本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器及其应用。
背景技术：
可逆的蛋白磷酸化和去磷酸化过程调控着生物体的很多生命活动，控制着生命体的很多生理和病理过程，例如细胞的增殖、生长、分化和凋亡以及细胞信号的转导，细胞的凋亡等，被形象的称为生命活动的开关；另一方面，磷酸化过程的异常都会导致一系列常见疾病，其中包括肿瘤癌症，心脏疾病和老年痴呆症等(1)，磷酸化激酶抑制剂在降低抗肿瘤方面的治疗已被广泛认可(2)。例如：vegf信号转导的主要受体包括fms样酪氨酸激酶vegfr-1和胎儿肝激酶插入区受体vegfr-2。其中，vegfr-2主要分布在肿瘤血管内皮细胞等；它的主要作用是介导vegf的血管内皮细胞增生，趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能，因此为肿瘤化疗给药提供血供，增加药物递送功能(3)。因此，磷酸化是影响蛋白功能的最主要的翻译后修饰之一(4)，其与肿瘤的发生发展互为因果(5)。近年来进一步研究发现，肿瘤中特异性表达的磷酸化蛋白质已成为肿瘤诊断、预防和治疗的潜在新靶点。因此更深层的研究肿瘤蛋白质特征及其形成机制在肿瘤诊断和治疗上均具有重要生物医学意义。已有的细胞生物学蛋白分析方法无法提供详细的蛋白生化反应途径的变化(6)。而目前正在发展的蛋白组学研究手段，可以在一定程度上为肿瘤新靶点的找寻提供高通量数据信息(7)。
尽管基于高分辨率质谱(ms)的蛋白质组学的技术已经趋于成熟，但蛋白质组学技术中样品制备这个关键环节中，还有诸多问题亟待解决，如低丰度蛋白难以检测、修饰的蛋白容易降解等。而这些问题均与制备过程中样品消耗大、耗时长、处理复杂及低特异性相关。通常，标准蛋白质组学需要大量血清标本(>500μl血清)。然而，大多数情况下我们获得的标本量较少，从而限制了其功能研究(8)。因此，研究者们致力于开发高灵敏度、多数量(例如每个样本>5000个蛋白质)，同时消耗少量生物样品的制备技术。但是，已经发表的方法不能用于痕量磷酸化蛋白的富集(9)，因此，选择一种材料来特异性富集磷酸化蛋白是非常必要的。
胰腺导管腺癌(pdac)是最常见的胰腺恶性肿瘤，95％患者在确诊10个月内死亡。但是，对于pdac标志性蛋白，目前应用的检测方法由于含量低在pdac早期无法被检测，只有在晚期才能被发现，这也是导致胰腺癌治疗失败的主要原因(10，11)。因此，开发一种方法提高对pdac发生相关的磷酸化标志性蛋白检测灵敏度，以期到达早诊断、早治疗，并最终提高生存率是我们的终极目标。
参考文献：
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技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器。该迷你蛋白反应器主要由固定化金属螯合层析imac磁珠和c18beads(c18小柱)组成。此种方法采用串联柱分离技术实现了蛋白质组学中复杂的样品制备步骤，包括磷酸化蛋白质预浓缩，还原，烷基化和消化，以及脱盐和分馏。影响imac磷酸化蛋白纯化效果有很多，但其中洗脱条件是主要因素，包括洗脱液ph、组成及离子强度。其中ph通过质子改变金属配体的负电性及氨基酸残基上的质子化程度而进行洗脱效果的调节。洗脱液的组成可改变的范围较广，多种途径共同调节着纯化效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，包括移液器吸头、c18beads、imac磁珠、适配器、eppendorf管；移液器吸头内从下而上依次设置有若干c18beads、若干imac磁珠；c18beads与imac磁珠相互接触；适配器套在移液器吸头上，适配器放在eppendorf管上端；移液器吸头的尖端插入至eppendorf管内。
所述的移液器吸头优选为10～200μl移液器吸头；
所述的eppendorf管优选为500μl～2.0mleppendorf管；
所述的c18beads优选为2～5μmemporec18beads；更优选为3μmemporec18beads；
所述的imac磁珠优选为10～50μmimac磁珠；更优选为20μmimac磁珠；
根据蛋白质量计算c18beads的数量和imac磁珠的量；比如：0.4～1.5mgimac可用于2～20μg蛋白质的分离(约30μg蛋白质/mgbeads的结合力)
一种利用迷你蛋白反应器制备蛋白质组学样品的方法，包括如下步骤：
(1)血清样本的采集：收集待测血清后，置于-80℃保存；
(2)富集：上样之前，从下而上依次设置有若干c18beads、若干imac磁珠的移液器吸头分别用甲醇和10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)平衡；将待测血清通过70％(v/v)甲醇沉淀蛋白，然后用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)复溶蛋白，作为样品溶液，进行上样；
(3)还原：用含20％乙腈的5～20mm磷酸盐缓冲液(ph6～8)洗涤后，注入尖端含10mm的组氨酸或甘氨酸的5～20mm磷酸盐缓冲液(ph6～8)，并在室温下孵育15分钟，加二硫苏糖醇(dtt)还原蛋白质；
(4)烷基化及消化：用2mm胰蛋白酶加100mm碘乙酰胺烷基化，100～200mm碳酸氢铵(ph8)中灌注并在室温避光孵育60分钟，离心除去溶液；
(5)将肽从imac磁珠转移至具有150～200mmtris-hcl(ph8)的c18beads中；用200mmtris-hcl(ph8)离心洗涤脱盐后，用20μl梯度递增的含acn(5％，20％，50％和80％)的200mmtris-hcl(ph8)中的溶液离心洗脱；
(6)将洗脱的肽冷冻干燥，获得蛋白质组学样品，可用于lc-ms/ms分析；
优选的，步骤(1)中所述的待测血清为待测胰腺导管腺癌患者血清。
优选的，步骤(3)中，用含20％乙腈的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤；
优选的，步骤(3)中，注入尖端含10mm的组氨酸或甘氨酸的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)；
优选的，步骤(4)中，用2mm胰蛋白酶加100mm碘乙酰胺烷基化，ph8的100mm碳酸氢铵中灌注并在室温避光孵育60分钟，离心除去溶液；
优选的，步骤(5)中，将肽从imac磁珠转移至具有200mmtris-hcl(ph8)的c18beads中。
为了更好的实现本发明的目的，还包括如下步骤：
(7)所获得的蛋白质组学样品通过orbitrapfusion质谱仪与qe超高压液相色谱泵进行分析；液相色谱分离系统由一个捕获柱(100μm×4cm)和一个(75μm×20cm)分析柱组成，内部填充3μmreprosil-purc18硅胶；
(8)用于分离的流动相是含0.1％(v/v)甲酸的水和含0.1％(v/v)甲酸的乙腈(acn)。首先将样品以2μl/min的流速分流到捕获柱上，然后通过分析柱以300nl/min的流速分离；梯度设定如下：2-60min，2-90％acn；60.1-70min，90-2％acn，平衡18分钟。全量程扫描m/z350-1550。ms/ms光谱以数据依赖模式采集。串联ms在三重四级杆(qqq)质量分析仪上进行，使用1.6da的采集间隔，标准化碰撞能量为10，动态排除时间设置为60s；
(9)用mascot软件匹配肽段对应的磷酸化蛋白，针对人类uniprot数据库搜索原始数据；母体化合物和质谱片段质量误差分别设定为10ppm和0.6da；蛋白质组学胰蛋白酶消化允许最多两次错过；将磷酸化设定为固定修饰，同时甲硫氨酸氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作为可变修饰；
(10)根据其分子量和样品总分数计算样品中每种蛋白质的浓度。胰腺癌患者和健康人血清蛋白浓度用主成分分析(pca)，用偏最小二乘法(pls-da)来校正算法。
本发明的机理是：
本发明选择了固定化金属螯合层析(imac)作为磷酸化蛋白的特异富集柱，该方法是建立在蛋白质表面的磷酸化修饰与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如磷、硫、氧等原子以配位键结合。磷酸化蛋白由于强负电荷的产生，从而在imac上亲和力强，必须采用强洗脱液才能被洗脱，因此达到将磷酸化蛋白特异富集的效果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的方法易于使用、耗时短(<2小时)，高通量，灵敏度高(可检测>100个磷酸化蛋白质)、重复性良好(r>0.99)。是一种无论从数量还是从种类上，挖掘到最多蛋白质组数据的有效方法，我们推测其可应用于非标记定量磷酸化蛋白质组学的技术转化研究。
(2)本发明的迷你蛋白反应器，称为spmc，可将蛋白质预浓缩，还原，烷基化，消化，脱盐和反相分馏无缝集成到单一的spintip设备。预计spmc将从不到10μl血清的样本中进行蛋白质组概况分析，并可能用于转化研究。
附图说明
图1是spmc迷你蛋白反应器的结构示意图；其中，1：10～200μl移液器吸头；2：适配器；3：imac磁珠；4：c18beads；5：500～2.0mleppendorf管。
图2是spmc富集到的蛋白质组学表明胰腺癌患者和健康人中蛋白质表达的不同；其中，①健康人血清蛋白组；②胰腺癌患者血清蛋白组。
图3是用spmc富集到的ca19-9重复性(用rsd％来表示)与普通方法(control)相比较的结果图。
图4是用spmc富集到的ca19-9灵敏度(用信噪比snr和峰面积来表示)与普通方法(control)相比较的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
实施例1
一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，称为spmc，其结构示意图如图1所示。该迷你蛋白反应器包括移液器吸头(1)、适配器(2)、imac磁珠(3)、c18beads(c18小柱)(4)、eppendorf管(eppendorf离心管)(5)；移液器吸头(1)内从下而上依次设置有若干c18beads(4)、若干imac磁珠(3)；c18beads(4)与imac磁珠(3)相互接触；适配器(2)套在移液器吸头(1)上，适配器(2)放在eppendorf管(5)上端；移液器吸头(1)的尖端插入至eppendorf管(5)内。
所述的移液器吸头优选为10～200μl移液器吸头；
所述的eppendorf管优选为500μl～2.0mleppendorf管；
所述的c18beads优选为2～5μmemporec18beads；更优选为3μmemporec18beads；
所述的imac磁珠优选为10～50μmimac磁珠；更优选为20μmimac磁珠；
根据蛋白质量计算c18beads的数量和imac磁珠的量；比如：0.4～1.5mgimac可用于2～20μg蛋白质的分离(约30μg蛋白质/mgbeads的结合力)
实施例2
本发明是利用spmc迷你蛋白反应器制备蛋白质组学样品的方法，依次包括以下步骤：
(1)血清样本的采集：收集pdac患者血清和健康人血清后，置于-80度冰箱保存。
(2)spmc的设计：如图1所示，spmc是通过将若干c18beads(3μmempore，usa)装入标准的200μl移液器吸头中，然后引入一定量的20μmporosimac磁珠(appliedbiosystems，usa)制成的。然后将spmc尖端通过适配器放入2.0mleppendorf管中。根据蛋白质量计算c18beads的数量和imac磁珠的量，比如：0.4～1.5mgimac可用于2～20μg蛋白质的分离(约30μg蛋白质/mgbeads的结合力)。
(3)富集：上样之前，从下而上依次设置有若干c18beads、若干imac磁珠的200μl移液器吸头分别用甲醇和10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)平衡。将待测血清通过70％(v/v)甲醇沉淀蛋白，然后用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)复溶蛋白，作为样品溶液，进行上样。
(4)还原：用含20％乙腈的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤后，通过注入含10mm的组氨酸或甘氨酸的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)用注射器注入尖端并在室温下孵育15分钟，加50mm二硫苏糖醇(dtt)还原蛋白质。
(5)烷基化及消化：用2mm胰蛋白酶加100mm碘乙酰胺烷基化，100mm碳酸氢铵(ph8)中灌注并在室温避光孵育60分钟。孵育后离心除去溶液。
(6)将肽从imac磁珠转移至具有200mmtris-hcl(ph8)的c18beads中。用200mmtris-hcl(ph8)离心洗涤脱盐后，用20μl梯度递增的含acn(5％，20％，50％和80％)的200mmtris-hcl(ph8)中的溶液离心洗脱。
(7)将洗脱的肽冷冻干燥并重新溶解于10μl的0.1％(v/v)甲酸(fa)水溶液中，做lc-ms/ms分析。
(8)所获得的样品通过orbitrapfusion质谱仪(thermofisherscientific)与qe(thermofisherscientific)超高压液相色谱(uhplc)泵进行分析。液相色谱分离系统由一个捕获柱(100μm×4cm)和一个(75μm×20cm)分析柱组成，内部填充3μmreprosil-purc18硅胶。
(9)用于分离的流动相是含0.1％(v/v)甲酸的水和含0.1％(v/v)甲酸的乙腈(acn)。首先将样品以2μl/min的流速分流到捕获柱上，然后通过分析柱以300nl/min的流速分离。梯度设定如下：2-60min，2-90％acn；60.1-70min，90-2％acn，平衡18分钟。全量程扫描m/z350-1550。ms/ms光谱采用最高速度法(3秒)以数据依赖模式采集。串联ms在三重四级杆(qqq)质量分析仪上进行，使用1.6da的采集间隔，标准化碰撞能量为10，动态排除时间设置为60s。
(10)用mascot软件匹配肽段对应的磷酸化蛋白，针对人类uniprot数据库搜索原始数据。母体化合物和质谱片段质量误差分别设定为10ppm和0.6da。蛋白质组学胰蛋白酶消化允许最多两次错过。将磷酸化设定为固定修饰，同时甲硫氨酸氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作为可变修饰。
(11)根据其分子量和样品总分数计算样品中每种蛋白质的浓度。胰腺癌患者和健康人血清蛋白浓度用主成分分析(pca)，用偏最小二乘法(pls-da)来校正算法。
我们应用上述的实验步骤，由图2可知，spmc富集到的蛋白质组学表明胰腺癌患者和健康人中蛋白质表达的不同，对pdac患者会特异性表达的蛋白如ca19-9，opn，timp1，lyve1，reg1a，tff1，muc5a，lrg1，thbs2，cea，hgf做了靶标蛋白组学研究，以此来验证我们的方法。结果发现，用本发明的方法稳定性(重复性)要高于用传统方法得到的结果(用rsd％值来评估，见图3)；此外，本发明的方法对标志性蛋白的检测灵敏度也有很大提高(图4)，在质谱上的响应更高(信噪比snr74.6，普通方法3.0)。
综上所述，我们开发了一个基于imac-c18spintips的创新平台，用于胰腺癌血清中的生物标志物深入研究。我们也展示了这个尖端的spmc平台在胰腺癌疾病早期诊断的生物标志物方面的重要性。经证实，胰腺癌血清蛋白组学对于pdac患者与正常人的分类具有明显的高容量，以及对于早期pdac患者，表现出显著的和特异性的蛋白作为其生物标志物。这种新方法在更广泛的蛋白组学研究中的应用可能揭示了其他恶性肿瘤潜在的相关生物标志物。本研究中发现的新的蛋白生物标志物的生物学功能的进一步研究，可能有助于对其它恶性肿瘤相关的病理研究。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。