一种琴叶榕的质量检测方法与流程

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种琴叶榕的质量检测方法。

背景技术

琴叶榕来源于桑科榕属植物琴叶榕ficuspanduratahance，以根、叶入药，其性温，味甘、微辛，具有祛风除湿、解毒消肿、行气、活血调经、舒筋通络、疗疟、通乳汁的功效。民间常以琴叶榕单味药或复方用药的形式治疗跌打损伤、月经不调、腰酸背痛、黄疸、乳痈、疟疾、乳腺炎、胃痛、百日咳、毒蛇咬伤、湿热中阻，恶心不欲食之证等。研究发现，琴叶榕对于细菌性前列腺炎具有一定的疗效，且对于肝损伤有较好的抑制修复功效，可见其具有较高的药用价值。

琴叶榕化学成分主要包含三萜类、香豆素类、黄酮类、酚酸类等。huiqinglv等人从琴叶榕的醇提液中分离鉴定了补骨脂素和佛手柑內酯，但未见其定性鉴别及含量测定方面的报道，也未见药材质量检测方法的相关报道。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种琴叶榕的质量检测方法，该方法专属性好、耐用性强，稳定性好，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种琴叶榕的质量检测方法，包括以下方法：

（1）补骨脂素的薄层色谱定性鉴别：

取琴叶榕根0.5g，加乙酸乙酯15-25ml，超声处理10-20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品各4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为正己烷-乙酸乙酯=2-4:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯365nm下检视；结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

（2）佛手柑內酯的薄层色谱定性鉴别：

取琴叶榕根0.5g，加甲醇15-25ml，超声处理10-20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取佛手柑內酯对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各4μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以体积比为正己烷-乙酸乙酯=2-4:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，结果显示，供试品色谱在与对照品相同色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

（3）补骨脂素和佛手柑內酯的含量测定：

采用高效液相色谱法进行测定，具体方法和步骤如下：

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为55:45的甲醇-水为流动相；检测波长为246nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，理论板数按补骨脂素、佛手柑內酯计算，均计算应不低于3000；

对照品溶液的制备分别精密称取补骨脂素对照品、佛手柑內酯对照品均为10.2mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密量取1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备将琴叶榕根粉碎成最粗粉，取药材粗粉1.0g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取混合标准品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

补骨脂素的薄层色谱定性鉴别中，本发明考察了不同展开剂对色谱行为的影响：以体积比为正己烷-乙酸乙酯（4:1）展开剂展开，发现待测化合物斑点rf值约为0.125，相邻斑点与待测化合物斑点的分离度基本达到要求，但图谱背景颜色深，对待测化合物斑点造成一定程度的干扰。以体积比为正己烷-乙酸乙酯（2:1）的展开剂展开，待测化合物斑点rf值约0.5，供试品色谱中，在与对照品斑点色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，薄层图中主斑点清晰易辩，分离度好，相邻斑点无干扰。故选用体积比为正己烷-乙酸乙酯2-4:1的展开系统，优选为体积比为正己烷-乙酸乙酯=2:1的展开系统。

佛手柑內酯的薄层色谱定性鉴别中，本发明考察了不同展开剂对色谱行为的影响：以体积比为正己烷-乙酸乙酯（4:1）展开剂展开，发现待测化合物斑点rf值约为0.125，相邻斑点与待测化合物斑点的分离度基本达到要求，但图谱背景颜色深，对待测化合物斑点造成一定程度的干扰。以体积比为正己烷-乙酸乙酯（2:1）的展开剂展开，待测化合物斑点rf值约0.5，供试品色谱中，在与对照品斑点色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，薄层图中主斑点清晰易辩，分离度好，相邻斑点无干扰。故选用体积比为正己烷-乙酸乙酯2-4:1的展开系统，优选体积比为正己烷-乙酸乙酯=2:1的展开系统。

通过参考相关文献及琴叶榕根的hplc全图谱检测结果发现，其根中仅补骨脂素与佛手柑内酯含量较高，且其他成分含量几乎可以不计。因此，本发明选择补骨脂素与佛手柑内酯作为指标成分是合理的，该两种化合物稳定性好，减少了系统误差的引入，提高测定结果的准确性和重现性，保证琴叶榕质量的稳定性和质量可控性。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明首次建立了琴叶榕的质量检测方法，包括对补骨脂素和佛手柑內酯进行薄层定性鉴别，并利用高效液相对其含量进行测定。该薄层鉴别方法专属性强，阴性无干扰，该含量测定方法具有较强的专属性、耐用性，其准确性、重现性、稳定性均能达到科研和生产的要求，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。

附图说明

图1为琴叶榕中补骨脂素的薄层鉴别色谱图；其中1-2分别为：补骨脂素对照品、琴叶榕根；

图2为琴叶榕中佛手柑內酯的薄层鉴别色谱图；其中1-2分别为：佛手柑內酯对照品、琴叶榕根；

图3为补骨脂素和佛手柑內酯对照品hplc图（0～10min,5%甲醇～55%甲醇；10～20min,55%甲醇～95%甲醇）；

图4为补骨脂素和佛手柑內酯对照品hplc图（0～10min,5%甲醇～55%甲醇；10～20min,55%甲醇–45%水）；

图5为补骨脂素和佛手柑內酯对照品hplc图（0～15min，55%甲醇–45%水）；

图6为琴叶榕样品hplc图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：

一种琴叶榕的质量检测方法，包括以下方法：

1仪器与试药

1.1仪器agilent1100型高效液相色谱仪，bs224s型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，d=0.0001g）；kq3200e医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；hh-s4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；东方-a型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）。

1.2试药琴叶榕药材为自采于广东省江门市，经广州中医药大学生药鉴定教研室黄海波教授鉴定为桑科榕属植物琴叶榕ficuspanduratahance的干燥根；补骨脂素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110878-200102）；佛手柑內酯对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：must-17053003）；硅胶g薄层板（青岛海洋化工厂）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

薄层色谱定性鉴别

2.1补骨脂素的薄层色谱定性鉴别：

取琴叶榕根0.5g，加乙酸乙酯20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品各4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为正己烷-乙酸乙酯=2:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯365nm下检视；结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，如图1所示。

2.2佛手柑內酯的薄层色谱定性鉴别：

取琴叶榕根0.5g，加甲醇20ml，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取佛手柑內酯对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各4μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以体积比为正己烷-乙酸乙酯=2:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，如图2所示。

补骨脂素和佛手柑內酯的含量测定：

3.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为55:45的甲醇-水为流动相；检测波长为246nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，理论板数按补骨脂素、佛手柑內酯计算，均计算应不低于3000；

3.2对照品溶液的制备分别精密称取补骨脂素对照品、佛手柑內酯对照品10.2mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密量取1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

3.3供试品溶液的制备将琴叶榕根粉碎成最粗粉，取各药材粗粉1.0g，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

系统适用性试验:

3.5线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液适量，稀释成1.02ug/ml、2.04ug/ml、4.08ug/ml、8.16ug/ml、16.32ug/ml、32.64ug/ml的系列混合标准溶液，并精密吸取上述各浓度的标准溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以进样浓度（μg·ml-1）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，补骨脂素回归方程为y=76.48x－29.35，r=0.9997，补骨脂素浓度在1.02~32.64μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系；佛手柑內酯y=46.61x－18.33，r=0.9997，佛手柑內酯浓度在1.02~32.64μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.6精密度试验：精密吸取对照品溶液10μl，重复进样6次，计算各峰面积的均值及rsd值，补骨脂素rsd值为0.75%，佛手柑內酯rsd值为0.67%，结果表明仪器精密度良好。

3.7稳定性试验：取同一批号的供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8、12h时注入高效液相色谱仪并计算各色谱峰面积，结果补骨脂素色谱峰面积的rsd值为1.13%，佛手柑內酯色谱峰面积的rsd值为1.06%，表明供试品溶液在12小时内稳定。

3.8重复性试验：取同一批号的样品约0.5g，共6份，按供试品溶液制备方法操作，注入高效液相色谱仪，依法测定，结果补骨脂素色谱峰面积的rsd值为0.85%，佛手柑內酯色谱峰面积的rsd值为0.65%。

3.9加样回收率试验：精密称取已测知含量的琴叶榕粗粉（0.513mg·g-1）6份，每份约0.5g，分别精密加入不同量的补骨脂素、佛手柑內酯对照品，按供试品溶液制备方法操作，按照上述色谱条件测定，并计算回收率和rsd，结果补骨脂素的平均回收率为100.2%，rsd=1.13%（n=6）；佛手柑內酯的平均回收率为99.8%，rsd值为1.12%（n=6），回收率符合要求。

耐用性考察：

4.0不同波长考察

分别精密称取补骨脂素对照品、佛手柑內酯对照品10.0mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密量取1ml置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为待测液，依次以紫外分光光度计进行全波长（200～400nm）扫描。结果显示，补骨脂素标准品溶液在244.60nm处有最强吸收；佛手苷内酯标准品溶液在248.80nm处有最强吸收。进一步试验，选取246nm的波长考察，结果显示，补骨脂素与佛手苷内酯在此波长条件下都有较好的吸收，且均接近各自的最强吸收，故选用246nm作为最佳吸收波长进行后续试验的考察。

4.1流动相组成比例考察试验

选择甲醇-水作为流动相考察对象，以补骨脂素与佛手苷内酯混合制备的标准品溶液进行试验：

试验一，流动相以0～10min，5%甲醇～55%甲醇；10～20min，55%甲醇～95%甲醇的梯度变化，结果显示补骨脂素与佛手苷内酯的特征峰在该条件下未能有效地分离开。

试验二，流动相以0～10min，5%甲醇～55%甲醇；10～20min，55%甲醇–45%水的变化，结果显示补骨脂素与佛手苷内酯两者的特征峰虽然有比较清晰的分离度，但其出峰时间偏长，易造成试剂浪费与环境破坏。

试验三，基于试验一与试验二的结果，调整流动相以0～15min,55%甲醇–45%水的等度变化，其结果显示，补骨脂素与佛手苷内酯两者的特征峰分离度优于前述两个试验，且出峰时间短，有利于避免不必要的试剂浪费，既经济又环保。

综上，故优选用0～15min，55%甲醇-45%水的等度洗脱方法进行下述液相分析。

批琴叶榕供试品的含量测定

分别取3批琴叶榕粗粉进行测定，结果如表1所示：

表1

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