一种用于癌细胞及H2O2检测的纸基传感器的构建的制作方法

本发明涉及细胞内过氧化氢（h2o2）的检测方法，具体地说是一种基于微流控纸基的分析装置（μ-pad）的特点构建了一个用于测定癌细胞数量及其释放的h2o2的含量的电化学发光传感器。

背景技术

h2o2是存在于不同生物组织中的常见且重要的分子，同时也涉及细胞的各种功能和信号转导过程。细胞内h2o2在调节多种生物过程如老化和致癌过程中起着内在的作用。在正常的生理条件下，细胞内h2o2具有相当低的生理浓度，过高浓度的h2o2会引发各种疾病，比如心血管疾病，肿瘤，神经变性等。因此，能够灵敏地定量检测细胞内的h2o2含量对于人类疾病的治疗具有重要价值。迄今为止，很多检测方法比如化学发光法，荧光分析和电子自旋共振，都被用来测定细胞内h2o2。然而，这些分析系统通常会受到灵敏度有限的固有缺陷的困扰，并依赖于复杂的特定基础设施。因此，发展中国家和资源有限的偏远地区迫切需要一种便携式的和低成本的检测方法来灵敏地分析细胞内h2o2。

自从whitesides教授提出了μ-pads的概念后，纸张便以其可携带性，极低的价格和令人赞赏的生物相容性等特点吸引了越来越多研究者们的注意。此外，电化学发光技术作为一种有前途的分析方法，具有设备简单，重复性好，可控性和灵敏度高等优点，已被广泛应用于dna分析，免疫测定，食品和环境检测以及临床诊断等方面。但到目前为止，关于利用电化学发光分析细胞内h2o2的研究，尤其是在纸芯片器件上利用电化学发光分析方法实现细胞及其释放的h2o2现场检测未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建一种用于癌细胞及h2o2检测的纸基传感器。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种用于癌细胞及h2o2检测的纸基传感器的构建，其特征是包括以下步骤：

（1）纸芯片的工作区域进行aupd纳米粒子修饰；

（2）一定浓度的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）处理得到的工作区域表面，后滴加20μl氨基化的ru@sio2-au溶液；

（3）9μl5μmol/l二茂铁-dnai滴加到步骤（2）修饰的工作区域表面，室温，孵育24h，用磷酸缓冲盐溶液清洗；

（4）10μl5.0mmol/l刀豆球蛋白a水溶液滴加到步骤（3）修饰的工作区域表面，室温，孵育40min，用磷酸缓冲盐溶液清洗，后滴加10μl牛血清白蛋白进行细胞非活性位点封闭，室温，孵育2h；

（5）向步骤（4）中得到的纸芯片工作区域滴加10μl不同浓度梯度的均匀细胞悬液，室温，孵育1h，用培养缓冲液冲洗，4ºc下放置，将磷酸盐缓冲溶液和三丙胺混合溶液滴加到上述体系中，测量其电化学发光强度；

（6）向步骤（5）体系中加入一定量含有佛波酯的磷酸缓冲盐溶液溶液，测定其电化学发光强度，对比步骤（5）与步骤（6）的电化学发光强度，建立h2o2的浓度和癌细胞的数量与电化学发光强度关系。

本发明所述的纸芯片的构建的具体步骤如下：利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150ºc下2min，未打印蜡的地方为亲水区，三维折纸上的疏水屏障形状是由adobeillustratorcs6软件设计的，折纸装置由一个常见的银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个辅助区（直径8mm）和一个工作区域（直径8mm），沿折叠线（宽度1mm）处折叠（见附图1）。

本发明所述aupd纳米粒子在纸芯片的工作区域进行修饰的具体步骤如下:将80ml0.24mmol/l氯金酸溶液加热到96ºc，保持1min，后加入2.8ml34mmol/l新制的柠檬酸钠，反应10min，颜色变成酒红色，au种子溶液制备成功，取35μlau种子溶液滴加到工作区域的表面，室温，平衡1h，后用二次纯水清洗，然后，2ml20mmol/l四氯合钯(ii)酸水溶液，0.05ml0.1mol/l十八烷基三甲基氯化铵溶液和50μl1mmol/l乙酸铜水溶液依次加入到3ml~5ml1mmol/l氯金酸水溶液中，混合均匀，后取50μl~80μl上述混合溶液滴加到工作区域的表面，并快速滴加新制备的抗坏血酸水溶液，室温，静置2h，后在转速9000rpm下，离心5min，用二次纯水清洗3~4次，工作区域表面形成一层aupd纳米粒子（见附图2）。

本发明所述的一定浓度的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）处理得到的工作区域表面的具体步骤如下：80μl0.1mol/l巯基乙胺水溶液滴在修饰aupd纳米粒子的工作区域表面，室温，放置2h，用二次纯水清洗。

本发明所述的氨基化的ru@sio2-au材料制备的具体步骤如下：1.77ml曲通x-100，7.5ml环己烷，1.8ml1-己醇和80μl0.1mol/l联吡啶钌分别加入到340μl二次纯水中，后加入100μl正硅酸乙酯，60μl（25％，wt％）氨水，室温，搅拌24h，获得的产物用丙酮清洗，离心，后用乙醇和水洗涤3次，将获得的产物分散于5ml无水乙醇溶液中，取其3ml加入200μl乙氧基硅烷，混合，搅拌40min，用水和无水乙醇洗涤4次，将其分散到2ml水中，取其1ml加入2mlau种子溶液，室温，搅拌2h，后离心，用二次纯水清洗3次，后将获得的ru@sio2-au分散于1ml二次纯水中（见附图3）。

本发明所述的dnai的5′端带有巯基。

本发明所述的向步骤（5）体系中加入一定量含有佛波酯的磷酸缓冲盐溶液溶液的具体步骤如下：向步骤（5）中加入20μl含含有200ng/ml佛波酯的磷酸盐缓冲溶液，37ºc，孵育2min，测量其电化学发光强度（见附图4）。

本发明的有益效果：

（1）ru@sio2-au纳米复合材料中使用了良好的电导体au纳米粒子，以增强电化学发光信号；

（2）在佛波酯的刺激下，aupd纳米粒子催化细胞内释放的h2o2，并产生•oh，切割dna链i，使信号打开；

（3）大量修饰在dnai上的二茂铁分子从工作区域表面离开，使得电化学发光信号明显地降低；

（4）这项工作提供了一个真正的低成本，简单的纸基化学传感装置，其具有灵敏度高，特异度高，稳定性好等优点，对细胞生物学和病理生理学具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为纸基分析装置的示意图；

图2为aupd纳米粒子的扫描电镜图像；

图3为ru@sio2-au复合材料的扫描电镜图像；

图4为mcf-7细胞内h2o2的检测过程示意图。

具体实施方式

一种用于mcf-7癌细胞及h2o2检测的纸基传感器的构建：

（1）利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150ºc下2min，未打印蜡的地方为亲水区，三维折纸上的疏水屏障形状是由adobeillustratorcs6软件设计的，折纸装置由一个常见的银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个辅助区（直径8mm）和一个工作区域（直径8mm），沿折叠线（宽度1mm）处折叠；

（2）将80ml0.24mmol/l氯金酸溶液加热到96ºc，保持1min，后加入2.8ml34mmol/l新制的柠檬酸钠，反应10min，颜色变成酒红色，au种子溶液制备成功，取35μlau种子溶液滴加到工作区域的表面，室温，平衡1h，后用二次纯水清洗，然后，2ml20mmol/l四氯合钯(ii)酸水溶液，0.05ml0.1mol/l十八烷基三甲基氯化铵溶液和50μl1mmol/l乙酸铜水溶液依次加入到3ml1mmol/l氯金酸水溶液中，混合均匀，后取65μl上述混合溶液滴加到工作区域的表面，并快速滴加新制备的抗坏血酸水溶液，室温，静置2h，后在转速9000rpm下，离心5min，用二次纯水清洗4次，工作区域表面形成一层aupd纳米粒子；

（2）80μl0.1mol/l巯基乙胺水溶液滴在修饰aupd纳米粒子的工作区域表面，室温，放置2h，用二次纯水清洗；

（3）1.77ml曲通x-100，7.5ml环己烷，1.8ml1-己醇和80μl0.1mol/l联吡啶钌分别加入到340μl二次纯水中，后加入100μl正硅酸乙酯，60μl（25％，wt％）氨水，室温，搅拌24h，获得的产物用丙酮清洗，离心，后用乙醇和水洗涤3次，将获得的产物分散于5ml无水乙醇溶液中，取其3ml加入200μl乙氧基硅烷，混合，搅拌40min，用水和无水乙醇洗涤4次，将其分散到2ml水中，取其1ml加入2mlau种子溶液，室温，搅拌2h，后离心，用二次纯水清洗3次，后将获得的ru@sio2-au分散于1ml二次纯水中；

（4）取20μl氨基化的ru@sio2-au，滴加到巯基乙胺修饰的工作区域表面；

（5）9μl5μmol/l二茂铁-dnai滴加到步骤（2）修饰的工作区域表面，室温，孵育24h，用0.1mol/lph7.4磷酸缓冲盐溶液清洗；

（6）10μl5mmol/l刀豆球蛋白a水溶液滴加到步骤（3）修饰的工作区域表面，室温，孵育40min，用0.1mol/lph7.4磷酸缓冲盐溶液清洗，后滴加10μl牛血清白蛋白进行非活性位点封闭，室温，孵育2h；

（7）向步骤（4）中得到的纸芯片工作区域滴加10μl1.0×10²~5.0×10⁸均匀的mcf-7细胞悬液，室温，孵育1h，用培养缓冲液冲洗，4ºc下放置，测量时，将0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液和1mmol/l三丙胺混合溶液以体积比1:2滴加到上述体系中，扫速200mv/s，电压0~1.0v，放大级数4，测量其电化学发光情况；

（8）向步骤（4）的电化学发光体系中，加入20μl含有200ng/ml佛波酯的磷酸盐缓冲溶液，37ºc，孵育2min，扫速200mv/s，电压0~1.0v，放大级数4，测量其电化学发光情况。

电化学发光强度与mcf-7癌细胞的数量（1.0×10²~5.0×10⁸cells/ml）展现出良好的线性关系，其线性回归方程为i=1170.743lgc(cell)-1241.259，相关系数r=0.9920。同时，电化学发光强度与h2o2浓度（200pmol/l~1μmol/l）呈线性关系，其线性回归方程为i=1314.008lgc(h2o2)+13502.731，相关系数r=0.9910。用于mcf-7癌细胞及h2o2检测的纸基电化学发光传感器的检测限为30cell/ml，因此，这项工作实现了高灵敏度、高稳定性地检测mcf-7癌细胞与细胞内h2o2。

序列表

<110>济南大学

<120>一种用于癌细胞及h2o2检测的纸基传感器的构建

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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