一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法与流程

本发明涉及药品领域，具体涉及一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法。

背景技术：

β-内酰胺酶检测从方法学上可以分为以下两种：1)通过测定未分解的酶促反应底物(青霉素)的含量来间接推算体系中β-内酰胺酶的浓度。该方法以生物测定法(杯碟法)及配体-受体检测法为代表，其特点是原理明确、特异性强。2)通过测定底物青霉素分解产物的方法，青霉素经过β-内酰胺酶的分解之后生成稳定的中间产物-青霉噻唑酸，通过测定体系中青霉噻唑酸的含量将能够计算出β-内酰胺酶的含量。该方法以碘量法、产色头孢菌素法为代表。上述方法的不足在于或者耗时长或者偏差大或者属于半定量性质，无法满足“快速、准确”的检验要求。此外，沈祝飞等开发的“一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法”，也是一种半定量检测方法，而且该方法不能适用于表面凸起的接触皿。

因β-内酰胺类抗生素的大量及广泛使用，对各种β-内酰胺类抗生素的耐药菌不断增多，且耐药性不断增强，而产生β-内酰胺酶是出现耐药性的最主要原因，主要是由于它将β-内酰胺类抗生素分子中的β-内酰胺环水解，形成青霉噻唑酸，使β-内酰胺类抗生素失效。

目前中国药典中只有对液体β-内酰胺酶活性检测方法的规定(碘量法)，对凝胶培养基所含β-内酰胺酶的有效酶活力定量测定没有相应的方法和标准，国内外专利和文献尚无有关报道，现在市场上的加酶平皿均是以加酶量表示而无成品有效酶活标识，因此市场上的许多无菌β-内酰胺酶平皿的质量不合格(酶活力)，致使大量用户的环境监测结果不可信。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法，该方法能快速、准确地定量检测出凝胶培养基所含的有效的β-内酰胺酶酶活力单位。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

1.采用明确效价单位数的青霉素g钠标准品，用ph7.0的磷酸盐缓冲溶液精确配制不同浓度的青霉素g钠标准品溶液(mg/ml)，浓度范围从0～6mg/ml。

2.取各不同浓度的青霉素g钠标准品溶液1ml，加入中性羟胺(ph6.75)1ml、95％乙醇1ml，反应3min，再加入硫酸铁胺溶液2ml，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定od515值即a值。

3.以青霉素g钠浓度或单位数为横坐标，以od515值即a值为纵坐标，绘制标准曲线(图)，得到回归方程y＝ax+b，r²≥0.999。

4.精密称取含酶凝胶培养基(0.01g)，加入ph7.0的磷酸盐缓冲液浆化(酶解)制成澄明溶液，作为样品处理液。必要时于37±1℃保温1小时使样品溶液澄清。

5.将含酶平皿培养基的样品处理液用ph7.0的磷酸盐缓冲溶液按“1、2、3、4、5......倍数稀释”，即得样品稀释液。样品处理液若不稀释，稀释倍数＝1。

6.按样品处理液或样品稀释液的估计酶活力单位数，取适量体积(ml)的样品(稀释)溶液于三角瓶中，按“1∶1.5～5.0”比例加入适量青霉素g钠标准品溶液，定容至20-40ml体积，得样品保温反应混合液，于37±1℃保温计时。

7.按步骤2.方法操作，于保温“0”hr时取1ml样品保温反应混合液，加入各反应溶液，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定od515值即a0样。其余样品保温混合液于37±1℃保温计时1hr，于“1”hr时取1ml样品保温反应混合液，测定od515值即a1样。

8.样品溶液检测时须做阴性对照测定，测定得到a0阴和a1阴。

9.依据测定结果，计算反应液的酶活，最终计算出每克培养基所含酶活力单位数。

10.作为优选，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液(0.05m，ph7.0)；中性羟胺溶液为0.125m，ph6.75(盐酸羟胺与碱性缓冲液混合制得。碱性缓冲液ph12.5，由氢氧化钠4.32g，三水合乙酸钠0.862g水溶后，定容至500m)；硫酸铁胺溶液为0.25m。水解酶用量为20-60u/g；反应体系的体积为20～40ml，保温时间为1hr，保温温度37±1℃。β-内酰胺酶酶与底物反应比为“1∶1.5～5.0”。

11.检出限

20次空白样的检测结果od值：

平均值：

标准偏差：

检测限：cl(或ql)＝k·sb/m＝0.028(mg/ml)，cl＝0.028×1650＝46(u/g)

附图说明

图1是实施例1和实施例2的青霉素g钠标准品溶液显色测定标准曲线及回归方程。

具体实施方式

溶液配制：

(1)0.125mol/l中性羟胺溶液(ph6.75)：取盐酸羟胺8.685g，以水溶解，定容至500ml，得0.25mol/l盐酸羟胺溶液。取氢氧化钠4.32g和三水合乙酸钠0.862，混合溶解后定容至500ml，得碱性缓冲液(ph12.5)。

将中性羟胺溶液和碱性缓冲液进行等体积混合，即得。

(2)0.25mol/l硫酸铁胺溶液：取98％的浓硫酸4.1ml，定容至500ml，得0.15mol/l硫酸溶液。取硫酸铁胺60.25g，以0.15mol/l硫酸溶液悬浮，加热使之溶解，冷却后以0.15mol/l硫酸定容至500ml，即得0.25mol/l硫酸铁胺溶液。

(3)0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.0)：取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加纯化水定容至500ml，过滤，在115℃灭菌30min，即得0.1m磷酸盐缓冲液，备用。

临用时，取适量体积的0.1m磷酸盐缓冲液用灭菌纯化水稀释一倍体积，即得。

(4)配制浓度范围为0～6mg/ml的青霉素g钠标准品溶液。按技术方案的方法进行测定，根据测定结果，绘制标准曲线，得到回归方程y＝ax+b，r²＝0.999。

实施例1(tsac测定)

1、取头孢菌素酶冻干粉一瓶(××生物技术有限公司，头孢菌素酶批号：7041630d)，采用中国药典方法测得酶活力单位为1009.8万单位/g。

2、将酶冻干粉精密称定，用0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.0)定容，使之成30万单位/ml的酶溶液。

3、取一瓶300ml灭菌后冷却至55-56℃的tsa(大豆酪蛋白琼脂)，加入10ml酶溶液，轻轻摇晃混合均匀，按20ml液体/皿倒皿制备15个φ90mm加酶平皿，得到约为20万单位/皿的加酶平皿。10个平皿完整装袋包装，8k辐照灭菌；5个装袋包装，不辐照。

4、酶活测定

测定方法：精确称取待测的加酶tsac(0.01g)15g，加入4倍量磷酸盐缓冲液(必要时加入胶体水解酶30u/g)，浆化制备成澄明溶液，37±1℃保温1hr。

依据本技术方案之方法进行酶活力测定。

测定结果：

实施例2(tsam测定)

1、取金属β-内酰胺酶冻干粉一瓶(杭州××生物技术有限公司，金属β-内酰胺酶批号：6021639d)，采用中国药典方法测得酶活力单位为730.2万单位/g。

2、将酶冻干粉精密称定，用0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.0)定容，使之成30万单位/ml的酶溶液。

3、取一瓶300ml冷却至55-56℃的tsa(大豆酪蛋白琼脂)，加入10ml酶溶液，轻轻摇晃混合均匀，按20ml液体/皿倒皿制备15个φ90mm加酶平皿，得到约为20万单位/皿的加酶平皿。10个加酶平皿完整装袋包装，8k辐照灭菌；5个加酶平皿装袋包装，不辐照。

4、酶活测定

测定方法：精确称取待测的加酶tsam(0.01g)15g，加入4倍量磷酸盐缓冲液(必要时加入胶体水解酶30u/g)，浆化制备成澄明溶液，37±1℃保温1hr。

依据本技术方案进行酶活力测定。

测定结果：