基于铜纳米簇荧光探针定量检测溶液中谷丙转氨酶的方法与流程

本发明属于金属铜纳米簇在荧光传感方面的应用领域，具体涉及一种通过荧光“off-on”模式利用铜纳米簇作为荧光探针，免标记、高效、特异性检测复杂体系中谷丙转氨酶含量方面的方法。

背景技术：

谷丙转氨酶（alt）又名谷氨酸转氨酶，是人体中一种重要的转氨酶，它能催化l-丙氨酸中的氨基酸转化为a-酮戊二酸。谷丙转氨酶位于身体的大部分细胞中，在肝脏中浓度最高。早期研究表明，谷丙转氨酶是肝脏疾病的标志物，谷丙转氨酶升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标，各类肝炎都会引起谷丙转氨酶升高，肝脏细胞被严重损坏后，谷丙转氨酶的含量可能会上升到常规含量的50倍，谷丙转氨酶升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，这是因为在肝脏受到破坏后谷丙转氨酶被释放到血液中所造成的，谷丙转氨酶偏高主要是对肝脏造成危害，导致肝细胞不断地损伤，同时会对肝脏的代谢和解毒能力降低，从而使得药物代谢和身体毒素得不到及时排出，又进一步加重肝脏的负担，谷丙转氨酶长期升高会引发病变，严重者更会引发肝癌。因此，谷丙转氨酶含量的检测对于疾病诊断来说是至关重要的。目前，评估谷丙转氨酶含量常规的方法是分光光度法。然而，这个结果可能是不准确的，而且这些方法通常检出限较高或者需要酶或辅酶因子等昂贵的试剂，因此，为了解决这些问题，又有很多新的检测谷丙转氨酶含量的方法被建立，例如：比色法，色谱层析法等，但由于其检测前处理的苛刻条件、检测纯度的较高要求、检测灵敏度低等问题都限制了这些方法的广泛应用。众所周知，荧光测定的方法过程快速，操作便捷，无需复杂的前处理过程，灵敏度高，具有较低的检出限，因此，建立一种利用荧光分光光度法分析检测谷丙转氨酶含量的方法在实际应用方面具有重大的意义。本发明以谷胱甘肽为保护剂和还原剂合成铜纳米簇，并通过荧光“off-on”模式，利用硫普罗宁（trp）作为猝灭剂，谷丙转氨酶作为恢复剂，实现了对溶液中谷丙转氨酶的含量进行无标记、高灵敏的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服传统复杂的检测方法，建立一种利用荧光分光光度法，方便、快速的选择性检测复杂体系中谷丙转氨酶含量的方法，本发明提供了一种基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇作为荧光探针，通过荧光“off-on”模式实现了对谷丙转氨酶进行免标记、高灵敏、选择性的检测，该方法简单、快捷，检测线性范围宽，检出限低，在本发明中采用铜纳米簇检测谷丙转氨酶，具有较好的检测灵敏度和选择性，在疾病检测和临床应用等方面具有很好的应用前景。

为实现上述目的，本发明公开了一种基于铜纳米簇荧光探针定量检测溶液中谷丙转氨酶的方法,它以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇作为荧光探针，通过荧光“off-on”模式特异性检测溶液中谷丙转氨酶含量，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)硫普罗宁母液配置：称取0.1000g硫普罗宁溶于5ml高纯水中；将母液稀释之浓度为1mg/ml的低浓度，低温保存待用；

(2)分别配置浓度为1,5，50,100,500,1000u/l的谷丙转氨酶溶液，低温保存待用；

(3)将制备好的基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇均匀分散到高纯水中，配制成浓度为0.675mm，体积为4ml的检测体系，并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度，在激发波长354nm的激发下，该荧光探针在632nm处表现出较强发射；

(4)将1.2ml铜纳米簇均匀分散到2.6ml高纯水中，混合均匀后，向混合溶液中加入0.1ml1mg/ml的硫普罗宁溶液，加高纯水0.1ml，待硫普罗宁与铜纳米簇溶液充分作用后测试体系的荧光强度，此时的荧光强度发生明显猝灭，故硫普罗宁可作为该检测体系的猝灭剂；

(5)向离心管中加入2.6ml高纯水中，1.2ml铜纳米簇溶液，混合均匀后，向混合溶液中加入0.1ml1mg/ml的硫普罗宁溶液，充分反应后再加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，硫普罗宁与谷丙转氨酶充分作用，使得荧光强度恢复并检测其荧光发射光谱，通过与（4）中荧光强度对比，可以利用荧光发射光谱强度的恢复值证明该铜纳米簇作为荧光探针检测谷丙转氨酶的可行性；

(6)检测溶液中谷丙转氨酶的含量线性的测定

向离心管中分别加入0.2~3.4ml高纯水，0.4~3.6ml铜纳米簇溶液，0.1ml硫普罗宁溶液，向混合溶液中分别加入0.1ml不同浓度1~1000u/l的谷丙转氨酶溶液，充分反应1~15min，分别用荧光分光光度计检测加入谷丙转氨酶前后的荧光强度；所述的铜纳米簇是指基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇。实验结果表明，在谷丙转氨酶浓度在1-1000u/l范围内，铜纳米簇的荧光强度恢复值与谷丙转氨酶的浓度呈现线性关系，线性方程为df=116.90744+0.54101x（df是加入谷丙转氨酶后的荧光强度与只加入硫普罗宁后铜纳米簇的荧光强度得差值，x是谷丙转氨酶的浓度），线性相关系数为0.992，检出限为0.61u/l。

以上涉及到的铜纳米簇溶液均为基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇，具体的合成方法见实施例1。

本发明公开的铜纳米簇作为荧光探针特异性检测溶液中谷丙转氨酶含量方面的应用所具有的积极效果如下：

（1）合成的铜纳米簇具有稳定的光学性质，合成材料粒径小，荧光性能好，合成方法简单、快速，合成过程中不需要加热、调节ph、功能化等复杂的过程，合成材料发光位置在632nm，在紫外灯下可看到明显的红色。

(2)利用合成的具有独特光学性能的铜纳米簇作为荧光探针采用荧光“offon”模式，高效选择性传感谷丙转氨酶的含量，过程简单、快捷，可以直接实现对谷丙转氨酶的选择性检测。

(3)利用硫普罗宁作为猝灭剂，使铜纳米簇的荧光强度下降到较低数值，再利用谷丙转氨酶作为恢复剂，使荧光强度恢复到较高数值，该种方法可以实现谷丙转氨酶的特异性检测，检测线性范围宽，检出限低。

附图说明

图1为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇的透射电镜图(tem)，说明了合成的铜纳米簇粒径尺寸均一、粒径较小、且分布均匀；

图2为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇的荧光激发光谱和发射光谱图，表明其最大激发波长为354nm，最大发射波长为632nm；

图3为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇检测溶液中的谷丙转氨酶的可行性分析；

图4为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇、铜纳米簇中加入硫普罗宁以及铜纳米簇中加入硫普罗宁和谷丙转氨酶的紫外灯图片；其中1表示铜纳米簇在紫外灯下呈现红色，2表示加入硫普罗宁后溶液变浑浊，3中加入谷丙转氨酶后溶液又恢复为原来的澄清状态；

图5为以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇检测溶液中的谷丙转氨酶的线性图，线性范围为1-1000u/l，检出限是0.61u/l。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：谷胱甘肽，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；抗坏血酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化铜(99%)，天津光复精细化工有限公司；氢氧化钠，天津市科威有限公司；硫普罗宁，上海生工生物工程股份有限公司；谷丙转氨酶，安耐吉化学科技有限公司。铜纳米簇的制备方法可参照(wang,c.;ling,l.;yao,y.;song,q.nanoresearch2015,8(6),1975-1986)或见实施例1。

实施例1

以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇的制备室温条件下按照如下步骤进行：

(1)0.1m氯化铜溶液的配制：称取1.7048gcucl2∙2h2o溶于100ml高纯水中，充分溶解后备用；

(2)铜纳米簇的制备：室温条件下，称取谷胱甘肽0.28g溶于15mlh2o中，向其中加入450mlcucl2(0.1m),充分反应后，加入0.1g抗坏血酸(aa)，再加入1mlnaoh(1m)，反应1h，至白色悬浊液完全溶解变为浅黄色澄清透明溶液，证明铜纳米簇的形成。通过透射电镜图(tem)（图1）可以看出铜纳米簇分散均匀，粒径较小。

实施例2

铜纳米簇作为荧光探针特异性检测谷丙转氨酶的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

(1)硫普罗宁母液配置：称取0.1000g硫普罗宁溶于5ml高纯水中；将母液稀释之浓度为1mg/ml的低浓度，低温保存待用；

(2)一系列谷丙转氨酶不同浓度溶液的配制：

分别配置浓度为1,5，50,100,500,1000u/l的谷丙转氨酶溶液，低温保存待用；

(3)将制备好的基于谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇均匀分散到高纯水中，配制成浓度为0.675mm，体积为4ml的检测体系，并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度，在激发波长354nm的激发下，该荧光探针在632nm处表现出较强发射；

(4)将1.2ml铜纳米簇均匀分散到2.6ml高纯水中，混合均匀后，向混合溶液中加入0.1ml1mg/ml的硫普罗宁溶液，加高纯水0.1ml，待硫普罗宁与铜纳米簇溶液充分作用后测试体系的荧光强度，此时的荧光强度发生明显猝灭，故硫普罗宁可作为该检测体系的猝灭剂；

(5)向离心管中加入2.6ml高纯水中，1.2ml铜纳米簇溶液，混合均匀后，向混合溶液中加入0.1ml1mg/ml的硫普罗宁溶液，充分反应后再加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，硫普罗宁与谷丙转氨酶充分作用，使得荧光恢复并检测其荧光发射光谱，通过与（4）中荧光强度对比，可以利用荧光发射光谱强度的恢复值证明该铜纳米簇作为荧光探针检测谷丙转氨酶的可行性；

(6)检测溶液中谷丙转氨酶含量线性的测定

向离心管中分别加入2.6ml高纯水，1.2铜纳米簇溶液，0.1ml硫普罗宁溶液，向混合溶液中分别加入0.1ml不同浓度1~1000u/l的谷丙转氨酶溶液，充分反应1~15min，分别用荧光分光光度计检测加入谷丙转氨酶前后的荧光强度。实验结果表明，在谷丙转氨酶浓度在1-1000u/l范围内，铜纳米簇的荧光强度恢复值与谷丙转氨酶的浓度呈现线性关系，线性方程为df=116.90744+0.54101x（df是加入谷丙转氨酶后的荧光强度与只加入硫普罗宁后铜纳米簇的荧光强度得差值，x是谷丙转氨酶的浓度），线性相关系数为0.992，检出限为0.61u/l。

实施例3

1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；

2、以谷胱甘肽为稳定剂的铜纳米簇的激发光谱和发射光谱的测定：

将铜纳米簇分散到高纯水中对材料的荧光激发光谱和荧光发射光谱进行测定，如图2所示，铜纳米簇的最大激发波长为354nm，在最大激发波长的激发下，荧光发射波长为632nm。

实施例4

1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；

2、采用荧光为测试手段，利用以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇特异性检测谷丙转氨酶：

分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.6ml加入到①、②号离心管中，再移取1.2ml铜纳米簇溶液分别加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再向其中加入0.1ml高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再向其中加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，充分反应10min,使得荧光发生恢复并用荧光光度计检测荧光发射强度，激发波长为354nm，发射波长为632nm；检出限为0.61u/l

实施例5

1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；

2、紫外灯下以谷胱甘肽为保护剂和还原剂的铜纳米簇、铜纳米簇中加入硫普罗宁以及铜纳米簇中加入硫普罗宁和谷丙转氨酶的样品发光情况：

分别取3支空离心管，编号（1）、（2）、（3），分别移取高纯水2.6ml加入到（1）、（2）、（3）号离心管中，再移取1.2ml铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向（1）号离心管中加入0.2ml高纯水，向（2）号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再向其中加入0.1ml高纯水，向（3）号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再向其中加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，充分反应10min,使得荧光发生恢复并用紫外灯箱检测其发光情况。如图4所示，1表示铜纳米簇在紫外灯下呈现红色澄清状态，加入硫普罗宁后溶液变浑浊（2），3中加入谷丙转氨酶后溶液又恢复为原来的澄清状态。

实施例6

1、以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇的制备参照实施例1；

2、采用荧光的测试手段，利用以谷胱甘肽为保护剂的铜纳米簇特异性检测溶液中的谷丙转氨酶可行性：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.2ml加入到①、②号离心管中，再移取1.6ml铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，0.1ml高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，反应10min,使得荧光恢复并用荧光光度计检测荧光发射强度；检出限为0.61u/l。

实施例7

谷丙转氨酶的检测：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水0.4ml加入到①、②号离心管中，再移取3.2ml铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，0.1ml高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再加入0.1ml谷丙转氨酶溶液，反应10min,使得荧光恢复并用荧光光度计检测荧光发射强度；检出限为0.61u/l。

实施例8

谷丙转氨酶的检测：分别取2支空离心管，编号①、②，分别移取高纯水2.8ml加入到①、②号离心管中，再移取1.0ml铜纳米簇溶液加入不同的离心管中，混合均匀后，继续向①号离心管中加入0.1ml硫普罗宁，再加入0.1ml高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入0.1ml硫普罗宁,再加入0.1ml谷丙转氨酶，反应10min,使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度。检出限为0.61u/l。