本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法（hplc）的丙酸含量测定方法。
背景技术：
短链脂肪酸，也称挥发性脂肪酸，包括甲酸，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸等。短链脂肪酸对结肠功能有重要影响，后肠在迅速吸收短链脂肪酸后，既储存了能量又降低了渗透压，并且短链脂肪酸对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。
目前市面上已有的检测丙酸的方法可分为三大类，包括生物鉴定法、免疫检测技术以及高效液相检测技术。其中，生物鉴定法虽然简单，但对样品的纯度要求较高，需要复杂的样品前处理，同时专一性以及重复性较差。免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长。色谱技术近些年飞速发展，在植物激素的检测中越来越广泛。但是现在市面上基于高效液相色谱的检测技术，对于样品的前处理普遍繁琐，且损失率较高。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于高效液相色谱法的丙酸含量测定方法，不仅前处理过程简单易操作，而且可准确检测丙酸的含量。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于高效液相色谱法的丙酸含量测定方法，其原理是利用carbomixh-np10,8%色谱柱有效分离各种短链脂肪酸，然后利用示差折光检测器进行检测及定量；
该方法的具体包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
准备高效液相色谱仪（carbomixh-np10,8%色谱柱，示差折光检测器）、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、2个0.45μm滤膜（水系、有机系）、50个0.22μm针头式过滤器（水系）、可调式移液器、50个2ml样品瓶和超纯水；
步骤2试剂的配制；
1）试剂一：超纯水；
2）试剂二：0.5mg丙酸标准品置于1.5mlep管中，2-8℃保存；
步骤3流动相的配制；
量取80μl浓硫酸缓慢加入600ml水中（该步骤较危险，配置时需小心，注意加入的顺序）；
步骤4丙酸的提取；
液体样本：取0.2ml样本，过0.45μm水系滤膜，上高效液相色谱仪检测；
组织样本：取0.2g样本，加入1ml水，研磨成浆；超声提取30min；采用离心率10000g离心10min，提取上清液；残渣用0.2ml试剂一超声20min，采用离心率10000g离心10min，合并两次上清液，用试剂一定容至1.5ml；取适量定容后的溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内待测；
步骤5标准品的配制：
在试剂二中加入1ml超纯水，配成500μg/ml母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和5μg/ml的丙酸标准品溶液；不同浓度的所述丙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；
步骤6仪器的调试和预设；
1）开启电脑、泵和示差折光检测器，打开软件，在方法组中设置进样量10μl，流速0.6ml/min，走样时间为30min，设置完毕保存方法组；
2）先不接入carbomixh-np10,8%色谱柱，用超纯水冲洗色谱柱以及整套仪器的所有管路10min，流速为0.5ml/min；
3）用所述流动相冲洗色谱柱以及整套仪器的所有管路10min，流速为0.5ml/min；
4）将流速调整为0.1ml/min，再接入carbomixh-np10,8%色谱柱，同时设置柱温为80℃，待温度达到后，将流速升高至0.6ml/min；待基线平稳后，可进行加样；
步骤7样本的测定；
1）在高效液相色谱仪中分别加入不同浓度的所述丙酸标准品溶液10μl，利用示差折光检测器计算不同浓度的所述丙酸标准品溶液的峰面积；
2）在上述高效液相色谱仪中加入样品10μl，所述丙酸标准品溶液可在30min内分离丙酸，丙酸的保留时间在16.2min左右，利用示差折光检测器在丙酸相应的保留时间处检测丙酸的峰面积；
步骤8丙酸含量的计算；
以所述丙酸标准品溶液浓度（μg/ml）为横坐标，所述丙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算丙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述丙酸标准曲线，计算样品中丙酸含量。
本发明的有益效果是：
1、本发明需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到纳克级别的含量，检测灵敏度高。
2.本发明的样本前处理过程简单易操作，只需石油醚萃取就可上样检测。
3.本发明的提取液成分简单，只需甲醇跟水的混合溶液（ph=3）提取，成本低。
4.本发明的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据。每一个样品只需十分钟时间。相比其他方法时间大大缩短。
5.流动相主要成分为纯水，绿色环保，成本低。
6.本发明的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显，所需试剂基本无毒。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于高效液相色谱法的丙酸含量测定方法，其原理是利用carbomixh-np10,8%色谱柱有效分离各种短链脂肪酸，然后利用示差折光检测器进行检测及定量；
该方法的具体包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
准备高效液相色谱仪（carbomixh-np10,8%色谱柱，示差折光检测器）、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、2个0.45μm滤膜（水系、有机系）、50个0.22μm针头式过滤器（水系）、可调式移液器、50个2ml样品瓶和超纯水；
步骤2试剂的配制；
1）试剂一：超纯水；
2）试剂二：0.5mg丙酸标准品置于1.5mlep管中，2-8℃保存；
步骤3流动相的配制；
量取80μl浓硫酸缓慢加入600ml水中（该步骤较危险，配置时需小心，注意加入的顺序）；
步骤4丙酸的提取；
液体样本：取0.2ml样本，过0.45μm水系滤膜，上高效液相色谱仪检测；
组织样本：取0.2g样本，加入1ml水，研磨成浆；超声提取30min；采用离心率10000g离心10min，提取上清液；残渣用0.2ml试剂一超声20min，采用离心率10000g离心10min，合并两次上清液，用试剂一定容至1.5ml；取适量定容后的溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内待测；
步骤5标准品的配制：
在试剂二中加入1ml超纯水，配成500μg/ml母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和5μg/ml的丙酸标准品溶液；不同浓度的所述丙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；
步骤6仪器的调试和预设；
1）开启电脑、泵和示差折光检测器，打开软件，在方法组中设置进样量10μl，流速0.6ml/min，走样时间为30min，设置完毕保存方法组；
2）先不接入carbomixh-np10,8%色谱柱，用超纯水冲洗色谱柱以及整套仪器的所有管路10min，流速为0.5ml/min；
3）用所述流动相冲洗色谱柱以及整套仪器的所有管路10min，流速为0.5ml/min；
4）将流速调整为0.1ml/min，再接入carbomixh-np10,8%色谱柱，同时设置柱温为80℃，待温度达到后，将流速升高至0.6ml/min；待基线平稳后，可进行加样；
步骤7样本的测定；
1）在高效液相色谱仪中分别加入不同浓度的所述丙酸标准品溶液10μl，利用示差折光检测器计算不同浓度的所述丙酸标准品溶液的峰面积；
2）在上述高效液相色谱仪中加入样品10μl，所述丙酸标准品溶液可在30min内分离丙酸，丙酸的保留时间在16.2min左右，利用示差折光检测器在丙酸相应的保留时间处检测丙酸的峰面积；
步骤8丙酸含量的计算；
以所述丙酸标准品溶液浓度（μg/ml）为横坐标，所述丙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算丙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述丙酸标准曲线，计算样品中丙酸含量。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。