化学成分，为莲威阿纳其颗粒抗炎作用的药效物质基础和制剂质量控制提供依据，10批莲威阿纳其颗粒对lps刺激的raw264.7细胞分泌il1-β、tnf-α含量的影响如表2所示，表2可知，莲威阿纳其颗粒可以抑制lps诱导raw264.7细胞过度分泌il1-β和tnf-α，且呈一定的剂量关系，因而莲威阿纳其颗粒的抗炎作用。实施例9：作为上述实施例的优化，lps是按照下述过程配制：10mg粉末加10ml磷酸盐缓冲液，过0.22μm滤膜10μl分装，-20℃保存，得到浓度为1mg/ml的lps；或/和，dmso药液是按照下述过程配制：1mg黄酮或挥发油加1ml二甲基亚得到浓度为1mg/ml的dmso药液。实施例10：莲威阿纳其颗粒中肉苁蓉薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，将莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，精密取0.5g放到锥形瓶后，加入50％甲醇10ml。超声30min后，取出，将甲醇液缓慢倒入离心管内4000r/min离心15min，取上清液5ml置蒸发皿中，水浴浓缩蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到供试品溶液；第二步，将缺肉苁蓉药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，精密取0.5g放到锥形瓶后，加入体积百分比浓度为50％的甲醇10ml。超声30min后，取出，将甲醇液缓慢倒入离心管内4000r/min离心15min，取上清液5ml置蒸发皿中，水浴浓缩蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到阴性样品溶液；第三步，将肉苁蓉研磨至粉末状，精密取0.5g放到锥形瓶后，加入体积百分比浓度为的50％甲醇10ml。超声30min后，取出，将甲醇液缓慢倒入离心管内4000r/min离心15min，取上清液5ml置蒸发皿中，水浴浓缩蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到对照药材溶液；第四步，取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品各10mg，放入10ml容量瓶内，加适量甲醇超声溶解后加至刻度线，得到对照品溶液；第五步，取2g三氯化铁放入烧杯中加入40ml无水乙醇，搅拌至完全溶解，得到体积百分比浓度为5％的三氯化铁乙醇溶液，该三氯化铁乙醇溶液为显色剂；第六步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述溶液各5ul，点样于同一张硅胶g薄层板上，以体积比为15：3：2的醋酸乙酯、甲醇和体积百分比浓度为8％的冰乙酸溶液为展开剂，展开后取出，晾干，喷显色剂，105℃加热至斑点清晰，得到肉苁蓉薄层色谱图。实施例11：莲威阿纳其颗粒中桑椹薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入圆底烧瓶中，加入蒸馏水10ml回流提取1h后，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣采用1ml体积比为2:1的醋酸乙酯和乙醇溶解，得到供试品溶液；第二步，取桑椹药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入圆底烧瓶中，加入蒸馏水10ml回流提取1h后，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣采用1ml体积比为2:1的醋酸乙酯和乙醇溶解，得到阴性样品溶液；第三步，取桑椹研磨至粉末状，称取1.0g放入圆底烧瓶中，加入蒸馏水10ml回流提取1h后，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣采用1ml体积比为2:1的醋酸乙酯和乙醇溶解，得到对照药材溶液；第四步，精密量取硫酸溶液5ml，置于烧杯中，加入50ml无水乙醇，搅拌均匀，得到体积百分比浓度为10％的硫酸乙醇，该硫酸乙醇为显色剂。第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别上述溶液各5ul，点样于同一张硅胶g薄层板上，在30℃至60℃条件下，以体积比为10：5：3的石油醚、氯仿和乙酸乙酯为展开剂，展开后取出，喷显色剂，晾干，置于紫外灯(365nm)下检视，得到桑椹薄层色谱图。实施例12：莲威阿纳其颗粒中天山雪莲薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％的甲醇20ml。超声30min后，取出，将甲醇液缓慢倒入离心管内于4000r/min离心15min，取上清液7ml置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml轻摇溶解，得到供试品溶液；第二步，取缺天山雪莲药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％的甲醇20ml。超声30min后，取出，将甲醇液缓慢倒入离心管内于4000r/min离心15min，取上清液7ml置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml轻摇溶解，得到阴性样品溶液；第三步，取天山雪莲对照药材研磨为粉末状后取0.5g，加体积百分比浓度为80％的甲醇20ml，超声溶解约10min，取续滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使其溶解，得到对照药材溶液；第四步，取0.4g亚硝酸钠放入烧杯中加入40ml体积百分比浓度为1％的甲醇溶液，搅拌均匀，得到体积百分比浓度为1％的亚硝酸钠和甲醇混合液，该混合液为显色剂，第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述溶液各5ul，点样于同一硅胶g薄层板上，以体积比为10：6：1：2的乙酸乙酯、丁酮、甲酸和水为展开剂，放入展开剂展开后约15min后取出，晾干，喷显色剂后，105℃加热至斑点清晰，得到天山雪莲薄层色谱图。实施例13：莲威阿纳其颗粒中骨碎补薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，精密称取以2.0g放入圆底烧瓶中，加入丙酮10ml，水浴回流提取1h，取出，放至室温后滤过。残渣用三氯甲烷缓慢摇晃洗涤2次，每次5ml，挥干，加乙酸乙酯10ml溶解，滤过，滤液与丙酮滤液合并之后蒸干，残留物加体积比为2：1的乙酸乙酯和甲醇2ml溶解，得到供试品溶液；第二步，取缺骨碎补药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，精密称取以2.0g放入圆底烧瓶中，加入丙酮10ml，水浴回流提取1h，取出，放至室温后滤过。残渣用三氯甲烷缓慢摇晃洗涤2次，每次5ml，挥干，加乙酸乙酯10ml溶解，滤过，滤液与丙酮滤液合并之后蒸干，残留物加体积比为2：1的乙酸乙酯和甲醇2ml溶解，得到阴性样品溶液；第三步，取柚皮苷对照品5mg，放入10ml容量瓶内后加甲醇超声溶解1分钟后，加甲醇至刻度线，得到对照品溶液；第四步，取2g三氯化铝放入烧杯中加入100ml无水乙醇，搅拌至完全溶解，得到体积百分比浓度为2％的三氯化铝乙醇溶液，该三氯化铝乙醇溶液为显色剂，第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述溶液各5ul，点样于同一张硅胶g薄层板上，以冰乙酸为展开剂，展开，取出后晾干，喷显色剂，70℃加热6min，置紫外灯(365nm)下检视，得到骨碎补薄层色谱图。实施例14：莲威阿纳其颗粒中淫羊藿薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯20ml，回流提取1h之后，取出，将提取液滤过置于蒸发皿中，水浴蒸干，剩余固体物用无水乙醇1ml溶解，得到供试品溶液；第二步，取缺淫羊藿药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取1.0g放入圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯20ml，回流提取1h之后，取出，将提取液滤过置于蒸发皿中，水浴蒸干，剩余固体物用无水乙醇1ml溶解，得到阴性样品溶液；第三步，将淫羊藿对照药材研磨至粉末状后取0.5g，加入乙醇10ml，温浸30min左右，取续滤液蒸干将剩余固体物加乙醇1ml溶解，得到对照药材溶液；第四步，取淫羊藿苷对照品0.1mg，放入10ml容量瓶内加甲醇超声溶解2分钟，继续加甲醇定容至刻度线，得到对照品溶液；第四步，精密吸取浓硫酸4ml，放入烧杯中，缓慢加入40ml无水乙醇，搅拌均匀，得到体积百分比浓度为10％的硫酸乙醇，该硫酸乙醇为显色剂；第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述各5ul，点样于同一张硅胶g薄层板上，以体积比13：6：4的氯仿、甲醇和丁酮为展开剂，放入混合展开液中展开，取出后晒干，喷显色剂，94℃加热至斑点清晰，得到淫羊藿薄层色谱图。实施例15：莲威阿纳其颗粒中鸡血藤薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取3.0g放入圆底烧瓶中，加入体积百分比浓度为80％的丙酮30ml，90℃回流提取1h后，取出，将提取液滤过，置于蒸发皿中，90℃水浴浓缩蒸干，剩余固体物加甲醇约2ml溶解，得到供试品溶液；第二步，取缺鸡血藤药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称取3.0g放入圆底烧瓶中，加入体积百分比浓度为80％的丙酮30ml，90℃回流提取1h后，取出，将提取液滤过，置于蒸发皿中，90℃水浴浓缩蒸干，剩余固体物加甲醇约2ml溶解，得到阴性样品溶液；第三步，取鸡血藤药材研磨至粉末状，称取3.0g放入圆底烧瓶中，加入体积百分比浓度为80％的丙酮30ml，90℃回流提取1h后，取出，将提取液滤过，置于蒸发皿中，90℃水浴浓缩蒸干，剩余固体物加甲醇约2ml溶解，得到对照药材溶液；第四步，取芒柄花素对照品10mg，放入10ml容量瓶内加超声溶解1分钟至2分钟后，加甲醇定容，得到对照品溶液；第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述溶液各5ul，点样于同一张硅胶gf254薄层板上，以体积比为10:1:0.4的氯仿、甲醇和甲酸为展开剂，插入混合展开液中展开，取出后晾干，于254nm处检视，得到鸡血藤薄层色谱图。实施例16：莲威阿纳其颗粒中威灵仙薄层色谱鉴别法按照下述步骤进行：第一步，，取莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称1.0g，放入圆底烧瓶中，加乙醇50ml，95℃回流提取2h后，滤过，滤液水浴浓缩至20ml，加盐酸3ml，继续回流提取1h，加水10ml，放冷，加60℃至90℃的石油醚25ml，振摇萃取，将石油醚蒸干，剩余物加无水乙醇溶解，得到供试品溶液；第二步，取缺威灵仙药材的莲威阿纳其颗粒研磨至粉末状，称1.0g，放入圆底烧瓶中，加乙醇50ml，95℃回流提取2h后，滤过，滤液水浴浓缩至20ml，加盐酸3ml，继续回流提取1h，加水10ml，放冷，加60℃至90℃的石油醚25ml，振摇萃取，将石油醚蒸干，剩余物加无水乙醇溶解，得到阴性样品溶液；第三步，取齐墩果酸对照品5.00mg，放入10ml容量瓶内，加甲醇震摇溶解后，再加入甲醇至刻度线，得到对照品溶液；第四步，精密吸取浓硫酸4ml，放入烧杯中，缓慢加入40ml无水乙醇，搅拌均匀得到体积百分比浓度为10％的硫酸乙醇，该硫酸乙醇为显色剂；第五步，取5ul毛细管，以甲醇润洗三次，照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述溶液各5ul，点样于同一张硅胶g薄层板上，以体积比为20:3:0.2的甲苯、乙酸乙酯和甲酸为展开剂，插入混合液中展开液取出，晒干，喷显色剂，105℃加热至斑点清晰，得到威灵仙薄层色谱图。对实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15分别进行耐用性考察，取不同厂家的硅胶g板，进行薄层色谱鉴别，至斑点清晰，可分别得到色谱图。通过耐用性考察，证明薄层色谱鉴别法的方法好、重现性好，天山雪莲、肉苁蓉、桑椹为方中君药，骨碎补、仙灵脾为方中臣药，鸡血藤、威灵仙为方中佐药。根据实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15以上七味药材在供试品的色谱图中，与对照品色谱和对照药材色谱或对照品或对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品在相应的位置上无此斑点，专属性好；不同的吸附剂板验证薄层色谱结果良好，色谱斑点清晰，分离度好。因此，莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法能够微量、快速、准确地对莲威阿纳其颗粒中七味主要药材进行定性鉴别，鉴别的各种成分均为方中君臣佐药的有效成分，从而可直接作为莲威阿纳其颗粒质量控制的有力依据。综上所述，本发明通过莲威阿纳其颗粒的高效液相化学指纹图谱法、莲威阿纳其颗粒中七味主要药材的薄层色谱鉴别法、莲威阿纳其颗粒的五个主要有效成分含量的一测多评法和莲威阿纳其颗粒谱效关系分析法，建立了莲威阿纳其颗粒的综合质量评价方法。本发明能更精确的检测莲威阿纳其颗粒中多味药材类别、多种有效成分的含量以及抗炎药效作用的大小，可以最方便、有效的作为莲威阿纳其颗粒的质量控制依据。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。表1表2表3峰号回归系数标准化回归系数—0.7**—x9-0.0000009968**-1.708x17-0.0000008434**-1.069x200.0000005974**1.006表4峰号回归系数标准化回归系数—637.142**—x40.002*2.454x9-0.008**-1.361x12-0.001**-0.511x190.001**0.315当前第1页12