本发明属于抗氧化剂的含量测定领域，具体涉及一种生物柴油中tbhq的测定方法。
背景技术：
生物柴油是一种重要的化工产品和燃料，其在存储过程中，会受到空气、热、金属、过氧化物和光等环境因素的影响而发生氧化，进而生成醛、酮、短链羧酸、烃等。这些氧化产物对生物柴油的质量(如运动黏度、酸值、过氧化值)会产生不利影响。因此，良好的氧化安定性是确保生物柴油品质的关键因素。
向生物柴油中添加抗氧化剂是改善其氧化安定性的最为简单和有效的方法。叔丁基对苯二酚(tbhq)是一种食用油脂中使用最广泛且效果最好的合成抗氧化剂。由于生物柴油主要成分是脂肪酸甲酯，其可由食用油脂或不可食用油脂与甲醇反应制备得到，故生物柴油中也常添加tbhq作为抗氧化剂。添加了tbhq的生物柴油在储存过程中，tbhq会不断氧化为叔丁基对苯醌(tq)，反应过程如下所示：
生物柴油中抗氧化剂tbhq的含量直接影响生物柴油的各项品质，故准确检测tbhq在生物柴油中的含量十分重要。目前，已经出现了采用高效液相色谱法、气相色谱法、电化学方法等来测定生物柴油中的tbhq含量，其中又以高效液相色谱法最为常用。高效液相色谱法在测定时，需要采用溶剂(如甲醇)来提取生物柴油中的tbhq；由于甲醇类溶剂优良的溶解性，该类溶剂会将样品中tbhq、tq以及部分生物柴油都提取出来；而tq不稳定，在进入高效液相色谱仪分析时会在流动相溶剂作用下发生部分还原生成tbhq，故现有方法难以准确测定生物柴油样品中tbhq的含量。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生物柴油中tbhq的测定方法，从而解决现有测定方法不能准确检测生物柴油中tbhq含量的问题。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种生物柴油中tbhq的测定方法，包括以下步骤：
1)向生物柴油中加入醇类组合溶剂进行萃取，分离得到萃取液；所述醇类组合溶剂由多元醇和氯化胆碱组成；
2)测定萃取液中tbhq的含量。
本发明提供的生物柴油中tbhq的测定方法，以醇类组合溶剂作为萃取溶剂对生物柴油样品进行萃取，可以选择性的将生物柴油样品中的tbhq提取出来，但不提取样品中的tq，因而可以实现生物柴油中tbhq含量的准确检测。
步骤1)中，为更进一步优化醇类组合溶剂的萃取效果，优选的，所述醇类组合溶剂中，多元醇和氯化胆碱的摩尔比不大于5:1，更优选为(1-5):1。为获得更加稳定、高效的萃取效果，优选的，所述醇类组合溶剂由包括以下步骤的方法得到：将多元醇和氯化胆碱在60-80℃下加热混合5-60min，即得。为提高多元醇的萃取效果，优选的，所述多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种。
优选的，所述萃取为液相微萃取，采用漩涡混合进行所述液相微萃取。漩涡混合的速度可以在250-1000r/min，时间可以为0.5-15min。试验证明，本发明的醇类组合溶剂可以通过漩涡混合来实现液相微萃取，这就在实现了tbhq高效富集的同时，极大的简化了样品的前处理时间，提高了检测效率。优选的，每0.05-0.5g生物柴油对应醇类组合溶剂的加入量为100-800μl。采用以上比例进行萃取，可以在保证萃取效果的基础上，减少醇类组合溶剂的用量。液相微萃取后，分离可采用离心分离。离心分离时的转速可选择为3000-4000r/min，时间可选择为5-15min。
步骤2)中，通过反相高效液相色谱法测定萃取液中tbhq的含量。测定萃取液中tbhq的含量的方法有很多，如高效液相色谱法、气相色谱法、电化学方法，其中高效液相色谱法为现行通用的方法，其具有检测效率高、检测结果稳定的特点。
进一步在上述优选条件下进行生物柴油中tbhq的测定，经试验验证，其重复性和回收率好，测定过程得以大幅度简化，所需试剂和生物柴油用量少，非常适用于大批量生物柴油中tbhq的快速分析。
附图说明
图1为本发明实施例1的待测液在hplc-uv仪器上的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。
本发明的生物柴油中tbhq的测定方法的实施例1，采用以下步骤：
1)将乙二醇和氯化胆碱按摩尔比2:1加入到圆底烧瓶中，在70℃加热混合20min，形成均一透明的液体，即为醇类组合溶剂。
2)将醇类组合溶剂400μl加入到盛有0.2g生物柴油的磨口具塞试管中，在室温下漩涡混合萃取5分钟(漩涡混合参数为500r/min)，然后以3000r/min的速度离心10min，下清液即为待测液。
3)采用外标法进行定量分析。
准确称取0.05gtbhq标准品于100ml的棕色容量瓶中，用色谱级甲醇进行溶解并定容至100ml，得到500mg/kg的tbhq储备液，于4℃冰箱保存备用。取不同量的tbhq储备液于10ml棕色容量瓶中并用色谱级甲醇进行稀释，分别得到浓度为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg的稀释液，稀释液用0.45μm的滤膜过滤后，即得tbhq系列标准溶液，然后采用反相高效液相色谱仪(hplc-uv)进行检测，建立标准曲线。
取步骤2)所得待测液在同等条件下进行hplc-uv检测，将检测值代入标准曲线，对生物柴油中的tbhq进行定量。hplc-uv的分析条件为：色谱柱：symmetryc18(4.6mm×250mm，5μm，waters)。柱温：35℃；进样量：10μl；流速：0.8ml/min。流动相：a相为100％甲醇，b相为乙酸和水的混合溶液，乙酸的体积占比为0.5％，梯度洗脱，其中a：0min-5min，50％；5min-15min，50％-80％；15min-20min，80％；20min-25min，80％-90％；25min-28min，90％-100％；28min-31min，100％-50％；31min-35min，50％。采用紫外检测器，检测波长为280nm。叔丁基对苯二酚(tbhq)的保留时间(rt)为11.8min。
本发明的生物柴油中tbhq的测定方法的实施例2，采用以下步骤：
1)将丙二醇和氯化胆碱按摩尔比3:1加入到圆底烧瓶中，在60℃加热混合40min，形成均一透明的液体，即为醇类组合溶剂。
步骤2)、步骤3)与实施例1一致。
本发明的生物柴油中tbhq的测定方法的实施例3，采用以下步骤：
1)将丙二醇和氯化胆碱按摩尔比5:1加入到圆底烧瓶中，在80℃加热混合10min，形成均一透明的液体，即为醇类组合溶剂。
2)将醇类组合溶剂400μl加入到盛有0.5g生物柴油的磨口具塞试管中，在室温下漩涡混合萃取10分钟(漩涡混合参数为500r/min)，然后以3000r/min的速度离心10min，下清液即为待测液。
步骤3)与实施例1一致。
对比例1
对比例1采用苯乙醇和氯化胆碱按摩尔比2:1组成醇类组合溶剂，其他测定过程与实施例1相同。
对比例2
对比例2采用乙二醇和氯化胆碱按摩尔比10:1组成醇类组合溶剂，其他测定过程与实施例1相同。
试验例1
本试验例评价实施例1的方法的有效性，其他实施例的实测效果与实施例1相当。实施例1的待测液在hplc-uv仪器上的色谱图如图1所示，可以看出，利用醇类组合溶剂对生物柴油样品中的tbhq进行提取，对tbhq在液相色谱检测中的出峰没有干扰。
针对同一生物柴油样品一天内进行6次平行测定及分5天测定，确定方法的相对标准偏差(rsd)来表征该方法的日内重复性和日间重复性，同时进行回收率实验，结果如表1-3所示。
表1实施例1的方法的日内重复性检测结果
表2实施例1的方法的日间重复性检测结果
表3tbhq加标回收率实验结果
由表1-3的试验结果可知，实施例的方法具有良好的重复性和回收率，试验结果的可靠性好，可适用于大批量生物柴油的tbhq定量分析。
试验例2
本试验例将实施例的方法与ny/t1602-2008规定的方法的测定结果进行比较。ny/t1602-2008规定的方法是用甲醇提取纯化，反相c18柱分离后，用紫外检测器在280nm检测，外标法定量。
采用实施例1的方法和现有测定方法(ny/t1602-2008规定的方法)对3个生物柴油样品进行测定，结果如表4所示。其中3个生物柴油样品为实验室配制：样品1含有tbhq100mg/kg、样品2含有tq100mg/kg和样品3含有tbhq100mg/kg以及tq100mg/kg。
表4各方法对生物柴油样品的测定结果
由表4的测定结果可知，实施例的方法只提取样品中的tbhq，而不提取tq。对比例1和对比例2的方法对tbhq的提取效果欠佳，对比例1和ny/t1602-2008规定的方法对tbhq的提取没有选择性。
采用实施例2的方法和现有测定方法(ny/t1602-2008规定的方法)对一添加tbhq的生物柴油样品(tbhq的添加量为200mg/kg)进行3个月的跟踪测定，结果如表5所示。
表5各方法对生物柴油样品在不同储存时间下的tbhq测定结果
由表5的测定结果可以看出，实施例的方法只提取样品中的tbhq，而不提取tq。随着生物柴油样品储存时间的延长，ny/t1602-2008规定的方法因对tbhq的提取没有选择性，导致其检测结果比实施例的测定方法要偏高10-20％。
由此可见，实施例的方法可以准确有效地反映生物柴油样品中tbhq的真实含量，而且整个测定过程简单易行，萃取试剂和生物柴油的用量少，结合现行通用的反相高效液相色谱进行检测，降低了生物柴油中tbhq的检测成本，提高了检测效率和准确性，推广应用前景良好。