一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法与流程

本发明涉及食品领域，尤其涉及一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法。

背景技术：

苯甲酸、山梨酸钾是允许使用的食品防腐剂，安赛蜜和糖精钠是食品中的主要甜味剂，这四类添加剂被广泛用于食品行业中，在一定限量范围内食用对人体没有危害，但过量添加会对人体健康带来一定危害。gb2760-2014规定苯甲酸在乳饮料中的限量为1.0g/kg，山梨酸为0.5g/kg，安赛蜜为0.3g/kg，糖精钠在乳饮料中不得添加。近几年国家食品药品局抽检食品中添加剂使用情况，经常有发现过量添加和超范围使用的情况。

烟酰胺俗名vb3，又名尼克酰胺，化学名为3-吡啶甲酰胺，为白色针状结晶或粉末。烟酰胺属于b族维生素，被命名为抗糙皮病维生素，主要存在于肾、肝、肌肉、乳汁、蛋黄、花生和水果中。烟酰胺常作为营养强化剂添加在乳饮料中，在乳饮料中的添加量有一定要求。

含乳饮料是指以乳或乳制品为原料，经发酵或不发酵，加入水以及白砂糖和(或)甜味剂、酸味剂、果汁、茶、咖啡、植物提取物等的一种或几种调制而成的饮料。

现行国家标准《gb5009.28-2016食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》、《gb5009.89-2016食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》和《gb/t5009.140-2003饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》分别规定了食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、烟酰胺和饮料中安赛蜜的检测方法，但无专门针对乳饮料的检测方法或前处理方法不适用于乳饮料。针对乳饮料这类高蛋白且基质复杂的样品，国标前处理方法并不适用，也鲜有相关方法报道。鉴于国家对饮料中添加剂使用量要求和食品标签强制性标准的施行，为了缩短检测周期，提高工作效率，需要建立一种乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺同时检测的方法。

中国专利申请公开号为cn106706800a的专利，公开了一种苯甲酸、山梨酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾的快速检测方法。该方法利用高效液相色谱进行检测，流动相为甲醇+0.02mol/l乙酸铵＝(10～15)+(85～90)，同时测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾的含量。但是，利用该专利提供的方法测定乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量时，色谱图中烟酰胺和苯甲酸的峰存在很大部分的重叠，无法准确的确定烟酰胺和苯甲酸的峰面积。要测定乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量需要多次测试。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法。针对乳饮料这种复杂基质的样品，该方法填补了国标无专门针对乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺前处理检测方法的情况，同时样品处理简单快速，可实现多种添加剂和营养强化剂的同时检测，大幅度缩短检测时间，提高了检测效率。

本发明的具体技术方案为：一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：向乳饮料中加入氢氧化钠溶液，超声；用硫酸溶液调节ph，然后，加入沉淀剂，摇匀，静置；用甲醇定容，离心，过滤，得滤液；

(2)检测分析：用液相色谱对滤液进行检测分析，得到滤液的液相色谱图，将检测到的峰面积与标准曲线比较，计算得到滤液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量，换算得到乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。

现有技术中，利用液相色谱检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量时，一般需采用多次前处理和多次液相色谱检测才能获得多种添加剂和营养强化剂的含量。乳饮料中除含高蛋白和脂肪外，还有稳定剂和添加剂，基质干扰较难去除。采用国标的方法处理后，样品仍然呈乳白色浑浊状态，无法上机检测。虽然，目前也有方法能同时获得多种添加剂的含量，然而利用现有技术的方法对乳饮料中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺进行测试时，存在前处理后依然无法满足上机要求、色谱图中存在杂峰及目标峰之间存在干扰等问题，无法同时准确的检测出乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。中国专利申请公开号为cn106706800a的专利公开的方法虽然能同时测得食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的含量，但其不涉及干扰性极强的烟酰胺的含量的测定，对本发明的参照性不强。

乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的同时测定需要选择合适的前处理方法，以达到以下两个效果：1)样品基质完全去除，处理后样品澄清透明，且上机检测无严重干扰峰。2)选用的前处理试剂能有效提取样品中的被测物，保证回收率、重现性的指标能符合标准要求。发明人经过大量的实验发现，利用氢氧化钠溶液使蛋白质变性，由于乳饮料中含有蛋白保护剂，单纯使用氢氧化钠溶液无法完全沉淀蛋白质，使用乙酸锌-亚铁氰化钾沉淀能够有效除去乳饮料中的蛋白质和脂肪。利用甲醇定容，能够去除乳饮料中剩余的蛋白质和脂肪。超声作用能够保证被测物的充分提取。利用本发明的前处理方法能够充分沉淀乳饮料中被保护的蛋白质、脂肪等物质，而被测物保留在上清液中，保证被测物质的提取效率符合要求，且得到的上清液澄清，色谱干扰小，从而较大程度提高了检测结果的准确性、精密度及稳定性。利用该前处理方法处理乳饮料，乳饮料中的复杂基质去除干净，5种目标物质提取效率符合要求，目标峰的回收率和重现性较好。

另外，国标中测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量需要用3个方法检测，所用的色谱条件均不同，要达到以上5类物质的同时检测，需优化色谱条件，达到以下效果：1)5个目标峰的基线分离，峰形对称，符合要求；2)样品中目标峰无干扰，能做到准确定量。利用现有技术中的流动相进行液相色谱检测，苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的峰之间存在干扰，同时，进样中的其他添加剂也会对目标峰存在一定程度的干扰，使得目标峰存在拖尾或难以分开，进而造成无法同时获得苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的目标峰或测试结果存在较大误差。

本发明人经过大量的实验发现利用醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈的混合溶液作为流动相时，能够同时测得乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。利用本发明的流动相，目标峰苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺之间互不干扰，乳饮料中的其他组分也不会对目标峰产生干扰，目标峰无拖尾或峰宽异常的现象出现。

作为优选，步骤(1)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1～0.3mol/l，乳饮料与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g:1～1.25ml。氢氧化钠使乳饮料中的蛋白质变性。所述硫酸溶液浓度为0.3～0.6mol/l，用硫酸调节乳饮料的ph为7.0～9.0。

作为优选，步骤(1)中，所述沉淀剂为乙酸锌-亚铁氰化钾，乙酸锌溶液的浓度为200～250g/l，乙酸锌溶液与乳饮品的体积质量比为1～3ml/10g；亚铁氰化钾溶液的浓度为100～150g/l，亚铁氰化钾溶液与乳饮品的体积质量比为1～3ml/10g。乙酸锌和亚铁氰化钾生成的氰亚铁酸锌沉淀能够除去乳饮料中剩余的蛋白质。作为优选，亚铁氰化钾溶液的浓度为100～110g/l。

当乙酸锌溶液的浓度为200～250g/l，乙酸锌溶液与乳饮品的体积质量比为1～3ml/10g；亚铁氰化钾溶液的浓度为100～110g/l，亚铁氰化钾溶液与乳饮品的体积质量比为1～3ml/10g时，乳饮料中蛋白质和脂肪等的去除效果最好，当二者的浓度和加入量偏离本发明范围时，前处理后得到的上清液较浑浊，用滤膜过滤后，经液相色谱测得的谱图中的目标峰存在杂峰的干扰，且背景干扰会比正常偏高，无法同时精准的检测出乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。因此，乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液的浓度和加入量偏离本发明范围一点点也会对检测结果产生很大的差异，必须采用本发明限定的范围。

作为优选，步骤(1)中，所述超声时间为15～20min；离心转速为8000～10000r/min，离心10～20min；离心后的上清液用0.45μm的滤膜过滤。超声充分提取被测物物质。离心将蛋白质和脂肪分离出去，用0.45μm的滤膜过滤除去上清液中的大分子物质和悬浮颗粒，避免大分子的物质和悬浮颗粒堵塞色谱柱，影响测试结果。

作为优选，步骤(2)中，所述液相色谱为高效液相色谱，液相色谱仪采用waters2695，dad检测器，色谱柱采用c18柱，柱温为30～35℃；流动相为浓度15～25mmol/l的醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈以体积比为92～96:3～7:1组成的混合溶液，等度洗脱；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；单次进样量为10ul；检测波长：安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠均为230nm，烟酰胺为261nm。

作为优选，所述色谱柱型号为zorbaxeclipsexdb-c18：4.6mm×250mm，5μm；醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈的体积比为93～95:4～6:1，醋酸铵缓冲盐的浓度为18～22mmol/l。

利用浓度为18～22mmol/l的醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈以体积比为93～95:4～6:1组成的混合溶液作为流动相时，能够同时测得乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。在本发明的流动相中，苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的溶解度的差别相对较大，五种物质与乳饮料中的其他干扰物质的溶解度也存在较大的差异，五种物质随流动相通过色谱柱的时间差相对较长，得到的色谱图中的目标峰之间互不干扰，乳饮料中的其他干扰物质的峰也不会干扰目标峰。利用本发明的流动相，目标峰苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺之间互不干扰，乳饮料中的其他组分也不会对目标峰产生干扰，目标峰无拖尾或峰宽异常的现象出现。以本发明的检测条件，可以同时准确检测出安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺的含量，目标峰之间互不干扰，乳饮料中的其他物质与目标峰也不存在干扰。当醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈的体积比超出93～95:4～6:1时，目标峰存在部分重叠，导致测得的液相色谱图中烟酰胺和苯甲酸的峰存在重叠，且目标峰的宽度增加，测得的结果存在误差。因此，醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈的体积比偏离本发明范围一点点也会对检测结果产生很大的差异，必须采用本发明限定的范围。

作为优选，步骤(2)中，所述标准曲线的制作方法为：配制不同浓度的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺标准溶液，按照步骤(2)分析滤液的方法用液相色谱仪进行检测，得到标准溶液的液相色谱图；分别以标准溶液的液相色谱图中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，制作得到标准曲线。

作为优选，所述标准溶液的配制方法为：称取安赛蜜、苯甲酸、烟酰胺、山梨酸、糖精钠标准品0.100g，置于100ml棕色容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀，得储备液。然后，分别精确移取储备液100ul、200ul、400ul、600ul、800ul、1000ul于100ml容量瓶中，用水定容，摇匀，即得标准溶液。

配制不同浓度的标准液，确保检测的乳饮料中待测的添加剂和营养强化剂的含量在标准曲线的范围之内。

作为优选，步骤(2)中，所述苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量的计算方法为：将测得的任一组分的峰面积带入公式xi＝100×ci×v×ai/(asi×1000×mi)，计算得出该组分的含量；其中，xi为试样中组分i的含量，单位为毫克每百克；ai为试样中组分i的峰面积；asi为组分i标准工作液的峰面积；ci为组分i标准工作液浓度，单位为微克每毫升；v为试样的定容体积，单位为毫升；mi为组分i的质量，单位为克。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、针对乳饮料这种复杂基质的样品，填补了国标无专门针对乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺前处理检测方法的情况。

2、本发明检测方法样品处理流程简化，样品处理简单快速，可实现苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的同时检测，大幅度缩短检测时间，提高检测效率。

3、通过对本发明检测方法进行线性、精密度、重复性、检出限、定量限、回收率试验，均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明本发明方法科学有效。

附图说明

图1为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的混标的标准品的色谱图；

图2为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的实施例1中乳饮料样品1检测波长为230nm时的色谱图；

图3为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的实施例1中乳饮料样品1检测波长为261nm时的色谱图；

图4为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的对比例1中乳饮料样品3检测波长为230nm时的色谱图；

图5为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的对比例2中乳饮料样品3检测波长为230nm时的色谱图；

图6为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的混标的标准品溶液重复测定6次得到的检测波长为230nm时的色谱图；

图7为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的混标的标准品溶液重复测定6次得到的检测波长为261nm时色谱图；

图8为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的乳饮料重复测定6次得到的检测波长为230nm时的色谱图；

图9为本发明的一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法的乳饮料重复测定6次得到的检测波长为261nm时色谱图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。在本发明中所涉及的装置、连接结构和方法，若无特指，均为本领域公知的装置、连接结构和方法。

色谱条件的建立：液相色谱仪采用waters2695，dad检测器，色谱柱采用zorbaxeclipsexdb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35℃；流动相为浓度20mmol/l的醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈以体积比为94:5:1组成的混合溶液，流动相的流速为1.0ml/min，进样量为10ul。检测波长：安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠均为230nm，烟酰胺为261nm。

标准曲线的制作：精密称取安赛蜜、苯甲酸、烟酰胺、山梨酸、糖精钠标准品0.100g，置于100ml棕色容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀。然后，分别精确移取储备液100ul、200ul、400ul、600ul、800ul、1000ul于100ml容量瓶中，用水定容，摇匀，即得标准溶液。用液相色谱仪对标准溶液进行检测，得到标准溶液的液相色谱图。分别以标准溶液的液相色谱图中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，制作得到标准曲线。

所用试剂氢氧化钠、乙酸锌、亚铁氰化钾均为分析纯，甲醇为色谱纯，苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品的纯度为99％，出自中国计量科学研究院，安赛蜜、烟酰胺标准品的纯度为99％，出自sigma-aldrich。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量的计算方法为：将测得的任一组分的峰面积带入公式xi＝100×ci×v×ai/(asi×1000×mi)，计算得出该组分的含量；其中，xi为试样中组分i的含量，单位为毫克每百克；ai为试样中组分i的峰面积；asi为组分i标准工作液的峰面积；ci为组分i标准溶液浓度，单位为微克每毫升；v为试样的定容体积，单位为毫升；mi为组分i的质量，单位为克。

实施例1

一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：将20.1561g乳饮料样品1加入100ml容量瓶中，加入25ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液，超声15min；用浓度为0.5mol/l的硫酸溶液调节ph为8.0，然后，加入2ml浓度为220g/l的乙酸锌溶液和2ml浓度为106g/l的亚铁氰化钾溶液，摇匀，静置15min；用甲醇定容，在转速为8000r/min条件下离心12min，离心后的上清液用0.45μm的滤膜过滤，得滤液。

(2)检测分析：用高效液相色谱对滤液进行检测分析，得到滤液的液相色谱图，将检测到的峰面积与标准曲线比较，计算得到滤液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量，换算得到乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于：将20.1029g乳饮料样品2加入100ml容量瓶中，前处理后通过液相色谱测定其中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。其他均与实施例1相同。

对比例1

一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：将20.0061g乳饮料样品3加入100ml容量瓶中，加入25ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液，超声15min；用浓度为0.5mol/l的硫酸溶液调节ph为8.0，然后，加入2ml浓度为220g/l的乙酸锌溶液和2ml浓度为106g/l的亚铁氰化钾溶液，摇匀，静置15min；用甲醇定容，在转速为8000r/min条件下离心12min，离心后的上清液用0.45μm的滤膜过滤，得滤液。

(2)检测分析：用高效液相色谱对滤液进行检测分析，得到滤液的液相色谱图，将检测到的峰面积与标准曲线比较，计算得到滤液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量，换算得到乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。其中，流动相为浓度20mmol/l的醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈以体积比为95:3:2组成的混合溶液。

对比例2

一种同时测乳饮料中多种食品添加剂和营养强化剂的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：将20.0072g乳饮料样品3加入100ml容量瓶中，加入25ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液，超声15min；用浓度为0.5mol/l的硫酸溶液调节ph为8.0，然后，加入2ml浓度为220g/l的乙酸锌溶液和2ml浓度为106g/l的亚铁氰化钾溶液，摇匀，静置15min；用甲醇定容，在转速为8000r/min条件下离心12min，离心后的上清液用0.45μm的滤膜过滤，得滤液。

(2)检测分析：用高效液相色谱对滤液进行检测分析，得到滤液的液相色谱图，将检测到的峰面积与标准曲线比较，计算得到滤液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量，换算得到乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜和烟酰胺的含量。其中，流动相为浓度20mmol/l的醋酸铵缓冲盐、甲醇和乙腈以体积比为93:5:2组成的混合溶液。

实施例1和实施例2的乳饮料样品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、烟酰胺含量检测结果见表1。实施例1中样品1的检测波长为230nm时的液相色谱图如附图2所示，检测波长为261nm时的液相色谱图如附图3所示；对比例1中样品3的液相色谱图如附图4所示；对比例2中样品3的液相色谱图如附图5所示。

表1

试验结果：采用本实施例检测方法测定的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、烟酰胺浓度与预期相近，表明本发明检测方法能够准确乳饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、烟酰胺的含量。

本发明通过线性范围的确认、精密度实验、重复性实验和回收率实验对本发明提出的检测方法进行验证，具体验证步骤及验证结果如下：

(1)线性范围确认

试验数据(色谱图见附图1)

表2安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺的线性关系试验数据

线性评价：五种目标组分的相关系数r²均达到0.999，所以用该方法在浓度1mg/l至100mg/l之间呈现良好的线性，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求。

(2)精密度试验

试验方法：将混标的标准品溶液按上述色谱条件重复测定6次，计算其峰响应rsd％。

实验数据(色谱图见图6和图7)

表3安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺的精密度试验数据

试验结论：安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺重复测定6次峰面积的rsd(％)分别为0.9％、0.5％、0.7％、0.8％和1.3％，表明该方法有较好的精密度。

(3)重复性试验

试验方法：称取6份样品按上述的试样制备方法及色谱条件重复测定6次，计算其峰响应rsd％。

试验数据(色谱图见图8和图9)：

表4各组分重复性测试数据

试验结论：6份样品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺含量的rsd％分别为0.5％、1.2％、1.5％、1.9％和0.8％。表明该方法有较好的重复性，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求。

(4)回收率试验

试验方法：

加标：准确称量20g样品9份(安赛蜜含量：114.42mg/kg，苯甲酸含量9.34mg/kg，山梨酸含量8.00mg/kg，糖精钠含量7.07mg/kg，烟酰胺含量9.66mg/kg。)，三梯度加标后，按照上述方法检测。

实验数据如下

表5各组分加标回收率测试数据

回收率(％)＝(测得加入量/理论加入量)×100％

试验结论：各目标组分的平均回收率均在90～110％范围内，rsd小于5％，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求。

结论：通过对安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和烟酰胺含量测定方法进行线性、精密度、重复性和回收率试验，均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明该测定方法科学有效。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。