本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒及其应用。
背景技术
小分子化学污染物的多残留检测一直是免疫分析的重点和难点。目前主要有以下两种模式：(1)基于单一特异性抗体的模式。分别制备针对多个污染物的单一特异性抗体，通过酶标板上的不同微孔或者生物芯片上不同阵列实现不同目标物的区分，但不能实现同一反应体系的同时检测。(2)基于广谱特异性抗体的模式。只需要制备一种抗体，就可以同时测定多种污染物的总量，但不能实现分别定量，且可能会与非目标物有交叉反应。
技术实现要素：
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种既可以在同一反应体系中同时检测，又能实现分别定量的有机磷农药多残留检测方案。
本发明提供了一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；
所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；
所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条
所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。
优选的，所述三唑磷的包被浓度为0.12～0.2mg/l，所述对硫磷的包被浓度为0.56～0.7mg/l，所述毒死蜱的包被浓度为0.8～0.94mg/l。
优选的，所述胶体金探针溶液的摩尔浓度为8～10nmol/l；所述金纳米粒子的粒径为12～14nm。
优选的，所述洗液含有体积分数0.1～1％吐温-20的0.005～0.015mol/l的pbs缓冲液。
优选的，所述二硫苏糖醇溶液的摩尔浓度为18～22nmol/l。
优选的，所述荧光基团包括6-fam、cy-3和texasred。
优选的，所述试剂盒中还包括农药标准品。
优选的，所述胶体金探针的制备方法包括胶体金的合成、生物条形码的活化、特异性单抗的标记和生物条形码的标记。
本发明还提供了上述试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。
优选的，所述检测有机磷农药多残留的方法包括如下步骤：
(1)向包被有抗原的黑色酶标板中加入待测样品和胶体金探针溶液，37℃孵育0.5～2h，用洗液洗板；
(2)向所述步骤(1)洗板后的酶标板孔中加入二硫苏糖醇溶液，37℃振荡反应1～3h，检测不同颜色荧光基团的荧光信号，分别测定荧光值；
(3)将测定的荧光值分别代入相应荧光信号的标准曲线形成的标准方程式中，计算得到不同类型有机磷农药残留的量。
有益效果：
本发明提供的有机磷农药多残留检测试剂盒包括包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。利用本发明提供的试剂盒能在同一反应体系中实现对多种有机磷农药残留的同时检测。同时，本发明利用免疫学原理将抗原抗体的特异性结合与荧光寡核苷酸的信号放大技术结合起来，以不同的荧光标记对应不同的抗原，从而实现在同一反应体系检测多种不同抗原残留的同时，实现对多种不同抗原残留的分别定量。
附图说明
图1为本发明实施例1所述方案流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；
所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；
所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；
所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括包被有抗原的黑色酶标板，所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱。所述三唑磷的包被浓度优选为0.12～0.2mg/l，更优选为0.16mg/l，所述对硫磷的包被浓度优选为0.56～0.7mg/l，更优选为0.63mg/l，所述毒死蜱的包被浓度优选为0.8～0.94mg/l，更优选为0.87mg/l。
在本发明中，所述包被有抗原的黑色酶标板优选按如下方法制备：将抗原溶液添加到酶标板中，包被，第一次洗板后用封闭液封闭，第二次洗板。
在本发明中，所述抗原优选为三唑磷、对硫磷、毒死蜱的完全抗原混合液。所述完全抗原是由ova分别偶联三唑磷、对硫磷、毒死蜱的半抗原得到。本发明对所述偶联方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的偶联方案即可。
在本发明中，所述抗原溶液添加到酶标板中的体积优选为50～120μl，更优选为100μl。所述包被的温度优选为2～6℃，更优选为4℃。所述包被的时间优选为6～18h，更优选为8～12h。所述洗板用溶液为洗液。所述洗液优选为含有吐温-20的pbs缓冲液，所述吐温-20的体积浓度优选为0.1～1％，更优选为0.3～0.7％，最优选为0.5％；所述pbs缓冲液的摩尔浓度优选为0.005～0.015mol/l，更优选为0.01mol/l。第一次洗板的目的是洗去未与酶标板结合的抗原。所述洗液在第一次洗板中的用量优选为280～320μl/孔，更优选为300μl/孔。所述洗板的次数优选为2～4次，更优选为3次。
在本发明中，所述封闭的温度优选为30～40℃，更优选为37℃。所述封闭的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。在本发明中，所述封闭液优选为含有bsa的pbs缓冲液，所述bsa的质量浓度优选为1～3％，更优选为2％。所述pbs缓冲液的浓度优选为0.005～0.015mol/l，更优选为0.01mol/l。所述封闭液的添加量优选为200～350μl，更优选为300μl。第二次洗板的目的是去除酶标板中的封闭液，所述洗液在第二次洗板中的用量优选为280～320μl/孔，更优选为300μl/孔。所述洗板的次数优选为2～4次，更优选为3次。
在本发明中，所述包被在黑色酶标板中的抗原与农药标准品或待测样品中的有机磷农药残留竞争结合特异性抗体。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括胶体金探针溶液。在本发明中，所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述生物条形码包括不同颜色荧光基团标记的生物条形码。修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。本发明所述生物条形码序列优选由连续t碱基组成，长度为条形码合成公司所能生产的最短序列，其3’端修饰荧光基团，5’端修饰巯基(-sh)，荧光基团数目与其种类和合成技术有关。在本发明的实施例中，所述生物条形码由上海生工生物工程股份有限公司合成，三唑磷和对硫磷对应的序列为ttttt，毒死蜱对应的序列为tttttttttt。
在本发明中，所述生物条形码的两端分别由巯基和荧光基团标记，不同的荧光和抗体对应不同的农药，从而可实现在同一微孔中农药的多残留检测。所述荧光基团优选包括6-fam、cy-3和texasred。本发明将生物条形码标记于纳米粒子表面，一个金纳米粒子表面可同时标记130～170条生物条形码，每个生物条形码都有荧光标记，从而能实现信号放大，大大提高检测灵敏度。
在本发明中，所述胶体金探针的制备优选包括胶体金的合成、生物条形码的活化、特异性单抗的标记和生物条形码的标记。
在本发明中，所述胶体金的合成的方法优选包括以下步骤：将haucl4水溶液在磁力搅拌下加热至沸腾，加入柠檬酸三钠溶液，伴随磁力搅拌和加热直至溶液变为深红色，反应15min，得到胶体金溶液。所述胶体金溶液合成后，本发明优选过滤。所述过滤后金纳米粒子溶液的粒径优选为10～15nm，更优选为12～14nm，最优选为13nm。haucl4水溶液的浓度为1mmol/l，所述柠檬酸三钠溶液的浓度为38.8mmol/l；haucl4水溶液和柠檬酸三钠溶液的体积比为10:1。所述过滤后金纳米粒子溶液优选在4℃储存备用。
在本发明中，所述生物条形码的活化方法优选包括以下步骤：分别将由巯基和不同荧光基团标记的生物条形码离心0.5～3min，用te缓冲液溶解后，加入活化液，室温下震荡2～3h。在本发明中，所述活化液优选为tcep溶液，所述tcep溶液的浓度优选为15～25mmol/l，更优选为20mmol/l。所述tcep的添加量与生物条形码的质量比优选为150～250:1，更优选为200:1。所述活化的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。所述活化的时间优选为2～3h，更优选为2.5h。
在本发明中，所述抗体的标记方法优选包括以下步骤：将三唑磷抗体、对硫磷抗体或毒死蜱抗体分别与上述胶体金溶液混合，孵育。所述胶体金溶液在混合时的ph值优选为8.5～9.5，更优选为9.0。所述孵育的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。本发明优选使用0.1mol/l的k2co3溶液对胶体金溶液的ph值进行调节。
在本发明中，所述生物条形码的标记方法优选包括以下步骤：将上述活化的生物条形码分别加入到对应的抗体标记胶体金溶液中，依次加入peg溶液和pbs溶液，孵育。所述peg溶液优选为质量浓度30％的peg20000。所述peg溶液加入的终浓度优选为质量浓度0.5～2％，更优选为质量浓度1％。加入peg溶液可以有效防止胶体金的不可逆聚集。所述pbs溶液的浓度优选为0.1mol/l，所述pbs溶液加入的终浓度优选为0.005～0.02mol/l，更优选为0.01mol/l。所述孵育的温度优选为20～28℃，更优选为25℃，所述孵育的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。
本发明经过胶体金的合成、生物条形码的活化、特异性单抗的标记和生物条形码的标记，最终制备得到所需的胶体金探针溶液。本发明对制备得到的胶体金探针溶液进行封闭，所述封闭优选使用质量浓度10％的bsa溶液进行，所述bsa溶液的添加终浓度优选为质量浓度0.5～2％，更优选为质量浓度1％。所述封闭的时间优选为30～60min，更优选为40～50min。封闭结束后，本发明优选对胶体金溶液离心、重悬。所述离心的转速优选为11000～15000rpm，更优选为13000rpm，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。所述重悬液优选使用含有peg和bsa的pbs缓冲液；所述peg的质量浓度优选为0.5～3％，更优选为1％，所述bsa的质量浓度优选为0.5～3％，更优选为1％。所述pbs缓冲液的浓度优选为0.005～0.015mol/l，更优选为0.01mol/l。重悬后的胶体金探针溶液的浓度优选为8.5～9.9nmol/l，更优选为9nmol/l。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括洗液。在本发明中，所述洗液优选为含有体积浓度为0.1～1％的吐温-20的pbs缓冲液，更优选为0.5％吐温-20的pbs缓冲液。所述pbs缓冲液的浓度优选为0.005～0.015mol/l，更优选为0.01mol/l。本发明在间接竞争免疫反应结束后，用所述洗液对酶标板进行清洗。特异性结合到微孔板底部的三种探针被保留，其余成分被去除。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括二硫酸糖醇溶液。在本发明中，所述二硫苏糖醇溶液的摩尔浓度优选为5～30mmol/l，更优选为20mmol/l。本发明利用二硫苏糖醇破坏金硫键，将生物条形码从金颗粒表面解离下来，进而使由于荧光共振能量转移而猝灭的荧光得到恢复。
本发明提供的免疫分析试剂盒优选还包括农药标准品。市售固态标准品和液态标准品均可，使用时用色谱级以上的甲醇溶解，并根据标准曲线的范围进行稀释。
本发明还提供了上述试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。本发明利用上述试剂盒检测有机磷农药多残留，检测过程优选包括如下步骤：
(1)向包被有抗原的黑色酶标板中加入待测样品和胶体金探针溶液，37℃孵育0.5～2h，用洗液洗板；
(2)向所述步骤(1)洗板后的酶标板孔中加入二硫苏糖醇溶液，37℃振荡反应1～3h，检测不同颜色荧光基团的荧光信号，分别测定荧光值；
(3)将测定的荧光值分别代入相应荧光信号的标准曲线形成的标准方程式中，计算得到不同类型有机磷农药残留的量。
本发明利用待测农药与包被抗原竞争结合相应胶体金探针上的抗体。通过洗板，特异性结合到微孔板底部的三种探针被保留，其余成分被去除。本发明利用二硫苏糖醇将荧光标记的生物条形码从金纳米粒子表面解离下来，使由于荧光共振能量转移而猝灭的荧光得到恢复。通过检测不同颜色荧光基团的荧光信号，分别测定荧光值，样品中待测农药浓度越大，测得的荧光值越低。本发明将测定的荧光值分别代入相应荧光信号的标准曲线，计算得到不同类型有机磷农药残留的量。
下面结合实施例对本发明提供的有机磷农药多残留免疫分析试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)胶体金的合成
将100ml1mmol/l的haucl4水溶液加入圆底烧瓶中，连接冷凝管并开始回流。在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入10ml新制备的38.8mmol/l的柠檬酸三钠溶液，随着搅拌和加热的进行，溶液的颜色由黄色先变黑后逐渐变为深红色，反应15min后，在室温条件下自然冷却至室温，4℃储存备用。
(2)胶体金探针的制备
①生物条形码的活化：分别将由巯基和6-fam、cy3、texasred标记的生物条形码按照说明书在12000rpm下离心1min，用te缓冲液溶解后，加入tcep(20mmol/l)溶液，使tcep与dna的比例为200：1，室温下震荡2-3h.。
②抗体的标记：胶体金溶液过0.22μm孔径的滤膜后，分别取1ml的胶体金溶液，用30μl0.1mol/l的k2co3调节ph值至9.0左右。将三唑磷、对硫磷、毒死蜱单克隆抗体加入到调节好ph值的胶体金溶液中，使其浓度分别为18.1mg/l，30.28mg/l，50.48mg/l，充分吹打混匀，室温孵育1h。
③生物条形码的标记：将活化的三种生物条形码分别加入到对应的上述混合液中，充分混匀。加入30％的peg20000至终浓度为1％，充分混匀后一次性加入0.1mol/l的pbs至终浓度为0.01mol/l。静置1h。
④封闭与离心：加入10％的bsa至终浓度为1％，继续静置40min以上，13000rpm离心15min，弃去上清液，得到的红色沉淀加200μl探针重悬液，用移液器轻轻吹打，使沉淀重悬浮混匀，4℃保存备用。
(3)农药多残留检测步骤
①包板与封闭：在黑色酶标板中，每孔加入100μl浓度分别为0.16、0.63、0.87mg/l的三唑磷、对硫磷、毒死蜱完全抗原(ova偶联)的混合半抗原，4℃包被过夜，洗板后用300μl封闭液37℃封闭1h，洗板。
②间接竞争免疫反应：先后加入50μl三种农药混合标准溶液或者待测样品、50μl分别稀释20倍的三种胶体金探针混合液，在微量震荡仪上轻微震荡1min混合后，37℃孵育1h。在此过程中，三种农药标准品或样品中的待测农药分别与包被抗原竞争结合相应胶体金探针上的抗体。通过洗板，特异性结合到微孔板底部的三种探针被保留，其余成分被去除。
③荧光恢复：每孔加入100μl20mmol/l的dtt，37℃震荡反应90min，dtt通过配体交换将胶体金表面的三种荧光标记的ssdna解离下来，使由于荧光共振能量转移而猝灭的荧光得到恢复。
④信号检测：在激发发射波长分别为489nm/521nm、532nm/568nm、592nm/622nm条件下测定荧光值(infinitem200pro，tecan，多功能酶标仪)。标准溶液或者样品中待测农药浓度越大，测得的荧光值越低。
对比例1
(1)根据目标物的个数，将酶标板分成多个区域。
(2)分别在每个区域中包被一种目标物的完全抗原，并洗板。
(3)分别在每个区内的孔内加入相应的hrp酶标抗体和该目标物的标准溶液或待测样品，进行竞争反应，反应结束后洗板。
(4)在所有区域同时加入tmb显色液反应一定时间后，加入终止液，测定od450值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。