与先天性心脏病相关的砷镉混合暴露生物标志物及其检测方法和应用与流程

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及与先天性心脏病相关的砷镉混合暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为砷镉混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。

背景技术：

先天性心脏病(chd)是先天性畸形中最常见的一类，约占主要先天畸形的三分之一，世界上每年有135万新生儿患先天性心脏病，其中中国每年新发病例数为15-20万，发病率约为1.11％，近年来呈平稳上升趋势。先天性心脏病指在胚胎发育时期由于心脏及大血管发育异常引起的解剖结构异常，或出生后应自动关闭的通道未能闭合的情形，其临床表现主要取决于畸形的大小和程度，主要症状有口唇、指甲青紫，杵状指，蹲踞症状，及经常性的感冒、反复呼吸道感染，听诊发现心脏有杂音，严重者可危及生命。先天性心脏病的病因主要取决于环境因素，孕妇妊娠时服用药物、感染病毒、环境污染、射线辐射及妊娠前三个月感染风疹病毒，都是先天性心脏病的危险因素。其中环境污染由于患者认识不足和检测技术的限制，是较容易被临床所忽视的重要病因。

20世纪生物科学技术的飞速发展，特别是基因组学对疾病本源进行了大量广泛的研究，然而，相对于投入的大量资金及人员，其研究结果对健康的影响并不明显，科学家们逐步意识到，对于大多数疾病而言，是受基因与环境等多种因素影响的，甚至认为基因对疾病的影响可能低于10％。暴露组学作为基因组学的补充，是指从妊娠开始贯穿整个人生的环境暴露(包括生活方式因素)。暴露源包括外源(污染、辐射、饮食等)和内源(炎症、感染、微生物等)以及社会暴露(社会能力、教育程度、精神压力、气侯等)。继全基因组关联研究(gwas)之后发展的全暴露组关联研究(ewas)的目的是对在未知方式下暴露的评估，ewas方法通过比较患者和健康受试者暴露组的分析结果，确定有效的生物标志物，进而利用这些生物标志物来阐明暴露-效应关系(生化流行病学)、暴露和人体动力学来源(暴露生物学)、以及作用机制(系统生物学)。环境暴露与健康之间的关系研究可从测定病例组和对照组外环境中的空气、水、食物内的污染物入手，检验两组间是否存在差异，进而通过对主要物质的摄入量、代谢等进行考量，估计暴露剂量，这称之为自下而上的方法(bottom-up)；另一种方法是从测量病例组和对照组血液或其他体液内的物质入手，检验各类物质与疾病之间的统计学联系，最终确定导致疾病的物质及其暴露来源，称之自上而下的方法(top-town)。“自下而上”和“自上而下”的方法在识别个体暴露上都具有科学价值，“自上而下”法用于揭示人类疾病的未知暴露源，而“自下而上”法是用于分析外暴露以及建立干预与预防的方法。生物标志物不仅可以用于研究外暴露，也可以用于研究内暴露。内暴露组学采用组学的方法进行研究，如基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学、转录组学、加合物组学等。暴露组学涉及多学科交叉(流行病学、生物统计学、生物信息学、分析化学等)，目前研究方向如发展更先进的分析技术(提高通量、降低样本量及费用等)、高效寻找合适的暴露标志物、混合暴露与疾病的关系、在群体水平找到与疾病相关的暴露因素、暴露组关联研究，等等。

暴露组研究的目的是阐明居住在不同环境下、具有各种疾病危险因素的多种族个体的暴露组，清晰地了解人类暴露的多样性和类型，研究成果对于明确环境污染与人体健康及特定疾病的因果关系，采取恰当的防控措施具有巨大的应用价值。生物标志物是改进暴露测量及效应、确定疾病易感性关系的阶梯，也是暴露组连接暴露、暴露-疾病效应的桥梁。理想的生物标志物应该能够准确测量并且有重复性、稳定性、特异性和敏感性，是能够表征暴露对机体产生影响的物质或效应。暴露组通过研发高通量筛选技术、确认早期暴露联系和剂量-效应关系，在大样本人群经历的外源和内源变化中描述暴露源，建立行为和病因关系的输入-响应机制，将非常有助于提高公共健康和职业健康干预的科技支撑能力。

环境暴露与健康关系研究中存在一些问题，比如，针对单一环境暴露因素研究(忽略混合暴露的存在及各个暴露间的联合作用)，环境暴露因素种类局限(集中在已知的和法规重点控制的暴露)，环境暴露采样时机与疾病的自然发生进程分离(较少考虑慢性病存在潜伏期)、环境暴露采样与检测不准确，等等。对暴露内部标志物的测定要与疾病发生的“时间窗”相对应，否则，研究结果将可能因为暴露和疾病发生时间上的先后关系不清而无法得出可靠结论。

重金属是一类重要的环境污染物，包括镉、铅、铬以及类金属砷等，日常生活中人们可能通过食物、水源、大气摄入，而超过一定水平的重金属暴露会对人体健康造成危害。国际癌症研究机构(iarc)将砷、镉归类为人类致癌物。研究表明暴露于砷(as)或镉(cd)均对心血管功能造成损害。通常情况下，环境毒物均呈混合暴露的状态，而砷或镉的混合暴露被证明可以通过胎盘屏障，具有胚胎发育毒性，增加先天性心脏病的发病率。因此，孕期砷、镉混合暴露可能是子代先天性心脏病的重要病因，应当在临床上引起更多关注和重视。由于不同化学物质间的相互作用比较复杂，根据化学物质毒性效应模式，一般有协同、加和及拮抗效应。有文献报导，砷和镉的毒性具有协同效应，砷和镉的混合暴露比砷、镉的单独暴露的危害要大。但是单独暴露均处于安全浓度的砷、镉，是否在混合暴露时能够导致相关疾病尚有待进一步研究，砷镉混合暴露是否可以作为先心辅助诊断的理想的生物标志物还没有明确的结论。

目前，环境监测中常见测定重金属的方法有紫外可见光光度法(uv)、石墨炉-火焰原子吸收法(aas)、原子荧光法(afs)、电感耦合等离子体质谱法，其中电感耦合等离子体质谱(icp-ms)是用于痕量多元素分析的质谱仪，较其余几种方法有其独特的优势，主要体现为灵敏度高、检出限低、选择性好、分析速度快、动态线性范围宽，可同时检测多种元素且能快速测定同位素比值，因而被广泛应用于混合暴露特别是多种重金属混合暴露的检测当中。近年来，icp-ms越来越多地被用于检测人类各类疾病的早期生物标志物，如心血管疾病，不良出生结局等，相关论文发表在学术期刊《environhealthperspect》、《epidemiology》，体现出其在人类疾病诊断中的巨大潜力与价值。icp-ms可进行定性和定量分析，定量分析有工作曲线法、内标法、同位素稀释法等等，icp-ms在检测中也不可避免地存在干扰，比如光谱干扰或基底效应，需要在实际工作中采取有针对性的措施进行抑制或降低，以提高分析准确性。目前采用icp-ms分析孕期全血中砷、镉混合暴露水平在先天性心脏病辅助诊断中的应用还未得到相应的关注。若能发现砷、镉混合暴露作为辅助诊断标志物与先天性心脏病的明确关联，并研发相应疾病的icp-ms检测方法，提高检测结果的准确性与灵敏度，不仅可以在该领域获得国际领先的研究成果，还能创造可观的经济价值，并且为促进和提高我国新生儿健康水平做出贡献。

技术实现要素：

本发明的目的是：

1.砷、镉混合暴露作为先天性心脏病辅助诊断标志物；

2.建立基于icp-ms的孕妇全血中砷、镉混合暴露的检测方法；

3.开发用于先天性心脏病辅助诊断的砷、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。

本发明的目的通过下列技术方案实现的：

与先天性心脏病相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为砷和镉的混合暴露。

用于检测上述暴露生物标志物的方法，该方法采用cp-ms检测孕妇全血中的砷和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的icp-ms检测孕妇全血中的砷和镉的浓度，使用的是内标与标准曲线混合的检测方法。

所述的检测方法，该检测方法包括以下具体步骤及参数为：

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时，泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态，调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

所述的暴露生物标志物在制备检测先天性心脏病的辅助诊断试剂盒中的应用。

一种用于检测先天性心脏病的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用icp-ms检测孕妇全血中的砷镉的浓度的试剂。

所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：

试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l锗+10μg/l铑，其余为去离子水)；

试剂b：砷标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。

(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的孕妇全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

纳入病例组孕妇100人，孕周为17-40周，产前诊断为具有确定的结构心脏缺陷的单胎胎儿；根据年龄、孕周匹配对照100人。

a组：健康对照组(100人，产前诊断胎儿无心脏缺陷)：

1.年龄在20-35岁

2.无先天性心脏病家族史

3.单胎

4.无高血压、糖尿病等慢性病史

5.无吸烟、饮酒史

b组：病例组(100人，产前诊断为具有确定的结构心脏缺陷)：

1.年龄在20-35岁

2.无先天性心脏病家族史

3.单胎

4.无高血压、糖尿病等慢性病史

5.无吸烟、饮酒史

二、icp-ms检测砷、镉混合暴露与先天性心脏病的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时，泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态，调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

3.数据处理：

使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、锗(ge)分别用于校正镉和砷的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。

5.健康对照组、病例组全血样本中砷、镉混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组砷和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，砷、镉高暴露显著提高了先天性心脏病发病风险。

三、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于先天性心脏病的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含一套全血砷、镉检测的试剂及耗材。

本发明的有益效果：

本发明人通过采用icp-ms比较正常对照和先天性心脏病病例母亲孕期全血中的砷、镉混合暴露水平，发现了孕妇全血中存在具有先天性心脏病辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用的和先天性心脏病辅助诊断试剂盒。

本发明采用孕妇全血中砷、镉混合暴露水平作为先天性心脏病评价的标志物的优越性在于：

(1)砷、镉混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高先天性心脏病辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为先天性心脏病的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的砷、镉混合暴露检测可用于先天性心脏病的辅助诊断，可在早期通过微创方式早期诊断先天性心脏病，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用先天性心脏病胎儿病例和健康对照孕母的全血样本进行验证，证明了先天性心脏病病例具有较高的砷、镉暴露水平，可作为标志物使用。

(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。

(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100μl全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。

(6)本发明采用icp-ms技术对砷、镉联合暴露进行检测的前处理步骤进行了优化，能够更好地减少检测的成本和时间。

附图说明

图1健康对照组和病例组的砷暴露水平。

箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。

图2健康对照组和病例组的镉暴露水平，图注参考图1。

图3卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，砷、镉高暴露显著增加了先天性心脏病发病率。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1研究对象选择和分组依据

本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的病例及正常对照孕妇的全血样本。无先天性心脏缺陷胎儿的孕妇为对照，产前诊断为确定的结构心脏缺陷为病例。纳入100例病例，根据年龄、孕周匹配对照孕妇100人，共200人作为先天性心脏病砷、镉混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：

第一阶段关联探索阶段

纳入病例孕妇100人，根据年龄、孕周匹配对照100人，共200人。

a组：健康对照组(100人，产前诊断无确定的结构心脏缺陷)：

1.年龄在20-35岁

2.无先天性心脏病家族史

3.单胎

4.无高血压、糖尿病等慢性病史

5.无吸烟、饮酒史

b组：病例组(100人，产前诊断为具有确定的结构心脏缺陷)：

1.年龄在20-35岁

2.无先天性心脏病家族史

3.单胎

4.无高血压、糖尿病等慢性病史

5.无吸烟、饮酒史

实施例2：icp-ms检测砷、镉混合暴露与先天性心脏病风险的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

a.icp-ms点火启动后，稳定约半小时，泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，ba、bi、ce、co、ln、li、u，每种浓度1μg/l，基质为2.5％hno3、0.5％hcl)，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态，调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

其他步骤详见厂商说明书。

进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

3.数据处理：

使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑(rh)、锗(ge)分别用于校正镉和砷的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。

5.健康对照组、病例组全血样本中砷、镉混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组砷和镉暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异(结果见图1、图2、图3)，病例组高暴露人数与对照组高暴露人数具体比例为砷高暴露2.27:1，镉高暴露：2.00:1，砷、镉均高暴露3.67:1，病例组的高暴露人数多于对照组，显著提高了先天性心脏病发病风险。

实施例3：用于检测孕妇全血砷、镉混合暴露辅助诊断先天性心脏病的试剂盒制作

首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的砷、镉浓度，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，砷、镉高暴露显著提高了先天性心脏病发病风险。检测砷、镉混合暴露可以用于先天性心脏病的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中砷、镉检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，砷和镉标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液用于容器清洗和空白对照。此试剂盒的价值在于只需要100μl孕妇全血，即可同时检测全血中的砷、镉含量，再通过分析结果与参考值的比较用于辅助诊断先天性心脏病，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成如下：

试剂a：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/l锗+10μg/l铑，其余为去离子水)；

试剂b：砷标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/l；

试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。

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