本发明涉及一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法，属于药物提取与质量控制技术领域。
背景技术：
金银花为忍冬科植物忍冬(lonicerajaponicathunb.)的干燥花蕾或带初开的花，其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热的功能，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等多种疾病。在我国主产于山东、河南、湖南省，四川、贵州、广西、江西、江苏等省也有分布。我国人工栽培金银花已有270多年的历史，以山东、河南为主产区，通常认为山东产量大，而河南品质佳。近年来，广西融安县、忻城县等地进行人工栽培金银花，建立了大面积金银花商品种植基地。金银花中的主要活性成分有绿原酸类、黄酮类、苷类、环烯醚萜类等。按2010版中国药典规定，金银花中的标志性成分是绿原酸和木犀草苷，而是否含有木犀草苷是区别金银花和山银花的主要指标，也是正品金银花和山银花等同科植物在疗效上差异的主要原因。黄酮类化合物的生物活性日益被人们所关注，并逐渐成为研究热点，现代药理研究表明，金银花的黄酮成分有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、止咳祛痰、增强机体免疫等，故测定金银花中总黄酮的含量有重要意义。
现有技术中的总黄酮含量检测方法一般是通过现有的提取方法，如采用煎煮、乙醇回流提取等方法提取后，然后进行总黄酮的检测，但是提取的工艺参数是否恰当，无法验证，中间产物的质量得不到控制，直接影响最终总黄酮的含量检测，从而对产品是否合格可能会做出不正确的判断。
技术实现要素：
本发明旨在解决现有技术中质量评价方法不够完善，容易做出不正确的判断的问题，提供一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.金银花预处理
将干燥的金银花，粉碎成金银花粉末，加入乙醇浸泡，得到料液混合物；
b.初提
将步骤a得到的料液混合物加入超声提取装置中进行提取，得到初提物；
c.初提物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后分别取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，通过对照法确认提取效率，其中指标成分为芦丁和木犀草苷，色谱峰容量不得低于5；
具体地，对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液；取木犀草苷对照品适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
d.初提物浓缩
将步骤b得到的初提物用大孔吸附树脂吸附后，减压浓缩成浸膏，干燥粉碎后得到金银花总黄酮浸膏粉；
e.金银花黄酮提取物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，建立指纹图谱，进行相似度评价。
具体地，对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液；取木犀草苷对照品适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液。
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
为了更好地实现本发明，进一步地，步骤a中，所述金银花粉末的细度为20～40目。
进一步地，步骤a中，乙醇的体积浓度为70～80％，用量为金银花体积量的8～10倍；所述乙醇浸泡的时间为1～1.5h。
进一步地，步骤b中，超声提取前，先将料液的ph值调节为4～5，提取温度为60～65℃，频率为16～20khz，提取时间为30～40min。
进一步地，步骤b中，超声提取的溶剂为体积浓度为65～75％的乙醇。
进一步地，步骤c中，所述注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件为：色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长为350nm，流动相a为乙腈，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～15min，a/b：10/90→a/b：20/80；15～30min，a/b：20/80；30～40min，a/b：20/80→a/b：30/70。
进一步地，步骤d中，大孔吸附树脂吸附过程中，所述洗脱溶剂为体积浓度为55～65％的乙醇，用量为3bv，洗脱次数为2～4次，洗脱流速为1.5～2bv/h。
进一步地，步骤d中，浸膏的相对密度为1.05～1.1。
进一步地，步骤e中，所述注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件：色谱柱为c18色谱柱，检测波长为324nm，流动相a为甲醇，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～1min，a/b：30/70；1～2min，a/b：40/60；3～4min，a/b：50/50；4～5min，a/b：30/70。
更进一步地，步骤c和步骤e中，所述相似度评价的系统为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012a版。
本发明的有益效果：
(1)与现有技术中的质量评价方法相比，本发明通过对初提物先进行质量跟踪，对提取方法和提取率有一个初步的判断后，通过对初提物质量跟踪的结果，反过来对提取的工艺参数进行调整，以获得最佳的提取参数，然后再用大孔吸附树脂对初提物进行进一步纯化，最后对最终提取的总黄酮进行跟踪，测定总黄酮的含量，并通过相似度评价系统进行评价，实现对药物质量等级进行准确的判断。
(2)本发明步骤a中，金银花粉末的细度为20～40目，虽然金银花质地较松散，但是超声波对金银花粗粉的空化效应需要与颗粒尽可能大的表面积接触。金银花药材的粒度越小，则单位质量药材的总外表面积越大，就越容易空化效应的完成，使细胞内的活化成分经过溶剂的渗透向溶剂主体传递，可在较短的药材浸润时间内加大对流传质在颗粒内传质中所占有的比重，这些都有利于提高提取效率。且用乙醇水溶液提取更有利于有效成分的溶出。但是药材颗粒过于细小，会对实验过程中的过滤分离等操作带来困难，选择金银花粉末的细度选择20～40目，既能够满足提取效率又能够保证后续的过滤操作不受影响。
(3)本发明初提物采用高效液相色谱对照法作为提取效果评价，方法简便，快捷；终产品采用超高效液相色谱绘制金银花指纹图谱，更叫准确可靠。
附图说明
图1为实施例3木犀草苷、芦丁对照品色谱图；
图2为实施例3初提物色谱图；
图3为实施例3对照品溶液的超高效液相指纹图谱；
图4为实施例35个批次样品超高效液相指纹图谱；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法，包括以下步骤：
a.金银花预处理
将干燥的金银花，粉碎成金银花粉末，加入乙醇浸泡，得到料液混合物；
b.初提
将步骤a得到的料液混合物加入超声提取装置中进行提取，得到初提物；
c.初提物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后分别取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，通过对照法确认提取效率，其中指标成分为芦丁和木犀草苷，色谱峰容量不得低于5；
d.初提物浓缩
将步骤b得到的初提物用大孔吸附树脂吸附后，减压浓缩成浸膏，干燥粉碎后得到金银花总黄酮浸膏粉；
e.金银花黄酮提取物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，建立指纹图谱，进行相似度评价。
具体地，对照品溶液制备方法：取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液；取木犀草苷对照品适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液。
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
本实施例中步骤a中，所述金银花粉末的细度为20目。
步骤a中，乙醇的体积浓度为70％，用量为金银花体积量的8倍；所述乙醇浸泡的时间为1h。
步骤b中，超声提取前，先将料液的ph值调节为4，提取温度为60℃，频率为16khz，提取时间为30min。
步骤b中，超声提取的溶剂为65％的乙醇。
步骤c中，所述注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件为：色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长为350nm，流动相a为乙腈，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～15min，a/b：10/90→a/b：20/80；15～30min，a/b：20/80；30～40min，a/b：20/80→a/b：30/70。
步骤d中，大孔吸附树脂吸附过程中，所述洗脱溶剂为体积浓度为55％的乙醇，用量为3bv，洗脱次数为3次，洗脱流速为1.5bv/h。
步骤d中，浸膏的相对密度为1.05。
步骤e中，所述注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件：色谱柱为c18色谱柱，检测波长为324nm，流动相a为甲醇，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～1min，a/b：30/70；1～2min，a/b：40/60；3～4min，a/b：50/50；4～5min，a/b：30/70。
步骤c和步骤e中，所述相似度评价的系统为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012a版。
实施例2
一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法，包括以下步骤：
a.金银花预处理
将干燥的金银花，粉碎成金银花粉末，加入乙醇浸泡，得到料液混合物；
b.初提
将步骤a得到的料液混合物加入超声提取装置中进行提取，得到初提物；
c.初提物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后分别取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，通过对照法确认提取效率，其中指标成分为芦丁和木犀草苷，色谱峰容量不得低于5；
具体地，对照品溶液的制备：取木犀草苷对照品适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
d.初提物浓缩
将步骤b得到的初提物用大孔吸附树脂吸附后，减压浓缩成浸膏，干燥粉碎后得到金银花总黄酮浸膏粉；
e.金银花黄酮提取物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，建立指纹图谱，进行相似度评价。
具体地，对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液；取木犀草苷对照品适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液。
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
本实施例步骤a中，所述金银花粉末的细度为40目。
步骤a中，乙醇的体积浓度为80％，用量为金银花体积量的10倍；所述乙醇浸泡的时间为1.5h。
步骤b中，超声提取前，先将料液的ph值调节为5，提取温度为65℃，频率为20khz，提取时间为40min。
步骤b中，超声提取的溶剂为体积浓度为75％的乙醇。
步骤c中，所述注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件为：色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长为350nm，流动相a为乙腈，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～15min，a/b：10/90→a/b：20/80；15～30min，a/b：20/80；30～40min，a/b：20/80→a/b：30/70。
步骤d中，大孔吸附树脂吸附过程中，所述洗脱溶剂为体积浓度为55～65％的乙醇，用量为3bv，洗脱次数为2次，洗脱流速为2bv/h。
步骤d中，浸膏的相对密度为1.1。
步骤e中，所述注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件：色谱柱为c18色谱柱，检测波长为324nm，流动相a为甲醇，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～1min，a/b：30/70；1～2min，a/b：40/60；3～4min，a/b：50/50；4～5min，a/b：30/70。
步骤c和步骤e中，所述相似度评价的系统为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012a版。
实施例3
一种金银花总黄酮提取过程中的质量评价方法，包括以下步骤：
a.金银花预处理
将干燥的金银花，粉碎成金银花粉末，加入乙醇浸泡，得到料液混合物；
b.初提
将步骤a得到的料液混合物加入超声提取装置中进行提取，得到初提物；
c.初提物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后分别取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，通过对照法确认提取效率，其中指标成分为芦丁和木犀草苷，色谱峰容量不得低于5；
用苯基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.5％冰醋酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论塔板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。
具体地，对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液，即得；取木犀草苷对照品(来源于中检所，品种编号111720)适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；结果如图1、图2所示。
d.初提物浓缩
将步骤b得到的初提物用大孔吸附树脂吸附后，减压浓缩成浸膏，干燥粉碎后得到金银花总黄酮浸膏粉；
e.金银花黄酮提取物质量评价
首先制备对照品溶液和供试品溶液，然后取对照品溶液与供试品溶液各10ul，分别注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱，建立指纹图谱，进行相似度评价。
具体地，对照品溶液制备：取芦丁对照品(来源于中检所，品种编号100080)适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液；取木犀草苷对照品(来源于中检所，品种编号111720)适量，精密称定，加40％乙醇制成毎1ml含40ug的溶液。
供试品溶液的制备：取步骤d得到的金银花总黄酮浸膏粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率：250w，频率35khz)1小时，放冷，再称定重量，用40％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取滤液10ml，回收溶剂至干，残渣用40％乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，即得。
对照品色谱图如图3所示，最终提取物色谱图如图4所示；
本实施例步骤a中，所述金银花粉末的细度为40目。
步骤a中，乙醇的体积浓度为75％，用量为金银花体积量的9倍；所述乙醇浸泡的时间为1h。
步骤b中，超声提取前，先将料液的ph值调节为5，提取温度为60℃，频率为18khz，提取时间为35min。
步骤b中，超声提取的溶剂为体积浓度为70％的乙醇。
步骤c中，所述注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件为：色谱柱为苯基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长为350nm，流动相a为乙腈，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～15min，a/b：10/90→a/b：20/80；15～30min，a/b：20/80；30～40min，a/b：20/80→a/b：30/70。
步骤d中，大孔吸附树脂吸附过程中，所述洗脱溶剂为体积浓度为60％的乙醇，用量为3bv，洗脱次数为4次，洗脱流速为1.8bv/h。
步骤d中，浸膏的相对密度为1.05。
步骤e中，所述注入超高效液相色谱仪中进行梯度洗脱的条件：色谱柱为c18色谱柱，检测波长为324nm，流动相a为甲醇，流动相b为质量浓度为0.5％的冰醋酸，洗脱时，0～1min，a/b：30/70；1～2min，a/b：40/60；3～4min，a/b：50/50；4～5min，a/b：30/70。
步骤c和步骤e中，所述相似度评价的系统为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012a版。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。