一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法及其二次分散工艺和在细胞标记中的应用与流程

本发明属于纳米金刚石加工技术领域，具体涉及一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法及其二次分散工艺和在作为荧光探针在细胞标记中的应用。

背景技术：

纳米金刚石由于具有独特的半导体特性和良好的生物相容性，被广泛应用于生物传感器的基体材料。其独特的化学组成和电学性能使得纳米金刚石相比于其他传统的物质，如金、硅、玻璃等更有利于生物电子学和生物传感器的发展，大多数生物医学应用需要高效可靠的金刚石表面功能化，由于生物分子一般由氨基酸序列组成，许多研究工作者注意到氨基功能化的纳米金刚石应用于生物传感器具有十分理想的前景。

现有技术中已有纳米金刚石功能化的相关研究成果报道，例如，专利申请公布号为cn103173267a的专利公开了“一种末端基团为氨基的纳米金刚石衍生物及其制备方法和用途”，该发明采用经纯化、混酸氧化处理后的纳米金刚石，先与氯化亚砜反应，然后分别与二元胺化合物、三氯均三嗪进行亲核取代反应；再与二元胺化合物、三氯均三嗪进行迭代反应制得，但是该方法具体制备工艺繁琐，反应条件苛刻，且该方法中涉及的亲核取代反应需要在惰性气体保护条件下进行，生产成本高，且制得的产物中还含有杂质。另外，m.khan，n.shahzad等也公开了采用不同的研磨介质(如nh4hco3，nacl或蔗糖)对爆轰纳米金刚石(dnds)进行球磨，研究了不同研磨介质在不同溶剂(乙醇，水或二甲基亚砜)中对纳米金刚石分散行为的影响(m.khan，n.shahzad，etal.dispersionbehaviorandtheinfluencesofballmillingtechniqueonfunctionalizationofdetonatednano-diamonds[j].diamond&relatedmaterials61(2016)32–40.)，但是该研究制得的胺化纳米金刚石仍然存在杂质引入的问题，另外，虽然该研究中研磨介质辅助的胺化纳米金刚石在环氧树脂中具有较好的分散性，但仍不能得到单分散的纳米金刚石胶体。

基于现有技术存在的上述技术问题，特提出本申请。

技术实现要素：

本发明的目的是基于目前纳米金刚石表面直接胺化过程中还存在的杂质引入且不能得到单分散纳米金刚石胶体的技术问题，提出一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法及其二次分散工艺和在细胞标记中的应用，本发明方法能够使纳米金刚石表面简单胺化改性，且得到的单分散胶体溶液能再次分散。

为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

选择合适粒径的纯化纳米金刚石粉体，在室温条件下将所述纯化纳米金刚石粉体、氯化铵(胺化试剂)和氯化钠(研磨助剂)分别置于球磨机中进行干法球磨，球磨后的混合物经去离子水洗涤、超声分散、离心、即可制得本发明所述的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液。

本发明上述所述技术方案中的纯化纳米金刚石粉体可以是市售产品，也可以是爆轰合成的纯化后的纳米金刚石。在一个优选的实施方案中，所述纯化纳米金刚石粉体的纯度>90％，优选纯度>95％；所述纯化纳米金刚石粉体的粒度为30nm～100μm。

在一个优选的实施方案中，所述纯化纳米金刚石和去离子水的质量比为1:(20～2000)，所述氯化铵和氯化钠的质量比为1:(2～100)。

在一个优选的实施方案中，所述纯化纳米金刚石粉体和所述氯化铵的质量比为1:(0.1～100)。

在一个优选的实施方案中，上述技术方案在球磨过程中加入了球磨珠，所述球磨珠为非金属球磨珠，所述球磨珠包括但不限于玛瑙，刚玉，氧化锆，二氧化硅，优选采用玛瑙珠。

进一步优选地，所述球磨珠的直径大于1mm，优选大于4mm，球磨珠可以是单一直径的球磨珠，也可以是由直径大小不同的混合球磨珠组成，混合球磨珠珠子直径比优选为1.5～200，更优选为2～10。

在一个优选的实施方案中，所述球磨在室温下进行的，采用的是一种高效的行星式球磨机，所述球磨机线转速为20～600r/min，线速度为20～600m/min，所述球磨时间为0.1～20h。

在一个优选的实施方案中，所述球磨机转速为512r/min，在优化过程中发现，氯化铵的用量对最终产物的氨基含量也有着显著的影响，氯化铵质量越小或越大，所获得的纳米金刚石表面氨基含量越少。

在一个优选的实施方案中，所述胺化试剂比(纳米金刚石与氯化铵质量比)比为1：0，1：5，1：10，1：15，1：20，胺化试剂比越小，使体系中胺化试剂氯化铵分解氨基浓度小，胺化改性不充分，胺化试剂比越大，分解出的氨基浓度大，使得胺化反应平衡提前，氨基浓度降低。

本发明方法上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液能再次分散，为了实现本发明的上述第二个目的，本发明采用的二次分散工艺具体步骤如下：

(i)将上述方法制得的胺化纳米金刚石黑色胶体溶液干燥，得到胺化纳米金刚石粉体；

(ii)将步骤(i)制得的胺化纳米金刚石粉体在超声或剪切作用下再次分散在溶剂中，振荡，得到澄清透明的黑色胶体溶液。

在一个优选的实施方案中，步骤(i)中所述干燥处理可以采用旋转蒸发仪干燥、喷雾干燥或冷冻干燥中的任一种方式。

在一个优选的实施方案中，步骤(i)中旋转蒸发仪干燥温度不高于80℃，可以是60℃，65℃，70℃，80℃，一般不超过80℃。

在一个优选的实施方案中，步骤(ii)中所述的溶剂为水、二甲基亚砜(dmso)、乙醇、乙二醇或二甲基甲酰胺(dmf)中的任一种或多种或含有上述溶剂体积比超过20％的其它复合溶剂。

在一个优选的实施方案中，步骤(ii)中所述的超声可利用100～1000w超声清洗机，所述剪切分散(>500rpm)处理时间为15min。

本发明的第三个目的在于提供上述所述的胺化纳米金刚石的应用，本发明的胺化纳米金刚石可作为荧光探针对细胞进行标记。

在一个优选的实施方案中，胺化纳米金刚石作为荧光探针对细胞进行标记的浓度为0.5～2mg/ml。

与现有技术相比，本发明涉及的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法及其二次分散工艺和在细胞标记中的应用具有如下有益效果：

(1)本发明制备方法简单、易操作，无需特殊的反应设备，整个反应过程无需在惰性气体氛围下进行，且采用的试剂廉价易得，生产成本低，容易实现工业化生产；

(2)本发明使用球磨法制得的胺化纳米金刚石产率高，高于90％，最高可达97％，且制得的胺化纳米金刚石胶体具有单分散性；

(3)本发明获得的胺化纳米金刚石粉体能实现二次分散，使分散好的纳米金刚石在运输上更加方便，进一步拓宽了纳米金刚石的应用领域；

(4)本发明在实验过程中未对环境产生不良影响，本发明产生的酸废液处理比较简单，可进一步浓缩或回收再利用。

附图说明

图1中(a)、(b)、(c)分别为本发明实施例3中纳米金刚石原料、纯化后的纳米金刚石、胺化改性后的纳米金刚石的xrd对比谱图；

图2为本发明实施例3中胺化前后纳米金刚石样品的ftir对比谱图，其中：(a)纯化后纳米金刚石的ftir谱图；(b)胺化改性后纳米金刚石的ftir谱图；

图3为本发明实施例1～5中不同胺化试剂比条件下制得的纳米金刚石后胶体溶液的实物数码照片；

图4为本发明实施例1～5中不同胺化试剂比条件下制得的胺化纳米金刚石胶体溶液的粒径分布对比图；

图5为本发明实施例1～5中不同胺化试剂比条件下制得的纳米金刚石胶体溶液zeta电位-ph关系曲线对比图；

图6为本发明实施例3中制得的胺化纳米金刚石在不同溶剂中进行二次分散获得的胶体溶液的实物数码照片；

图7为本发明实施例3中制得的胺化纳米金刚石在不同溶剂中进行二次分散获得的胶体溶液的粒径分布对比图。

图8为本发明实施例3中制得的胺化纳米金刚石的透射电镜照片；

图9为实施例6中胺化纳米金刚石混合液培养5种不同cell在30min的实时拍摄图，其中：a)hepg2细胞，b)hela细胞，c)l02细胞，d)h3b细胞，e)nih3t3细胞。左侧明场图片，右侧荧光场图片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为了提高胺化纳米金刚石产率，下述各实施例中的纳米金刚石均采用下述工艺进行纯化处理，步骤如下：

将10g纳米金刚石灰色粉体与30g～50g浓硫酸、10g高锰酸钾在反应釜中反应，控制所述反应釜中的反应温度为220℃，反应时间为8h，使纳米金刚石灰色粉体浓硫酸介质中经高锰酸钾高温下氧化纯化处理，然后用去离子水将产物超声清洗至中性，离心、干燥，获得纯化纳米金刚石粉体；所述纳米金刚石灰色粉体为市售产品，纳米金刚石灰色粉体中金刚石含量大于90％；所述浓硫酸的质量分数为98％。

实施例1

本实施例的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取球磨珠(玛瑙珠大珠直径6.8mm与小珠直径4.2mm质量比1：5)放入体积为100ml大小的球磨罐中，加入0.5g上述纯化处理的纳米金刚石和2.5g氯化钠，不加氯化铵，设置球磨机(型号：qm-1sp2，南京大学仪器厂)线速度为512m/min，球磨时间为2h，关闭球磨机，隔30min后取下球磨罐。

(2)取出球磨罐中的球磨珠，用去离子水洗涤(250～300ml，可适当加大水的体积)，在超声的作用下(8000w超声一般不超过1min，360w超声一般15min)分散，在10000r/min的离心速度下离心，时间设置5min，重复超作4～5次，获得澄清透明的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液，并对其进行动态光散射(dls)表征，如图4所示。

本实施例上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的二次分散工艺具体步骤如下：

(1)将本实施例上述获得的澄清透明的纳米金刚石黑色胶体溶液用旋转蒸发仪(型号：n-1001，上海爱朗仪器有限公司)除去水溶剂，设置水浴锅(型号：sb-2000，上海爱朗仪器有限公司)温度为80℃，得到胺化纳米金刚石粉体。

(2)将得到的胺化纳米金刚石粉体溶在超声作用下溶解在dmf中，超声15min，得到浓度较大的纳米金刚石澄清透明的黑色胶体溶液，对其进行动态光散射表征，如图7所示。本实施例制得的胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径大小中值在50nm左右，二次分散获得的胶体溶液中胺化纳米金刚石平均粒径在60nm左右。

实施例2

本实施例的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取球磨珠(玛瑙珠大珠直径6.8mm与小珠直径4.2mm质量比1：5)放入体积为100ml大小的球磨罐中，加入0.5g上述纯化处理的纳米金刚石和2.5g氯化铵，2.5g氯化钠，设置球磨机(型号：qm-1sp2，南京大学仪器厂)线速度为512m/min，球磨时间为2h，关闭球磨机，隔30min后取下球磨罐。

(2)取出球磨罐中的球磨珠，用去离子水洗涤(250～300ml，可适当加大水的体积)，在超声的作用下(8000w超声一般不超过1min，360w超声一般15min)分散，在10000r/min的离心速度下离心，时间设置5min，重复超作4～5次，获得澄清透明的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液，并对其进行动态光散射(dls)表征，如图4所示。将其进行透射电镜分析，其形貌如图8所示。

本实施例上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的二次分散工艺具体步骤如下：

(1)将本实施例上述获得的澄清透明的纳米金刚石黑色胶体溶液用旋转蒸发仪(型号：n-1001，上海爱朗仪器有限公司)除去水溶剂，设置水浴锅(型号：sb-2000，上海爱朗仪器有限公司)温度为80℃，得到胺化纳米金刚石粉体。称其重量，按公式计算得出胺化改性后的纳米金刚石收率：

yield＝m1/m0×100％

式中：mo-纳米金刚石原料质量，单位g；

m1-胺化纳米金刚石干燥后的质量，单位g；

胺化改性后分散的纳米金刚石为0.473g，收率为94.6％。

(2)将得到的胺化纳米金刚石粉体在超声作用下溶解在水中，超声15min，得到浓度较大的纳米金刚石澄清透明的黑色胶体溶液，对其进行动态光散射表征，如图7所示，由图7可以看出，本实施例制得的胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径大小中值在50nm左右，二次分散所得胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径在50nm左右。

实施例3

本实施例的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取球磨珠(玛瑙珠大珠直径6.8mm与小珠直径4.2mm质量比1：5)放入体积为100ml大小的球磨罐中，加入0.5g上述纯化处理的纳米金刚石和5g氯化铵，2.5g氯化钠，设置球磨机(型号：qm-1sp2，南京大学仪器厂)转速为512r/min，球磨时间为2h，关闭球磨机，隔30min后取下球磨罐。

(2)取出球磨罐中的球磨珠，用去离子水洗涤(250～300ml，可适当加大水的体积)，在超声的作用下(8000w超声一般不超过1min，360w超声一般15min)分散，在10000r/min的离心速度下离心，时间设置5min，重复超作4～5次，获得了澄清透明的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液，并对其进行动态光散射(dls)表征，如图4所示。

本实施例上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的二次分散工艺具体步骤如下：

(1)将本实施例上述获得的澄清透明的纳米金刚石黑色胶体溶液用旋转蒸发仪(型号：n-1001，上海爱朗仪器有限公司)除去水溶剂，设置水浴锅(型号：sb-2000，上海爱朗仪器有限公司)温度为80℃，得到胺化纳米金刚石粉体。

(2)将得到的胺化纳米金刚石粉体溶在超声作用下溶解在dmso中，超声15min，得到浓度较大的纳米金刚石澄清透明的黑色胶体溶液。

将本实施例得到的胺化纳米金刚石粉体进行xrd测试，测试结果如图1所示，由图1可知，本实施例得到的胺化纳米金刚石粉体与纳米金刚石原料、纯化后的纳米金刚石的xrd衍射峰基本一致，证明胺化改性后的纳米金刚石结构基本未发生变化。

将本实施例得到的二次分散后的胶体溶液进行动态光散射表征，测试结果如图7所示。本实施例制得的胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径大小中值在50nm左右，二次分散获得的胶体溶液中胺化纳米金刚石平均粒径在60nm左右。

实施例4

本实施例的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取球磨珠(玛瑙珠大珠直径6.8mm与小珠直径4.2mm质量比1：5)放入体积为100ml大小的球磨罐中，加入0.5g上述纯化处理的纳米金刚石和7.5g氯化铵，2.5g氯化钠，设置球磨机(型号：qm-1sp2，南京大学仪器厂)线速度为512m/min，球磨时间为2h，关闭球磨机，隔30min后取下球磨罐。

(2)取出球磨罐中的球磨珠，用去离子水洗涤(250～300ml，可适当加大水的体积)，在超声的作用下(8000w超声一般不超过1min，360w超声一般15min)分散，在10000r/min的离心速度下离心，时间设置5min，重复超作4～5次，获得澄清透明的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液，并对其进行动态光散射(dls)表征，表征结果如图4所示。

本实施例上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的二次分散工艺具体步骤如下：

(1)将本实施例上述获得的澄清透明的纳米金刚石黑色胶体溶液用旋转蒸发仪(型号：n-1001，上海爱朗仪器有限公司)除去水溶剂，设置水浴锅(型号：sb-2000，上海爱朗仪器有限公司)温度为80℃，得到胺化纳米金刚石粉体。

(2)将得到的胺化纳米金刚石粉体溶在超声作用下溶解在乙醇中，超声15min，得到浓度较大的纳米金刚石澄清透明的黑色胶体溶液，对其进行动态光散射表征，表征结果如图7所示。本实施例制得的胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径大小中值在50nm左右，二次分散所得胶体溶液中胺化纳米金刚石的平均粒径在60nm左右。

实施例5

本实施例的一种单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取球磨珠(玛瑙珠大珠直径6.8mm与小珠直径4.2mm质量比1：5)放入体积为100ml大小的球磨罐中，加入0.5g上述纯化处理的纳米金刚石和10.0g氯化铵，2.5g氯化钠，设置球磨机(型号：qm-1sp2，南京大学仪器厂)线速度为512m/min，球磨时间为2h，关闭球磨机，隔30min后取下球磨罐。

(2)取出球磨罐中的球磨珠，用去离子水洗涤(250～300ml，可适当加大水的体积)，在超声的作用下(8000w超声一般不超过1min，360w超声一般15min)分散，在10000r/min的离心速度下离心，时间设置5min，重复超作4～5次，获得澄清透明的单分散胺化纳米金刚石黑色胶体溶液，并对其进行动态光散射(dls)表征，表征结果如图4所示。

本实施例上述制得的单分散胺化纳米金刚石胶体溶液的二次分散工艺具体步骤如下：

(1)将本实施例上述获得的澄清透明的纳米金刚石黑色胶体溶液用旋转蒸发仪(型号：n-1001，上海爱朗仪器有限公司)除去水溶剂，设置水浴锅(型号：sb-2000，上海爱朗仪器有限公司)温度为80℃，得到胺化纳米金刚石粉体。

(2)将得到的胺化纳米金刚石粉体溶在超声作用下溶解在乙醇中，超声15min，得到浓度较大的纳米金刚石澄清透明的黑色胶体溶液。

将上述纳米金刚石灰色粉体、纯化后的纳米金刚石分别进行xrd测试，测试结果如图1所示。由图1中(a)曲线可知，未经纯化的纳米金刚石原料中在20～30°左右出现的衍射峰是石墨(100)和无定形碳等杂质的峰且噪声较高，说明未经纯化的纳米金刚石晶型有缺陷，不完美且存在一定含量的非金刚石碳；经高锰酸钾氧化纯化处理后，图(b)曲线中20～30°中间的无定型碳和石墨衍射峰消失，说明高锰酸钾能有效去除纳米金刚石晶体中的无定型碳和石墨等杂质，氧化处理得到了纯度较高、晶型完美的纳米金刚石粉体。另外，由于高锰酸钾氧化性较强，纳米金刚石被刻蚀，使得其(111)和(220)晶型碳含量降低，图(c)是实施例1中经球磨胺化改性后纳米金刚石的xrd谱图，由图(c)可知，胺化改性后纳米金刚石(111)晶面和(220)晶面完整且与纯化后纳米金刚石强度变化不大，说明球磨胺化改性过程中对纳米金刚石晶型无太大影响，胺化过程保持了纳米金刚石晶型的完整性。

图2为本发明实施例1中胺化前后纳米金刚石样品的ftir对比谱图，其中：(a)纯化后纳米金刚石的ftir谱图；(b)胺化改性后纳米金刚石的ftir谱图；

通过ftir光谱图可知，纯化后的纳米金刚石表面带有羧基基团，图中3432cm^-1附近出现的宽的吸收峰为-oh的伸缩振动吸收峰，1629cm^-1附近出现的吸收峰为-oh的弯曲振动吸收峰，1791cm^-1附近出现的为-cooh的伸缩振动吸收峰，说明氧化后的纳米金刚石表面带有羧基和羟基，在1259cm^-1附近出现的为c-o-c的反对称伸缩振动峰。通过胺化改性后的红外光谱图可知，在3413cm^-1附近出现的宽的吸收峰为-nh的伸缩振动峰，在1401cm^-1处出现的新的吸收峰为-c-n的伸缩振动峰，此特征峰说明了经球磨改性处理后的纳米金刚石表面键接了氨基基团。对比改性前后红外光谱图可以知道，胺化改性后纳米金刚石的羰基伸缩振动峰由1791cm^-1红移至1779cm^-1附近，同时也表明了球磨胺化改性纳米金刚石可以有效地功能化纳米金刚石，说明胺化改性纳米金刚石成功。

表1红外谱图分析表

图3为上述实施例1～5中不同胺化试剂比条件下制得的纳米金刚石后胶体溶液的实物数码照片。图4中曲线a～e分别为本发明实施例1～5中不同胺化试剂比(纳米金刚石与胺化试剂氯化铵的质量比)条件下制得的胺化纳米金刚石胶体溶液的粒径分布对比图；由图3和4可以看出，当不加入胺化试剂比即胺化试剂与纳米金刚石质量比为1:0时，纳米金刚石分散效果不好，水溶液中呈乳浊液，且平均粒径为516nm，当加入胺化改性粒子后，纳米金刚石分散较好，当胺化试剂的量从1:5增加到1:10时，纳米金刚石最小粒径达43.4nm。同时，纳米金刚石表面胺化后使得纳米金刚石表面带有更多的亲水性基团，纳米金刚石在水中分散性能更好，氨基在纳米金刚石表面固定后，能增强体系稳定性。所以，胺化改性后的纳米金刚石能长期稳定的保存。

图5为本发明实施例1～5中不同胺化试剂比条件下制得的纳米金刚石胶体溶液zeta电位-ph关系曲线对比图。由图5可以看出，当胺化试剂比比设置为1:10时，电位降低最明显。在ph＝3左右，出现等电点。不同ph对应下的电位值最小，当ph＝10时，此时zeta电位有最小值为-49.9mv。当胺化试剂比从1:0增加至1:10时，各ph值对应下电位值降低，当胺化试剂比增加到1:20时，各ph值对应电位值增加。说明胺化改性后纳米金刚石表面带有更多的亲水性基团，颗粒间静电斥力增强，达到分散效果。

图6为本发明实施例1中制得的胺化纳米金刚石在不同溶剂中进行二次分散获得的胶体溶液的实物数码照片。由图6可以看出，经过胺化改性后分散在水相中的纳米金刚石胶体溶液经干燥后得到纳米金刚石颗粒，此颗粒在超声的作用下能再次分散在水、dmso、乙醇、dmf等溶剂中形成胶体。通过dls测试，其平均粒径变化不大，且能长久稳定的保存。在药物载体、热界面材料、光电材料、润滑材料中具有很广的应用价值。实验即：研磨时间2h，研磨介质比1:5，研磨物料比1:10，研磨助剂比(nacl)1:5的样品进行实验。

图7为本发明实施例3中制得的胺化纳米金刚石在不同溶剂中进行二次分散获得的胶体溶液的粒径分布对比图；图8为本发明实施例3中制得的胺化纳米金刚石的透射电镜照片。由图7可以看出，经胺化改性后的纳米金刚石二次分散在水、乙醇、dmso、dmf中再次分散且呈胶体状态，通过dls分析可知，其再次分散在水中的平均粒径为48.9nm，乙醇中为53.6nm，dmso中为58.4nm，dmf中为68.7nm。其粒径均在100nm以下，说明胺化改性或的纳米金刚石、再次分散较好。

实施例6实施例1制得的胺化纳米金刚石作为荧光探针在细胞标记中的应用。

1、细胞的培养与标记

(1)先接种好需要的五种细胞，每种细胞都接种一个六孔细胞培养板，每孔中细胞密度：5×10⁵±0.05×10⁵个，在37℃、5％co2培养箱中培养24h后待用，实验所需不同的三个染色时间，每个时间平行两组实验；

(2)配置好待用的胺化纳米金刚石和培养基混合染色液，其中：胺化纳米金刚石浓度为1mg/ml；

(3)取一种事先培养好的六孔细胞培养板，先用移液枪吸出培养基，再往六孔细胞培养板的每个孔中都添加3ml混合液到细胞中染色，继续于培养箱中培养。

2、细胞标记图片的采集

(1)在加入胺化纳米金刚石混合液后的5min、15min、30min，分别吸出混合液备用；

(2)吸出混合液以后，用pbs冲洗细胞三次，往六孔细胞培养板的每个孔中都添加1ml新鲜培养基；

(3)在显微镜下观察，取细胞形态较好的视野分别采集同一视野下明场和荧光场的图片。

3、胺化纳米金刚石进入活细胞内的实时拍摄图如图9中(a)～(e)所示。从胺化纳米金刚石染色30min的实时拍摄图片和之前细胞外的荧光强度对比可以看出，胺化纳米金刚石颗粒在进入细胞以前荧光强度比较弱，但在实时拍摄图片中发现荧光强度有所增强。可能是当胺化纳米金刚石进入细胞后密度增大，在细胞范围内达到了聚集的效果，在细胞内震动受到了限制，辐射衰减比例增加，荧光强度增强，能够作为荧光探针对细胞进行标记。

虽然胺化纳米金刚石本身就具有一定的荧光强度，但会发现荧光强度并不明显，当进入到细胞内时，由于胺化纳米金刚石颗粒表面含有许多的氨基官能团，随着细胞对颗粒的吸收，细胞内颗粒之间的距离会逐渐减小，会形成许多氢键。胺化纳米金刚石的结构较为稳定，不容易像一般的有机分子一样进行分子内运动和旋转释放能量使分子回归稳态，而是可能以微弱的震动方式释放能量，但由于氢键的形成抑制了以震动方式释放出较高的能量使之回归稳态，这时会增加了以光能的形式释放能量，荧光强度会有所增加。