一种使用毛细管电泳-质谱联用检测独脚金内酯类似物的方法与流程

本发明涉及独脚金内酯类似物的检测方法，具体为采用毛细管电泳-质谱联用法检测独脚金内酯类似物的方法。

背景技术：

独脚金内酯(strigolactones)是近年来发现的一种新型植物激素，作为一种产生于植物根部的类胡萝卜素衍生物，被称作第七种植物激素。它能够与生长素和细胞分裂素协同抑制植物的分枝和侧芽的生长、诱导丛枝真菌菌丝分枝、促进植物和土壤微生物的共生作用。另外，在植物与其寄生植物相互作用的过程中，独脚金内酯还起到信号分子的作用，它可以诱导寄生植物如独脚金属、列当属种子的萌发。

独脚金内酯具有非常广泛的应用前景，然而很难从植物中提取大量天然的独脚金内酯，人们从而转向通过化学合成的方法得到人工独脚金内酯。其中以gr24最为出名，是首个最为有效的人工合成独脚金内酯类似物，结构式如下图。其能够促进多种根寄生植物种子萌芽，也可以调控植物的分枝，还具有调控丛枝真菌菌丝分枝，调控小立碗藓扩张等功能。其生物活性原理已经被证实与独脚金内酯相同，是通过调控植物的生长素合成的方式来控制植物发育。

早期检测独脚金内酯类似物gr24的技术是以气相色谱-质谱联用为主，然而由于独脚金内酯自身的化学特性不稳定，在气相前处理衍生化的过程中容易损失掉大量成分，导致检测精度下降。目前科学界常用的检测手段是利用高效液相色谱-质谱联用法，该方法对比传统的气质联用法，样品无须经过前处理，对于受热易分解的样品比较适合，应用范围更广，但是存在样品用量大、检测耗时、单针检测昂贵等缺点。

因此需要一种精度高、快速、且成本低的独脚金内酯类似物的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种使用毛细管电泳-质谱法检测独脚金内酯类似物的方法。

本发明采用了如下技术方案：

一种使用毛细管电泳-质谱联用检测独脚金内酯类似物的方法，所述方法为将独脚金内酯类似物溶液在毛细管电泳-质谱联用仪中上样检测，其特征为所述方法：

(1)采用5-15kv的电压在毛细管电泳-质谱联用仪中进行电泳，选用75μm内径的色谱柱，采用乙酸铵溶液作为缓冲液，使用添加乙酸铵的50％甲醇作为鞘流液；

(2)使用chemstation对色谱图进行分析，得到所述独脚金内酯类似物色谱峰；

(3)使用dataanalysis对质谱图进行分析，得到所述独脚金内酯类似物质谱图和所述独脚金内酯类似物的子离子信息。

进一步的，所述步骤(1)中采用20mmol乙酸铵溶液作为缓冲液。

进一步的，所述步骤(1)中选用75μm内径未涂层熔融石英毛细管作为色谱柱。

进一步的，所述步骤(1)中使用50％甲醇加入1％乙酸铵作为鞘流液。

进一步的，所述步骤(1)选用8kv作为分离电压。

优选的，一种使用毛细管电泳-质谱联用检测独脚金内酯类似物的方法，所述方法的特征为：

(1)采用8kv的电压在毛细管电泳-质谱联用仪中进行电泳，选用75μm内径未涂层熔融石英毛细管作为色谱柱7，采用20mmol乙酸铵溶液作为缓冲液，使用添加1％乙酸铵的50％甲醇作为鞘流液；

(2)使用chemstation对色谱图进行分析，得到所述独脚金内酯类似物色谱峰；

(3)使用dataanalysis对质谱图进行分析，得到所述独脚金内酯类似物质谱图和所述独脚金内酯类似物子离子信息。

优选的，所述独脚金内酯类似物为gr24。

本发明所述方法较现有技术具有以下突出的优点：

1.本发明的方法使用毛细管电泳-质谱联用法检测独脚金内酯类似物，精度较高，检测所需样品量较小，且节约时间，检测只需要廉价的乙酸铵配制成的缓冲液，大幅度降低了检测成本。

2.本发明的方法首次将质谱联用法配合到毛细管电泳进行独脚金内酯的检测，克服了毛细管电泳常用缓冲液不能打入质谱的问题，使用了可挥发的乙酸铵作为缓冲盐，使得联用检测成为可能，结合了毛细管电泳的高效分离与质谱的精确定性功能，使得检测结果更为精准。

附图说明：

图1为实施例中采用5kv电压进行电泳的色谱图。

图2为实施例中采用8kv电压进行电泳的色谱图。

图3为实施例中采用15kv电压进行电泳的色谱图。

图4为实施例中采用100μm色谱柱的色谱图。

图5为实施例中采用未添加乙酸铵的鞘流液的色谱图。

图6为实施例的质谱图。

具体实施方式

下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明

本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。

具体实施例：

下列实施例中，以针对独脚金内酯类似物gr24的检测为例进行说明。

检测所使用的仪器为美国agilent公司的agilent3d-ce毛细管电泳联用1100lc/msd离子阱质谱，使用内径未涂层熔融石英毛细管90cm。

检测步骤为：

(1)称取标准品gr2410mg，以乙醇作溶剂，溶解后使用纯水定容至0.1mg/ml得到样品溶液。

(2)取配好的样品溶液在毛细管电泳仪中进样，进样前先用0.1mmol氢氧化钠溶液冲洗毛细管20min，再用纯水冲洗20min，缓冲液冲洗20min以确保重现性，提高精确度，采用5-15kv运行电压进行电泳，缓冲液使用乙酸铵溶液，鞘流液为50％甲醇中添加乙酸铵，鞘流液流速为0.4ml/min，分流比为100:1，紫外波长选择214nm，柱温为25℃，进样压力30mbar进样1s，电泳时间设置为15min。

(3)使用chemstation对色谱图进行分析，得到gr24色谱峰。

(4)使用dataanalysis对质谱图进行分析，得到gr24质谱图，通过该图分析gr24子离子信息。

试验参数的优化：

(1)分离电压的选择：

采用不同的电压5、8、15kv进行电泳，得到不同的质谱图，分别如图1、2、3所示，当分离电压为5kv时，质谱图的出峰时间延后，峰型有略微的拖尾，峰型唯一，当分离电压为15kv时，质谱图的出峰时间较早，分离时间缩短，但是电压较高时会出现一些杂峰。

(2)色谱柱的选择：

采用不同内径的色谱柱50、75、100μm进行测试，当采用50μm内径的毛细管时，由于内径过小，容易使毛细管发生堵塞，导致样品无法顺利进行分离，无法显示峰图。如图4所示，使用了100μm内径的毛细管会导致检测量的下降，且出峰时间也会有部分拖延，一般在操作中避免选择内径过大的毛细管作为色谱柱。

(3)鞘流液选择：

当采用未添加乙酸铵的鞘流液时，色谱图容易出现毛刺状的峰型(图5)。

综上，选择分离电压为8kv进行电泳，选择75μm内径的毛细管，和添加1％乙酸铵的50％甲醇作为鞘流液，得到图2的色谱图和图6的质谱图。使用chemstation对色谱图进行分析，得到gr24色谱峰，上样量仅为0.4μl，由此推算出其最低检测限为22.3pmol。

使用dataanalysis对质谱图进行分析，得到gr24质谱图，通过该图分析gr24子离子信息(表1)。

质谱可以测得样品的质荷比，图6中可以看到质荷比为299的gr24母离子(m/z＝299.1)，打碎后可以明显看到烯醚键断裂后生成的质荷比为97的d环特征离子；同时还有多重co和h2o的中性离子丢失状况(281,263,235,225,207)，除去常见的[m+h]⁺直接丢失中性离子的情况外，gr24还出现abc环丢失h2o中性碎片子离子的情况。具有内酯结构的gr24离子在质谱中通过高电压可以解离出h2o中性碎片，其c环与d环的内酯结构中的氧容易质子化后发生开环裂解，羰基的氢原子重排至醇羟基处，从而使中性碎片丢失；同时由于中性的d环在高电压下丢失，化学键发生均裂，产生abc环的自由基子离子，由于c环中内酯羰基和烯键的存在，能够发生共轭稳定，从而得到奇电子离子(202,184)。这些子离子信息可以从分子结构层面证实测试样品确为gr24。

表1gr24的子离子类别与对应质荷比信息

本发明方法对比目前常用的液相色谱-质谱联用法，所需样品只需1-2μl，液相色谱-质谱联用则需要10μl、且能够在2分钟内检测到gr24，节省了近5倍的时间、同时检测只需要廉价的乙酸铵配制成的缓冲液，大幅度降低了检测成本。