超分辨拉曼光谱成像系统及方法与流程

本发明涉及表面等离子激元拉曼增强(sers)、超分辨光学成像、激光调制等技术领域，特别是涉及一种超分辨拉曼光谱成像系统及方法。

背景技术：

对于微观细胞或细胞器的探索长久以来引起人们的兴趣。近年来脑科学和类脑智能的研究越来越引起世界各国的重视，而要对大脑细胞和复杂的神经回路相互作用进行动态的成像和研究，需要发展最前沿的微观到介观到宏观的先进成像、示踪与标记技术。对此，最新发展的突破衍射光学极限的光场调控和纳米光学成像颠覆性技术，为解决这关键的科学技术提供了强有力的方法。

单分子定位超分辨技术利用了标记细胞的荧光分子自发的闪烁效应，经过定位荧光光源位置、获取多帧图像重构获得超分辨图像。该技术具有激发强度小、宽场分辨能力高、具有多色和3d成像能力等优点，但由于需要多帧重构成像，成像速度较慢。

表面增强拉曼光谱(sres)技术是一种新型的生物标记手段，具有光信号不易漂白、适用标记的生物样本广泛、对于样本损伤小等特点。同时对原本样品散射的拉曼信号有极大的增强，从而使得对于基于sers效应的光谱检测具有极高的灵敏度。sers技术还可以通过拉曼光谱获取细胞和生物组织中的化学成分信息，并且具有无标记成像的天然优势，在生物医学领域得到广泛应用。

2010年willets等人首先将超分辨显微技术与sers技术相结合，研究单分子sers超分辨重构成像，通过二维的高斯拟合分别定位单分子和纳米颗粒的质心，获得单分子和纳米颗粒的空间位置信息，分辨率可达到10nm。随着单分子定位超分辨技术与sers技术的结合，研究者也开始利用超分辨技术来获得亚细胞或组织的sers信号，实现无标记拉曼超分辨成像。但由于sers的闪烁行为通常周期是几十毫秒，一般采集一帧图像需要100ms，结合多帧采集重构的方法，获得一张超分辨图片通常需要几十分钟，若是对于多分子或组织细胞的成像，则需要几个小时，这对研究一些活体细胞组织会有很大的影响。并且照明方式采用等离子激元静态照明来产生静态的热点，对一些单分子实现超分辨拉曼成像十分成功，对于多分子和细胞组织的成像会由于无法利用分子的闪烁行为，从而导致成像结果留白，还有背景sers信号干扰等问题。

技术实现要素：

为了解决上述的以及其他潜在的技术问题，本发明的实施例提供了一种超分辨拉曼光谱成像系统，所述超分辨拉曼光谱成像系统包括：激发光源模块，用于产生激发光源；偏振调制模块，用于调制所述激发光源的偏振方向；振镜扫描模块，用于扫描完成所述激发光源于样品成像区的不同位置聚焦；显微系统模块，用于通过样品成像区聚焦所述激发光源并激发生成拉曼信号，其中，所述样品成像区包括表面增强拉曼光谱基片和位于表面增强拉曼光谱基片上的检测样品；超分辨成像模块，用于根据所述拉曼信号生成检测样品的超分辨图像；拉曼光谱分析模块，用于根据所述拉曼信号生成拉曼光谱并分析检测样品。

于本发明的一实施例中，所述激发光源模块包括：激光器，产生所述激发光源；光纤准直器，通过光纤与激光器相连，对所述激光器输出的激发光源进行准直后输出到所述偏振调制模块。

于本发明的一实施例中，所述偏振调制模块包括：偏振片，接收所述光纤准直器输出的激发光源；偏振控制器，控制所述偏振片中激光偏振的旋转角度和旋转速度。

于本发明的一实施例中，所述振镜扫描模块包括：激光振镜，接收经所述偏振片进行偏振调制后的激发光源，扫描完成所述激发光源于样品成像区的不同位置聚焦；振镜控制器，控制所述激光振镜的扫描角度范围和角度改变速率。

于本发明的一实施例中，对所述偏振片和所述激光振镜的控制的一种方式为：保持所述激光振镜角度不变，不断改变所述偏振片的偏振角度，当所述偏振片振旋转一周后改变所述激光振镜角度，再次旋转所述偏振片一周，重复上述过程直到完成对所述样品成像区域的扫描；对所述偏振片和所述激光振镜的控制的另一种方式为：保持所述偏振片角度不变，控制所述激光振镜完成对样品成像区域的扫描，扫描完成后旋转所述偏振片，再次控制所述激光振镜对样品成像区域的扫描，重复上述过程直到所述偏振片旋转一周后结束。

于本发明的一实施例中，所述超分辨拉曼光谱成像系统还包括：激发光耦合模块，位于所述激光振镜和所述显微系统模块之间，将所述激光振镜输出的激发光源耦合至所述显微系统模块；所述显微系统模块包括：物镜，输入的激发光源经所述物镜聚焦于所述样品成像区，以激发生成拉曼信号；分光模块，用于将所述拉曼信号分成两路，一路进入所述超分辨成像模块，另一路进入所述拉曼光谱分析模块。

于本发明的一实施例中，所述激发光耦合模块包括反射镜、二向色镜、分束镜或转镜中的一个或多个组合。

于本发明的一实施例中，所述超分辨成像模块包括：依次设置的拉曼信号滤波片、带通滤波片、成像透镜和阵列探测器；其中，所述阵列探测器实时记录所述检测样品发光的状态，对所述检测样品同一位置进行多帧采集并利用拉曼信号产生的闪烁效果对图像进行拉曼热点定位重构，生成超分辨图像。

于本发明的一实施例中，所述阵列探测器为ccd阵列探测器、emccd阵列探测器或cmos阵列探测器。

于本发明的一实施例中，所述拉曼光谱分析模块包括：拉曼信号滤波片、光纤耦合器和生成所述拉曼光谱超分辨图像的光谱仪。

于本发明的一实施例中，所述表面增强拉曼光谱基片由具有偏振依赖特性的纳米颗粒二聚体、纳米线和纳米颗粒体系、纳米颗粒阵列-纳米线体系、纳米立方体或者具有纳米立方体核壳结构体系的一种或多种混合体系。

本发明的实施例还提供一种超分辨拉曼光谱成像方法，所述超分辨拉曼光谱成像方法包括：产生激发光源并调制所述激发光源的偏振方向；通过激光振镜将所述激发光源聚焦于样品成像区，并通过样品成像区激发生成拉曼信号；其中，所述样品成像区包括表面增强拉曼光谱基片和位于表面增强拉曼光谱基片上的检测样品；不断调整所述激光激发光源的偏振方向或调整所述激光振镜的扫描方向，控制完成所述样品成像区的不同激发位置生成拉曼信号；分别根据所述拉曼信号生成检测样品的超分辨图像和拉曼光谱超分辨图像。

于本发明的一实施例中，获取所述超分辨图像的一种过程包括：保持所述所述激光振镜角度不变，不断调整所述激光激发光源的偏振方向，分别获取各个偏振方向下样品成像区生成的拉曼信号的热点位置信息图像，并将各个偏振方向下获取的热点位置信息图像进行叠加，形成检测样品的超分辨图像；调节所述激光振镜角度以改变所述激发光源激发拉曼信号在检测样品上的位置，并重复上述过程，获取所述样品成像区上不同位置的多个检测样品的所述超分辨图像。

于本发明的一实施例中，通过拟合定位方法获取热点位置信息图像中的热点位置信息；其中，所述定位方法为高斯分布拟合重构方法、多热点超高斯拟合重构方法或压缩感知数据重构方法。

于本发明的一实施例中，获取所述拉曼光谱超分辨图像的一种过程包括：保持所述激发光源的偏振方向不变，不断调整所述激光振镜的聚焦位置，并在每次调整所述激光振镜的聚焦位置时采集被激发位置的热点位置信息和与该热点位置信息对应的拉曼光谱信息；通过获取的所述热点位置信息和与该热点位置信息对应的拉曼光谱信息构造拉曼光谱成像图；改变所述激发光源的偏振方向，重复上述过程直到激光偏振旋转一周后结束，获取不同偏振方向下多个所述拉曼光谱成像图；将获取的拉曼光谱成像图重构获取所述拉曼光谱超分辨图像。

于本发明的一实施例中，所述拉曼光谱成像图的一种方式为：提取同一波长拉曼峰强度与所述激发光源激发拉曼信号在检测样品上的热点位置信息进行叠加，获取该波长下被激发位置的拉曼光谱成像图；其中，所述拉曼光谱成像图在x、y方向维度上是激发光源激发拉曼信号在检测样品上的位置信息，图像的灰度值为该波长下的拉曼峰的强度信息。

于本发明的一实施例中，获取所述拉曼光谱超分辨图像的一种方式为：将同一波长、所有偏振方向下的所述拉曼光谱成像图重构获取所述拉曼光谱超分辨图像；获取所述拉曼光谱超分辨图像在x、y方向维度上是拉曼信号的位置信息，图像的灰度表示不同偏振、某一波长条件下拉曼峰的强度积分。

于本发明的一实施例中，通过液晶偏振旋转器或1/2波片偏振旋转器调制所述激发光源的偏振方向。

如上所述，本发明的超分辨拉曼光谱成像系统及方法具有以下有益效果：

本发明基于偏振调制和拉曼热点定位超分辨技术通过主动调制激发光偏振来调节sers的闪烁特性，控制sers闪烁速率并与高效快速的重构技术相结合，不仅在能够扩展超分辨成像样品的使用范围，还能够高效获取用于生物样本和化学样本的无标记超分辨成像和拉曼光谱的超分辨成像，极大程度上增加样品拉曼光谱的信息量，有效解决现有技术中拉曼超分辨成像中适用范围小、成像时间长、sers闪烁行为不可控等问题，有效提高对于样品成分的解析能力，为研究偏振对于样品拉曼光谱的影响起重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示为本发明的超分辨拉曼光谱成像系统的原理框图。

图2显示为本发明的超分辨拉曼光谱成像系统的具体原理结构示意图。

图3显示为本发明的超分辨拉曼光谱成像系统中偏振调制表面增强拉曼光谱超分辨成像过程示意图。

图4显示为本发明的超分辨拉曼光谱成像系统中拉曼光谱超分辨成像过程示意图。

图5显示为本发明的超分辨拉曼光谱成像方法的整体流程示意图。

元件标号说明

100超分辨拉曼光谱成像系统

110激发光源模块

111拉曼激发激光器

112光纤准直器

120偏振调制模块

121偏振片

122偏振控制器

130振镜扫描模块

131激光振镜

132振镜控制器

140显微系统模块

141表面增强拉曼光谱基片

142检测样品

143物镜

144分光模块

150超分辨成像模块

151拉曼信号滤波片

152带通滤波片

153成像透镜

154阵列探测器

160拉曼光谱分析模块

161光谱仪

162拉曼信号滤波片

163光纤耦合器

170激发光耦合模块

171反射镜

172二向色镜

173分束镜

s110～s140步骤

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

请参阅图1至图5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

针对单分子定位技术用于拉曼超分辨成像中适用范围小、成像时间长、sers闪烁行为不可控等问题，本实施例的目的在于提供一种超分辨拉曼光谱成像系统100及方法，用于生物样本和化学样本的无标记超分辨成像和拉曼光谱的超分辨成像，有效解决现有技术中拉曼超分辨成像中适用范围小、成像时间长、sers闪烁行为不可控等问题。

本实施例为一种基于偏振调制的表面等离子激元拉曼增强超分辨拉曼光谱成像系统100和方法，是利用表面等离子激元拉曼增强效应的一种无标记的超分辨成像系统和基于该系统的拉曼光谱成像方法。本实施例的超分辨拉曼光谱成像系统100包括激发光源模块110、偏振调制模块120、振镜扫描模块130、显微系统模块140、超分辨成像模块150和拉曼光谱分析模块160。基于该本实施例的超分辨拉曼光谱成像系统100的成像方法是通过调制激发光的偏振，使具有随机激发偏振依赖的表面拉曼增强热点，使样品拉曼信号产生偏振依赖的闪烁效应，利用采集的闪烁拉曼信号进行随机光学重构超分辨成像和拉曼光谱超分辨成像。

以下将详细阐述本实施例的超分辨拉曼光谱成像系统100及方法的原理及实施方式，使本领域技术人员不需要创造性劳动即可理解本实施例的超分辨拉曼光谱成像系统100及方法。

本发明的实施例提供了一种超分辨拉曼光谱成像系统100，所述超分辨拉曼光谱成像系统100包括：激发光源模块110，偏振调制模块120，振镜扫描模块130，显微系统模块140，激发光耦合模块170，超分辨成像模块150以及拉曼光谱分析模块160。

以下对本实施例的超分辨拉曼光谱成像系统100进行具体详细说明。

于本实施例中，所述激发光源模块110用于产生激发光源。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述激发光源模块110包括：拉曼激发激光器111，产生所述激发光源；光纤准直器112，通过光纤与所述拉曼激发激光器111相连，对所述拉曼激发激光器111输出的激发光源进行准直后输出到所述偏振调制模块120。

拉曼激发激光器111输出的激光波长包含但并不局限于常用拉曼激发波长：405nm，488nm，532nm，632nm，785nm等，光纤输出口径满足共焦扫描显微成像要求，使系统具有共焦显微成像能力，拉曼激发激光器111通过光纤输出激光，经过光纤准直器112准直后进入偏振调制模块120。

于本实施例中，所述偏振调制模块120即偏振器，用于调制所述激发光源的偏振方向。

具体地，所述偏振调制模块120使入射的线偏振激光产生零到2π的偏振旋转。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述偏振调制模块120包括：偏振片121，接收所述光纤准直器112输出的激发光源；偏振控制器122，控制所述偏振片121中激光偏振的旋转角度和旋转速度。

激光偏振的旋转角度和旋转速度受偏振控制器122和偏振控制器122内特定的时序控制程序的控制。其中，提供偏振的装置包含但不局限于液晶偏振旋转器和1/2波片偏振旋转器。

于本实施例中，所述振镜扫描模块130用于扫描完成所述激发光源于样品成像区的不同位置聚焦。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述振镜扫描模块130包括：激光振镜131，接收经所述偏振片121进行偏振调制后的激发光源，扫描完成所述激发光源于样品成像区的不同位置聚焦；振镜控制器132，控制所述激光振镜131的扫描角度范围和角度改变速率。

通过激光振镜131实现对共焦显微系统模块140中样品成像区的快速二维扫描，激光振镜131的扫描角度范围和角度改变速率同时受到振镜控制器132和振镜控制器132内的时序控制程序的控制。

具体地，于本实施例中，对所述偏振片121和所述激光振镜131的控制的一种方式为：保持所述激光振镜131角度不变，不断改变所述偏振片121的偏振角度，当所述偏振片121振旋转一周后改变所述激光振镜131角度，再次旋转所述偏振片121一周，重复上述过程直到完成对所述样品成像区域的扫描。

对所述偏振片121和所述激光振镜131的控制的另一种方式为：保持所述偏振片121角度不变，控制所述激光振镜131完成对样品成像区域的扫描，扫描完成后旋转所述偏振片121，再次控制所述激光振镜131对样品成像区域的扫描，重复上述过程直到所述偏振片121旋转一周后结束。

于本实施例中，所述激发光耦合模块170装设于所述激光振镜131和所述显微系统模块140之间，将所述激光振镜131输出的激发光源输出至所述显微系统模块140。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述激发光耦合模块170包括反射镜171、二向色镜172、分束镜173或转镜中的一个或多个组合。

于本实施例中，所述显微系统模块140用于通过样品成像区聚焦所述激发光源并激发生成拉曼信号，其中，如图2所示，所述样品成像区包括表面增强拉曼光谱基片141和位于表面增强拉曼光谱基片141上的检测样品142。

具体地，于本实施例中，所述表面增强拉曼光谱基片141由具有偏振依赖特性的纳米颗粒二聚体、纳米线和纳米颗粒体系、纳米颗粒阵列-纳米线体系、纳米立方体或者具有纳米立方体核壳结构体系的一种或多种混合体系。

经过偏振调制的激发光源经过激光振镜131、平面镜和二向色镜172后进入物镜143，聚焦到位于sers基片上的检测样品142上。其中，检测样品142可以通过悬浮、吸附等形式固定在表面增强拉曼光谱基片141(sers基片)上，聚焦后的激发光源与检测样品142之间发生非弹性拉曼散射，产生拉曼信号。

由于激发光源具有某一方向的偏振，sers基片中的热点只有与激发光源的偏振方向一致的偏振极化等离子模式才能达到最大的拉曼增强效果，使sers基片上的拉曼信号能够受激发光的偏振性的调控。被激发的热点附近的样品分子产生的拉曼信号得到加强，而未被激发的热点附近的拉曼信号未加强。图3以银纳米颗粒二聚体为例来进行说明：二聚体的极化方向跟二聚体的长轴方向有关，在基片上呈现一种随机排布的形式。当激发光如图3中长箭头形式偏振。可以看到，只有长轴方向与激发光的偏振方向一致的热点被激发。进而产生表面拉曼散射增强效应来加强样品信号中的拉曼信号。而未被激发的二聚体无法对样品中的拉曼信号进行加强。

具体地，如图2所示，所述显微系统模块140包括：物镜143，输入的激发光源经所述物镜143聚焦于所述样品成像区，以激发生成拉曼信号；分光模块144，用于将所述拉曼信号分成两路，一路进入所述超分辨成像模块150，另一路进入所述拉曼光谱分析模块160。、其中，所述分光模块144为电动转镜或分束镜。

于本实施例中，所述超分辨成像模块150用于根据所述拉曼信号生成检测样品142的超分辨图像。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述超分辨成像模块150包括：依次设置的拉曼信号滤波片151、带通滤波片152、成像透镜153和阵列探测器154；其中，所述阵列探测器154实时记录所述检测样品142发光的状态，对所述检测样品142同一位置进行多帧采集并利用拉曼信号产生的闪烁效果对图像进行拉曼热点定位重构，生成超分辨图像。

具体地，于本实施例中，所述阵列探测器154为ccd阵列探测器、emccd阵列探测器或cmos阵列探测器。

被加强后的拉曼信号一路进入ccd/emccd/cmos阵列探测器154进行成像。由于光是一种电磁波具有衍射的特点，我们在ccd/emccd/cmos阵列探测器154中收集到的拉曼信号是由成像系统决定的点扩散函数调制过后的衍射光斑。衍射光斑光强大致具有高斯分布的特点，可以通过拟合定位的方法可以找到拉曼热点的纳米精度热点位置信息。在本系统采用的定位方法包括但不限于高斯分布拟合重构方法、多热点超高斯拟合重构方法以及压缩感知数据重构方法。

保持振镜不变，实时的改变偏振调制器，不断的改变激发光的偏振方向，使极化方向随机分布的热点能够随着激光的偏振方向的改变随机的被激发。每次改变激发光的偏振方向，ccd/emccd/cmos阵列探测器154进行每帧图像采集、定位获得热点位置信息的图像。将这个过程获得的所有图像叠加，实现超分辨成像。图3以纳米颗粒二聚体的基片为例，对该过程进行详细说明：图3a中激发光的偏振方向角为0°，图3a中所示只有一部分纳米颗粒二聚体(图3a中黑色二聚体颗粒)拉曼增强效应达到最强，增强的拉曼信号被阵列探测器154采集后，获得衍射光斑图像。通过上述的定位方法，进而获得拉曼信号的位置信息。连续改变激发光的偏振方向角，(图3b＝30°、图3c＝45°、图3d＝90°)获取不同位置的拉曼信号信息，将获得的所有图像进行重构即可得到样品的超分辨图像(图3e)。不断调节激光振镜131改变激发光聚焦在样品上的位置，获得多个其它位置的检测样本的超分辨图像。

于本实施例中，所述拉曼光谱分析模块160用于根据所述拉曼信号生成拉曼光谱并分析检测样品。

具体地，于本实施例中，如图2所示，所述拉曼光谱分析模块160包括：拉曼信号滤波片162、光纤耦合器163和生成所述拉曼光谱超分辨图像的光谱仪161。耦合光纤口径满足共焦扫描显微成像对收集光信号的要求，与激发光源模块110中输出光纤口径配合，使系统具有共焦扫描显微成像能力。

拉曼信号通过光纤耦合进入光谱仪161，获取某一偏振角下的拉曼光谱信息和被激发的热点的位置信息。拉曼光谱图在不同波长(λ1，λ2，λ3，λ4……)上会显示出拉曼峰。通过提取出不同位点的同一波长(λ1)拉曼峰强度与拉曼信号位置信息进行重构，获得在这一波长下(λ1)被激发位点的拉曼光谱成像图。同理获取其他波长(λ2，λ3，λ4……)下的拉曼光谱成像图。

以图4为例详细说明该拉曼光谱成像图获取过程。

当激发光的偏振角为0°时(图3a的黑色双箭头方向)，通过光谱仪161获取此时激发光聚焦的位置信息(图4a)和拉曼光谱(图4a5)。这些位置上的拉曼光谱分别在λ1，λ2，λ3，λ4上具有不同强度的拉曼峰，将λ1波长下的拉曼峰强度与拉曼信号的光源位置重构出如图4a1的拉曼光谱成像图。该图4a1在x、y方向维度上拉曼信号的位置信息，图像的灰度值代表着偏振角为0°、λ1的波长条件下拉曼峰的强度信息(图4a1中的黑色点位表示在此位置具有拉曼峰)。同理可获得λ2，λ3，λ4波长下拉曼光谱成像图(图4a2、图4a3、图4a4)。旋转偏振片121，不断改变激发光的偏振方向，重复上述过程，获得不同偏振角下的拉曼光谱成像图。如图4b所示，偏振光方向改变θ时，拉曼光谱发生变化。重构的拉曼光谱成像图如图4b1、图4b2、图4b3、图4b4所示。

将获取的拉曼光谱成像图进行重构获取拉曼光谱超分辨图像。重构方法：将同一波长、不同偏振角的拉曼光谱成像图叠加。图4c为λ1条件的拉曼光谱超分辨图像，该图是由不同偏振角(θ1，θ2，θ3...)、同一波长(λ1)的拉曼光谱分布图(图4a1、图4b1……)重构获得的。该图4在x、y方向维度上是拉曼信号的位置信息，图像的灰度代表不同偏振、λ1的波长条件下拉曼峰的强度(在图4c、图4d用不同的填充图案表示不同的拉曼峰强度)。

本实施例中的超分辨拉曼光谱成像系统100的工作过程如下：

拉曼激发激光器111光纤输出激光，通过光纤准直器112准直形成平行光进入由软件控制的连续旋转的偏振片121产生偏振方向连续改变的偏振光。随后偏振光经过激光振镜131和反射镜171后进入物镜143聚焦在sers基片上，激发检测样本发射拉曼信号。拉曼信号经过物镜143收集后被电动转镜或分束镜173分为两路：第一路进入ccd/emccd/cmos阵列探测器154进行成像，采用的超分辨成像方法是拉曼热点定位重构超分辨成像方法。另一路进入光谱仪161进行拉曼光谱超分辨成像。

如图5所示，本实施例还提供一种超分辨拉曼光谱成像方法，所述超分辨拉曼光谱成像方法包括：

步骤s110，产生激发光源并调制所述激发光源的偏振方向；

步骤s120，通过激光振镜131将所述激发光源聚焦于样品成像区，并通过样品成像区激发生成拉曼信号；其中，所述样品成像区包括表面增强拉曼光谱基片141和位于表面增强拉曼光谱基片141上的检测样品142；

步骤s130，不断调整所述激光激发光源的偏振方向或调整所述激光振镜131的扫描方向，控制完成所述样品成像区的不同激发位置生成拉曼信号；

步骤s140，分别根据所述拉曼信号生成检测样品142的超分辨图像和拉曼光谱超分辨图像。

于本实施例中，获取所述超分辨图像的一种过程包括：保持所述所述激光振镜131角度不变，不断调整所述激光激发光源的偏振方向，分别获取各个偏振方向下样品成像区生成的拉曼信号的热点位置信息图像，并将各个偏振方向下获取的热点位置信息图像进行叠加，形成检测样品142的超分辨图像；调节所述激光振镜131角度以改变所述激发光源激发拉曼信号在检测样品142上的位置，并重复上述过程，获取所述样品成像区上不同位置的多个检测样品142的所述超分辨图像。

即通过调节偏振旋转器改变激发光源的偏振特性。激发sers基片等离子激元增强模式中与激发光偏振方向一致的热点，产生最大拉曼增强效应。拉曼信号被阵列探测器154采集，获得随机的热点位置信息。不断改变激发光的偏振方向，控制ccd/emccd/cmos阵列探测器154的采集速率，获得一系列随机的热点位置信息。对采集到的像进行拉曼热点定位、重构获得检测样品142的所述超分辨图像。

具体地，于本实施例中，生成检测样品142的超分辨图像的完整过程如下：

1)将成像目标转移到具有强烈偏振依赖性的表面增强拉曼光谱(sers)基片上。偏振依赖sers基片可由具有偏振极化等离子体模式的金属二聚体、多聚体、立方体、核壳结构、纳米颗粒—纳米线结构中的一种或几种混合随机分布组成。

2)由激发光源模块110产生的激发光经过光纤和光纤准直器112后产生平行光后进入偏振调制模块120。在偏振调制模块120中，偏振片121旋转方向和旋转速度可以被控制器调节。偏振旋转方式包含但不局限于液晶偏振旋转器和1/2波片偏振旋转器。保持激光振镜131不动，旋转偏振器，调制激发光源的偏振方向，控制激发光的偏振夹角θ，以激发与激发光源偏振方向一致的sers基底上偏振极化的等离子模式(定义见图3所示)。

3)偏振调制后的激发光通过激光振镜131、反射镜171和二向色镜172进入物镜143，聚焦到sers基片上的样品。检测样品142可以通过悬浮、吸附等形式固定在sers基片上。聚焦后的激发光与样品分析物之间发生非弹性拉曼散射，产生拉曼信号。由于sers基片具有很强的偏振依赖性，只有与激发光源的偏振方向一致的偏振极化等离子模式才能达到最大的拉曼增强效果。这些位点的检测目标发出可检测的拉曼信号，而其余偏振极化的等离子模式位点没有增强效果。即实现sers热点在不同位点时明暗闪烁效果。

由于激发光具有某一方向的偏振，sers基片中的热点只有与激发光源的偏振方向一致的偏振极化等离子模式才能达到最大的拉曼增强效果，使sers基片上的拉曼信号能够受激发光的偏振性的调控。被激发的热点附近的样品分子产生的拉曼信号得到加强，而未被激发的热点附近的拉曼信号未加强。图3以银纳米颗粒二聚体为例来进行说明：二聚体的极化方向跟二聚体的长轴方向有关，在基片上呈现一种随机排布的形式。当激发光如图3中长箭头形式偏振。可以看到，只有长轴方向与激发光的偏振方向一致的热点被激发。进而产生表面拉曼散射增强效应来加强样品信号中的拉曼信号。而未被激发的二聚体无法对样品中的拉曼信号进行加强。

4)调节旋转偏振器连续改变激光的偏振方向，从而随机调制不同位置不同极化方向热点的拉曼发光，产生sers检测目标的闪烁效果。

于本实施例中，通过液晶偏振旋转器或1/2波片偏振旋转器调制所述激发光源的偏振方向。

5)成像目标的sers信号进入物镜143后进入ccd/emccd/cmos阵列探测器154，ccd/emccd/cmos阵列探测器154实时记录样品发光的状态，对样品同一位置进行多帧采集。利用产生的闪烁效果对图像进行拉曼热点定位重构，生成超分辨图像。

具体地，被加强后的拉曼信号一路进入ccd/emccd/cmos阵列探测器154进行成像。由于光是一种电磁波具有衍射的特点，我们在ccd/emccd/cmos阵列探测器154中收集到的拉曼信号是由成像系统决定的点扩散函数调制过后的衍射光斑。衍射光斑光强大致具有高斯分布的特点，可以通过拟合定位的方法可以找到拉曼热点的纳米精度位置信息。在本系统采用的定位方法包括但不限于高斯分布拟合重构方法、多热点超高斯拟合重构方法以及压缩感知数据重构方法。

保持振镜不变，实时的改变偏振调制器，不断的改变激发光的偏振方向，使极化方向随机分布的热点能够随着激光的偏振方向的改变随机的被激发。每次改变激发光的偏振方向，ccd/emccd/cmos阵列探测器154进行每帧图像采集、定位获得热点位置信息的图像。将这个过程获得的所有图像叠加，实现超分辨成像。图3以纳米颗粒二聚体的基片为例，对该过程进行详细说明：图3a中激发光的偏振方向角θ为0°，图3中所示只有一部分纳米颗粒二聚体(图3a中黑色二聚体颗粒)拉曼增强效应达到最强，增强的拉曼信号被ccd/emccd/cmos阵列探测器154采集后，获得衍射光斑图像。通过步骤5)所述的定位方法，进而获得拉曼信号的位置信息。连续改变激发光的偏振方向角θ，(图3bθ1＝30°、图3cθ2＝45°、图3dθ3＝90°)获取不同位置的拉曼信号信息，将获得的所有图像进行重构即可得到样品的超分辨图像(图3e)。

6)调节激光振镜131，即调节激光振镜131改变激发光聚焦在样品上的位置，改变激发光的聚焦位置，重复步骤2)至5)获得另一个位置的超分辨图像。

于本实施例中，通过拟合定位方法获取热点位置信息图像中的热点位置信息；其中，所述定位方法为高斯分布拟合重构方法、多热点超高斯拟合重构方法或压缩感知数据重构方法。

于本实施例中，获取所述拉曼光谱超分辨图像的一种过程包括：保持所述激发光源的偏振方向不变，不断调整所述激光振镜131的聚焦位置，并在每次调整所述激光振镜131的聚焦位置时采集被激发位置的热点位置信息和与该热点位置信息对应的拉曼光谱信息；通过获取的所述热点位置信息和与该热点位置信息对应的拉曼光谱信息构造拉曼光谱成像图；改变所述激发光源的偏振方向，重复上述过程直到激光偏振旋转一周后结束，获取不同偏振方向下多个所述拉曼光谱成像图；将获取的拉曼光谱成像图重构获取所述拉曼光谱超分辨图像。

即通过调节偏振旋转器改变激发光源的偏振特性。偏振光激发sers基片等离子激元增强模式中与激发光偏振方向一致的热点，产生最大拉曼增强效应。拉曼信号通过光纤耦合到光谱仪161，拉曼信号被光谱仪161采集，获得共焦显微拉曼光谱。通过振镜完成对样品的二维共焦快速扫描。在扫描过程中，振镜每一次改变扫描位置，光谱仪161就采集一次拉曼光谱。通过扫描的位置信息和该位置的拉曼光谱构造出拉曼光谱成像图。改变激发光的偏振方向，进行同区域共焦扫描拉曼光谱成像，获得拉曼成像图。重复该过程直到激光偏振旋转一周后结束。将同一波长拉曼光谱分布图重构获得拉曼光谱超分辨图。

于本实施例中，所述构造拉曼光谱成像图的一种方式为：提取同一波长拉曼峰强度与所述激发光源激发拉曼信号在检测样品142上的热点位置信息进行叠加，获取该波长下被激发位置的拉曼光谱成像图；其中，所述拉曼光谱成像图在x、y方向维度上是激发光源激发拉曼信号在检测样品142上的位置信息，图像的灰度值是波长拉曼峰的强度信息。

由于拉曼光谱图在不同波长(λ1，λ2，λ3，λ4……)上会显示出拉曼峰。可以提取出同一波长段拉曼峰强度与激光聚焦在样品上的位置信息进行重构，即在这一波长段下(λ1)被激发位点的拉曼光谱成像图。拉曼光谱成像图在x、y方向维度上是激光聚焦在样品上的位置信息，图像的灰度是波长段拉曼峰的强度信息。

于本实施例中，获取所述拉曼光谱超分辨图像的一种方式为：将同一波长、所有偏振方向下的所述拉曼光谱成像图重构获取所述拉曼光谱超分辨图像；获取所述拉曼光谱超分辨图像在x、y方向维度上是拉曼信号的位置信息，图像的灰度是不同偏振、某一波长条件下拉曼峰的强度积分。

具体地，获取所述拉曼光谱超分辨图像的过程如下：

1)将成像目标转移到具有偏振依赖性的sers基片，具有偏振依赖性的sers基片结构包括但不限于：纳米颗粒二聚体、纳米线和纳米颗粒体系、纳米颗粒阵列-纳米线体系、纳米立方体或者具有纳米立方体核壳结构体系。

2)激发光通过光纤和光纤准直器112产生平行光进入偏振调制模块120产生偏振光。

3)偏振光经过激光振镜131、平面镜、二向色镜172和物镜143后聚焦在sers基片上，控制器控制激光振镜131二维扫描，快速扫描样品共焦显微成像区域。

4)由于激发光具有某一方向的偏振，sers基片中的热点只有与激发光源的偏振方向一致的偏振相关等离子模式才能达到最大的拉曼增强效果，被激发的热点附近的样品产生的拉曼信号得到加强，而未被激发的热点附近的拉曼信号未加强。

5)拉曼信号通过光纤耦合进入光谱仪161，获取某一偏振角下的拉曼光谱信息和被激发的热点的位置信息。拉曼光谱图在不同波长(λ1，λ2，λ3，λ4……)上会显示出拉曼峰。通过提取出不同位点的同一波长(λ1)拉曼峰强度与拉曼信号位置信息进行重构，获得在这一波长下(λ1)被激发位点的拉曼光谱成像图。同理获取其他波长(λ2，λ3，λ4……)下的拉曼光谱成像图。以图4为例详细说明该拉曼光谱成像图获取方法。当激发光的偏振角为0°时(图3a的黑色双箭头方向)，通过光谱仪161获取此时激发光聚焦的位置信息(图4a)和拉曼光谱(图4a5)。这些位置上的拉曼光谱分别在λ1，λ2，λ3，λ4上具有不同强度的拉曼峰，将λ1波长下的拉曼峰强度与拉曼信号的光源位置重构出如图4a1的拉曼光谱成像图。该图在x、y方向维度上拉曼信号的位置信息，图像的灰度是偏振角为0°、λ1的波长条件下拉曼峰的强度信息(图4a1中的黑色点位表示在此位置具有拉曼峰)。同理可获得λ2，λ3，λ4波长下拉曼光谱成像图(图4a2、图4a3、图4a4)。

6)旋转偏振片121，不断改变激发光的偏振方向，重复步骤5)获得不同偏振角下的拉曼光谱成像图。如图4b所示，偏振光方向改变θ时，拉曼光谱发生变化。重构的拉曼光谱成像图如图4b1、图4b2、图4b3、图4b4所示。

7)将获取的拉曼光谱成像图进行重构获取拉曼光谱超分辨图像。重构方法：将同一波长、不同偏振角的拉曼光谱成像图叠加。图4c为λ1条件的拉曼光谱超分辨图像，该图是由不同偏振角(θ1，θ2，θ3...)、同一波长(λ1)的拉曼光谱分布图(图4a1、图4b1……)重构获得的。该图4在x、y方向维度上是拉曼信号的位置信息，图像的灰度表示是不同偏振、λ1的波长条件下拉曼峰的强度积分(在图4c、图4d用不同的填充图案表示不同的拉曼峰强度)。

综上所述，本发明基于偏振调制和拉曼热点定位超分辨技术通过主动调制激发光偏振来调节sers的闪烁特性，控制sers闪烁速率并与高效快速的重构技术相结合，不仅在能够扩展超分辨成像样品的使用范围，还能够高效获取用于生物样本和化学样本的无标记超分辨成像和拉曼光谱的超分辨成像，极大程度上增加样品拉曼光谱的信息量，有效解决现有技术中拉曼超分辨成像中适用范围小、成像时间长、sers闪烁行为不可控等问题，有效提高对于样品成分的解析能力，为研究偏振对于样品拉曼光谱的影响起重要作用。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中包括通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。